Methodenartikel

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

DOI:

10.3791/55999

⸱

12 november 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysics of the Czech Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lokale microirradiation met lasers vertegenwoordigt een nuttig instrument voor het onderzoek van DNA-reparatie-gerelateerde processen in levende cellen. Hier beschrijven we een methodologische aanpak bij de analyse van eiwit kinetiek op DNA laesies over tijd of eiwit-eiwit interacties op lokaal microirradiated chromatine. Ook laten we zien hoe te herkennen van de afzonderlijke fasen van de celcyclus met behulp van de Fucci cellulaire systeem te bestuderen van cel-cyclus-afhankelijk proteïne kinetiek op DNA laesies. Een methodologische beschrijving van het gebruik van twee UV lasers (355 nm en 405 nm) voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging wordt ook gepresenteerd. Alleen de microirradiated van de cellen door de 405-nm diodelaser mitose normaal doorlopen en waren verstoken cyclobutaan pyrimidine-Dimeren (CPDs). Ook laten we zien hoe de microirradiated cellen kunnen worden opgelost op een bepaald tijdstip uit te voeren immunodetection van de endogene proteïnen van belang. Voor de DNA-reparatie studies, beschrijven we bovendien het gebruik van Biofysische methoden waaronder FRAP (fluorescentie herstel na Photobleaching) en FLIM (fluorescentie levensduur Imaging microscopie) in cellen met spontaan voorkomende DNA schade foci. We tonen ook een toepassing van de FLIM-FRET (fluorescentie Resonance Energy Transfer) in experimentele studies van eiwit-eiwitinteractie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-schade leidt tot de verschijning van DNA laesies bestaande uit cyclobutaan pyrimidine Dimeren (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, en één-strand of dubbel-strand breekt1,2. Γ-straling zijn de vorm van ioniserende straling met de hoogste energie- en hoge doordringendheid, aldus deze bron van straling wordt wijd gebruikt in de radiotherapie3. Aan de andere kant, geïnduceerde experimenteel DNA-schade veroorzaakt door UV lasers nabootsers natuurlijke blootstelling aan UV-licht. UVA-microirradiation, vertegenwoordigt als een microscopische methode, een experimentele gereedschap voor de studie van DNA-beschadiging in individuele levende cellen. Microirradiation werd gebruikt voor de eerste maal 40 jaar geleden om te onthullen van de organisatie van chromosoom regio's4,5. Deze techniek is sterk afhankelijk van of de functionele eigenschappen van de confocal microscopen of de technische grenzen van moderne nanoscopy. Om DNA laesies, kunnen cellen worden presensitized door 5' bromodeoxyuridine (BrdU) of Hoechst 33342 voorafgaand aan UV bestraling. Bártová et al. 6 de presensitization stap voor het eerder beschreven, en onlangs we deze techniek microirradiation geoptimaliseerd teneinde celdood of apoptosis. Bijvoorbeeld leidt het gebruik van een laser UV 405-nm (zonder Hoechst 33342 presensitization) tot de inductie van 53BP1-positieve dubbel-strand einden (DSBs) ten koste van cyclobutaan pyrimidine-Dimeren (CPDs). Aan de andere kant, induceren presensitization stappen gecombineerd met UV microirradiation zeer hoge niveaus van de CPDs en DSBs tegelijk7,8. Deze methode is moeilijk toe te passen op de studie van een enkele DNA-reparatie-traject.

Met microirradiation is het mogelijk om te analyseren eiwit werving, kinetiek en interactie op DNA laesies in levende cellen. Een voorbeeld van deze methode werd gepubliceerd door Luijsterburg et al. 9 voor heterochromatin eiwit 1β, en we onlangs toonde voor de eerste keer dat de pluripotent factor Oct4 en een eiwit gekoppeld Cajal organen, coilin, worden gerekruteerd voor UV-geïnduceerde DNA laesies6,10. Eiwit kinetiek op deze DNA-letsels kunnen ook worden bestudeerd met behulp van de FRAP (fluorescentie herstel na Photobleaching)11,12,13 of FRET (fluorescentie Resonance Energy Transfer) technieken14 ,15. Deze methoden hebben het potentieel om te onthullen van eenvoudige verspreiding van eiwitten bij laesies van DNA of eiwit-eiwitinteractie. Een nuttig instrument voor extra karakterisatie van eiwitten is FLIM (fluorescentie levensduur Imaging microscopie) of de combinatie met FRET technologie (FRET-FLIM)16. Deze methoden kunnen de studie van de processen in levende cellen die stabiel of Transient uitdrukken van de proteïne van belang gelabeld door een fluorescerende molecuul17. Hier is een voorbeeld van exponentiële afname tijd (τ) voor GFP-gelabeld p53 proteïne en haar interactie partner, mCherry-tagged 53BP1, spelen een belangrijke rol in DNA schade antwoord18,19 weergegeven. De parameter τ, is de levensduur van de fluorescerende geboden door FLIM berekeningen, specifiek voor een bepaalde fluorescentie kleurstof, zijn bindende capaciteiten en zijn cellulaire omgeving. Dus, deze methode kan tonen ons onderscheid tussen eiwit subpopulaties, hun bindende capaciteiten en hun functionele eigenschappen na, bijvoorbeeld DNA-schade.

Hier een overzicht van de methodologische benaderingen van de geavanceerde microscopie technieken die wordt gebruikt in ons laboratorium voor tijd-specifieke eiwitten werving, kinetiek, verspreiding en eiwit-eiwitinteractie op de site van microirradiated chromatin studie wordt gepresenteerd. De stapsgewijze methode voor de inductie van lokale DNA laesies in levende cellen, en een beschrijving van de methoden die nuttig zijn voor onderzoek naar DNA-schade-gerelateerde evenementen op lokaal geïnduceerde DNA-beschadigingen veroorzaakt door UV lasers zijn beschikbaar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. teelt van cellijnen

  1. HeLa-afgeleide cellijnen
    Opmerking: gebruik HeLa cellen van de cervicale carcinoom: beide HeLa cellen stabiel uiten Histon H2B gelabeld met GFP of HeLa-Fucci cellen uiten van RFP-Cdt1 in de G1 en vroege S fasen GFP-geminin in de S/G2-M fasen ( Figuur 1).
    1. Voor de teelt van alle HeLa-afgeleide cellijnen, gebruiken Dulbecco ' s bewerkt Eagle ' s medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum en passende antibiotica bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO 2. Het medium 2 - 3 keer per week vervangen.
    2. Verwijder kweekmedium en spoel de cellen met behulp van 1 x PBS te elimineren alle sporen van serum dat trypsine-remmer bevat. Voer deze stap uit in een biohazard kap bij kamertemperatuur.
    3. Voeg 1 mL trypsine-EDTA-oplossing met voorverwarmde ter dekking van de cellaag en houden cellen bij 37 ° C. Trypsinize cellen tot cellaag is verspreid (meestal 3-5 min).
    4. Voeg 3 mL voorverwarmde volledige groeimedium voor inactivering van trypsine-EDTA, en verspreiden van het medium door zachtjes pipetteren meermaals.
      Opmerking: Deze procedure moet worden uitgevoerd in een biohazard kap ter bescherming van de exploitant van verontreinigingen en optimale cel teelt voorwaarden te handhaven.
    5. Cellen tellen met behulp van een automatische cel teller of een Bürker cupje. Verdun celsuspensie 1 × 10 5 cellen/mL en Pipetteer 5 mL in een nieuwe schotel. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2.
  2. Teelt van muis embryonale stamcellen (mESCs), D3 cellijn
    1. cultuur mESCs op cel cultuur gerechten bekleed met 0,2% gelatine en mESC onderhoud medium. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2.
      Opmerking: Het medium verbouw/onderhoud mESCs in 50 mL aliquots bereiden en op te slaan bij 2-8 ° C voor maximaal 2 weken wordt aanbevolen. Het medium mESC bevat 75 mL ES cel FBS, 5 mL penicilline G en streptomycine, 5 mL niet-essentiële aminozuren (10 mM) (eindconcentratie 0.1 mM), 50 µL muis leukemie remmer Factor (mLIF; 100 µg/mL) (eindconcentratie 10 ng/mL), 430 µL MTG (1- Thioglycerol; de verdunning van het 1:100 in DMEM) (eindconcentratie 100 µM) en hoog glucose DMEM medium tot 500 mL.
    2. Gecombineerd de mESC teelt medium uit de cultuur-schotel en spoel de cellen een keer met 1 x PBS.
    3. Voeg 0,5 mL trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C enkel tot de cellen beginnen met het loskoppelen van de schotel. Vervolgens de inactivering van de trypsine door het wassen van de cellen met 2 mL mESC teelt voedingsbodem aangevuld met 15% foetale runderserum.
    4. Gebruiken een pipet te verjagen van de resterende cellen uit de cultuur-schotel.
      Opmerking: Het is belangrijk te verkrijgen van de afzonderlijke cellen, omdat differentiatie van de cellen van de bevordering van de cel bosjes.
    5. Split cellen 1:10 op gelatinized gerechten met mESC onderhoud medium.
      Opmerking: Als de dichtheid van mESC cellen te laag is, ze groeien niet goed; Als de dichtheid te hoog is, differentiatie is gepromoveerd.
    6. Zorg ervoor dat mESCs worden bijgehouden in een ongedifferentieerde staat door het uitvoeren van mESC passage elke tweede dag door te splitsen van cellen uit één petrischaaltje in vier nieuwe gerechten. Inspecteer de mESC kolonies met een omgekeerde Microscoop onder 100 X of 200 X vergroting en, als er sprake van spontane mES celdifferentiatie is, uit te voeren westelijke vlekken om te beoordelen van Oct4 eiwit uitputting.
      Opmerking: Met de optimale cel passaging, spontane differentiatie van mESCs in vitro kan worden verminderd.

2. Cel transfectie

  1. zaad cellen 48u vóór experimenten op gerasterde microscopie gerechten (diameter 35 mm) om te vinden van microirradiated cellen volgens hun coördinaten op de petrischaal.
    Opmerking: Dit is een voorbeeld die in welke microirradiation de eerste experimentele stap is en immunokleuring is de tweede ( figuur 2A).
    1. Voor het zaaien, gebruik een concentratie van 5 × 10 4 cellen/mL voor HeLa-afgeleide cellijnen (of 1 × 10 4 cellen/mL voor D3 mES cellen). Uitputten op de volledige gemiddeld 2 mL per schotel. Tijdens de teelt en microirradiation, het handhaven van cellen in een thermostaat of teelt ruimte bij 37 ° C en 5% CO 2.
    2. Cellen tellen met behulp van een automatische cel counter.
      Opmerking: Gebruik geen een hogere concentratie van cellen. Vooral in het geval van dichtbevolkte verpakt kolonies van D3 mESCs, voorkomt hoge celdichtheid eenidentificatie van lokaal microirradiated cellen na immunokleuring.
  2. Bereiden plasmide DNA en transfectie reagens van keuze als volgt. Bereiden van oplossing A met 2-3 µg voor geselecteerde plasmide DNA (Zie de Tabel van materialen voor details) en 150 µL 1 x PBS. Oplossing B 3,5 µL transfectiereagens met 150 µL 1 × PBS voor te bereiden. Ervoor zorgen dat elke oplossing is goed vermengd zijn door zorgvuldige pipetteren.
    Opmerking: De optimale verhouding van DNA en transfectie reagens moet worden empirisch bepaald voor elke cellijn en individuele plasmide.
  3. Op 24 h vóór experimentele observatie van Transient transfected levende cellen, combineren oplossing A en B oplossing zonder vortexing. Incubeer de gecombineerde oplossingen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten. Op een dropwise manier, homogeen verspreiden dit voltooien transfectie mengsel (300 µL, als beschreven in punt 2.2) op de cellaag die groeien in de schotel microscopie.
    4. Het mengsel van de transfectie vervangen
  4. Incubate cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 4-6 h, dan met verse medium. Cultiveren van cellen onder standaardomstandigheden.
    Opmerking: Bij gebruik van een laser van 405 nm, doen de cellen met een reagens niet presensitize, maar bij het gebruik van een laser 355-nm, uitvoeren cel presensitization met 10 µM 5-bromo-2 ' - deoxy - uridine (BrdU) 7 , 8 . Presensitization tijd is afhankelijk van het celtype en de lengte van de celcyclus. HeLa cellen toevoegen BrdU 16 tot 20 h voor lokale microirradiation. In het geval van mESCs, toevoegen BrdU 6 tot en met 8 h vóór microirradiation.

3. Inductie van lokale DNA laesies en confocale microscopie

  1. zet de schotel op het podium van de Microscoop en vastleggen van de positie van de geselecteerde cellen op de schotel; de celcoördinaten nodig zal zijn voor verdere analyse ( figuur 2A a-c).
  2. Vinden transfected cel(len) in een vierkant aangeduid met een cijfer of letter ( figuur 2A-d-f, pijlen in Ad Toon de locatie van de cel vergroot in panelen Ae en Af). Verkrijgen van een beeld van de cel(len) met heldere veld microscopie en een beeld van de fluorescentie te verwerven teneinde de positie van zowel de cel(len) als het gelabelde plein ( figuur 2A).
  3. Voor image aquisition voor bestraling, gebruik een wit-light laser (WLL) (470-670 nm in stappen van 1-nm) verbonden met de confocal microscoop (of een andere beschikbare laser verbonden aan de confocal Microscoop).
  4. De volgende instellingen gebruiken: 512 × 512-pixel resolutie, pixel maat 64 nm, 400 Hz, bidirectionele modus (scannen in twee richtingen), lijn gemiddelde ingesteld op 8, 8 x zoom tot 12 x.
    Opmerking: De gemiddelde lijn vertegenwoordigt een gegeven aantal scans; dezelfde regel is meerdere keren gescand voordat u doorgaat naar de volgende regel. Herhaalde scans van alle lijnen produceren het laatste frame van de afbeelding.
  5. Voor afbeelding waarneming en overname, gebruik een 63 × olie doelstelling met een numerieke opening van 1.4 en fluorescentie afbeeldingen opeenvolgend te verwerven. Elimineren van cross-talk tussen de twee fluorochromes door gebruik te maken van de juiste software de sequentiële scanmodus.
    Opmerking: Alle Microscoop software kunnen de instelling van een zogenaamde sequentiële scanmodus. De operator kan kiezen of te verwerven van de fluorochromes ' informatie gelijktijdig (bijvoorbeeld in rood-groen-blauw fluorescentie) of, zoals hier, individueel (sequentieel), fluorescerende door fluorescerende. Rekening houden met de algemene informatie die de maximale excitatie/emissie voor GFP 395/509 is nm en de maximale excitatie/emissie voor mCherry is 587/610 nm (Zie fluorochromes hier gebruikt in figuur 2B). Op basis van deze informatie, selecteer geschikt excitatie en emissie filters voor het gewenste fluorochromes. Selectiefilter en scannen van procedures moeten worden geoptimaliseerd voor elke confocal microscoop.
  6. Voor inductie van DNA laesies, gebruik 64 lijn scanmodus, schakel de WLL (in ' overname ' modus), overschakelen op de externe UV-bron (op " UV-laser " knop), de regio van belang (ROI) instellen (in ' overname ' modus), en stel de 355-nm Laser tot 100% macht of, alternatief, gebruiken een 405-nm laserbron.
    Opmerking: In het algemeen laser macht wordt afgesteld door de juiste laser aanpassing knop in beeld overname modus.
  7. Voor lokale microirradiation, gebruik van lasers die in het in de omgeving van UVA-spectrum uitstoten. Voor microirradiation van ROI in de kern en voor vastleginstallatiekopie, stel de achtergrond op nul in beeld overname modus te reguleren laser intensiteit buiten de ROI; Als de cel naar behoren wordt bestraald, het signaal van GFP-Histon H2B verdwijnt, en, bijvoorbeeld, mCherry-gelabeld PCNA eiwit zal worden gerekruteerd om DNA laesies onmiddellijk na bestraling ( figuur 2B en Video 1 ).
    Opmerking: Een DNA-schade veroorzaakte in de ROI van een confocal sectie wordt ook in driedimensionale (3D) projectie (Zie 3D-rotatie en x-y, x-z, y-z-projecties in figuur 2C en Video 2 weergegeven). Zie voor beschrijvingen van de volledige technische parameters voor 355-nm en 405-nm lasers, Stixová et al. 7
  8. na de ROI is bestraald, schakelt u de externe UV-bron uitschakelen van de ROI, zet de WLL, Wijzig regel scannen naar 8 en vinden van een andere cel voor bestraling. Voor ROI selectie, gebruikt u de desbetreffende knop in de software ' modus van de acquisitie van s beeld.
    Opmerking: mCherry-PCNA heeft een maximum accumulatie piek op DNA laesies tussen 2 en 20 min ( figuur 2B). Om te controleren of het resultaat op de exogene eiwitniveaus, gaat u verder met immunofluorescentie kleuring onmiddellijk na lokale microirradiation. Selecteer het tijdsinterval bestraling volgens belang.
  9. Verifiëren dat een opeenstapeling van exogene eiwitten kan worden opgespoord in de meerderheid van de microirradiated cellen. Voor deze verificatie, gebruikt u de criteria in de volgende stappen.
    1. Selectievakje dat er geen overexpressie van exogene eiwit in Transient transfected cellen is. Als een mogelijke oplossing, kies cellen met alleen een zwakke uitdrukking van fluorescente proteïne (b.v., mCherry-PCNA of mCherry-53BP1).
    2. Beoordelen de fototoxiciteit van de blootstelling van de WLL gebruikt voor Beeldacquisitie.
      Opmerking: Voor fototoxiciteitstests, transfected cellen aan langdurige laser microirradiation bloot en verifiëren dat de cellen overgaan tot mitose zoals weergegeven in figuur 3A -B. Als een mogelijke oplossing, verminderen scannen tijd en aantal confocal segmenten per cel, optimaliseren 3D scannen door de keuze van de optimale axiale stap (0,3 µm wordt aanbevolen) en het instellen van de laser ' s macht zijn minimaal. Als alternatief, fototoxiciteit kan worden geëlimineerd met behulp van Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic zuur, een in water oplosbare analoge van vitamine E) opgelost in het medium van de teelt. Voor DNA-schade-gerelateerde experimenten, is het niet aanbevolen om het gebruik van Trolox als gevolg van de beschermende werking tegen UV-straling.
    3. In het geval van bestraling met een laser 355-nm, controleert u of voldoende opneming van BrdU met behulp van een passende BrdU detectieantilichaam uit de opneming BrdU kit (Zie Tabel van materialen). Aangezien BrdU is opgenomen in DNA in de S-fase van de celcyclus, moet de meerderheid van de cellen de S-fase doorlopen tijdens presensitization. Als een mogelijke oplossing, overwegen de lengte van de celcyclus, oftewel celtype specifieke.
    4. Analyseren of het DNA repair proteïnen van belang hebben een vermogen om te herkennen van DNA laesies in specifieke celcyclus fase(n). Een mogelijke oplossing: Om te verifiëren dat de aanwerving van geselecteerde eiwitten aan DNA laesies beperkt tot specifieke celcyclus fasen (G1/S/G2 is), HeLa-Fucci cellen worden gebruikt. Deze cellen express RFP-Cdt1 in de G1 en vroege S fasen en GFP-gelabeld geminin in de S/G2-M celcyclus fasen 22 ( Figuur 1).
    5. Om te voorkomen dat apoptosis, de dood van de cel, selecteert u een passende laserbron en laser macht instelling 23. Houd in gedachten dat cellen bestraalde moet overgaan tot mitose ( figuur 3A -B, Video 3).
      Opmerking: Ongewenste apoptosis kan worden gedetecteerd door Annexine V positiviteit, caspase-3 of triplex B decollete. Op het niveau van de morfologische cel detachement en vorming van apoptotic organen zal zichbaar.

4. Immunofluorescentie Staining

  1. de cellaag (het aantal stijgt in Microscoop gerechten) kort met 1 × PBS afspoelen en na het spoelen, het herstellen van cellen met behulp van 4% formaldehyde voor 10 min. (voor HeLa-afgeleide cellijnen) of 20 min. (voor D3 ES-cellen) bij kamertemperatuur. Spoel de schotel met 1 × PBS.
    Let op: Formaldehyde veroorzaakt ernstige oogbeschadigingen, kan de reactie van een allergische huid, en is ook een potentieel kankerverwekkend te worden ingedeeld; Dus, alle experimentele stappen met formaldehyde moeten worden uitgevoerd in een afzuigkap.
    Opmerking: Om te voorkomen dat geen onnodige bleken van fluorescentie signalen, slaan de schotel in een donkere kamer tijdens de incubatietijd die nodig is voor de kleuring van de immunofluorescentie.
  2. Permeabilize cellen met 0,1% Triton X-100 in H 2 O gedurende 8 minuten opgelost en vervolgens Incubeer de cellen gedurende 12 minuten met 1 × PBS met 0,1% saponine en 0,1% Triton X-100. Na incubatie, het wassen van de cellen in 1 × PBS twee keer voor 15 min.
  3. Incubate cellen met 1% BSA in 1 × PBS voor 60 min voor het blokkeren van aspecifieke binding van geselecteerde antilichamen. Wassen van cellen in 1 × PBS voor 15 min na incubatie.
  4. Dilute primair antilichaam in een verhouding van 1:100 (of 1:200) (deze stap moet optimized voor individuele antilichamen) in 1% BSA in 1 × PBS, met behulp van 25 µL van deze oplossing per schotel en dekking van de cellen met een dekglaasje aan. Incubeer de cellen met de oplossing die van het primaire antilichaam in een bevochtigde kamer 's nachts bij 4 ° C.
  5. De volgende dag, het wassen van cellen in 1 × PBS twee keer voor 5 min.
  6. Het secundaire antilichaam in een verhouding van 1:100 (of 1:200) in 1% BSA in 1 × PBS, met behulp van 100 µL van deze oplossing per schotel, Verdun en dekking van de cellen met een dekglaasje aan. Incubeer de cellen met de oplossing die het secundaire antilichaam voor 60 min. Na incubatie, het wassen van de cellen in 1 × PBS drie keer, gedurende 5 min.
  7. Mount het dekglaasje aan met een daling van montage medium, en verzegel het dekglaasje aan met nagellak of lijm geschiedt ter voorkoming van drogen en beweging tijdens microscopische observatie. De schotel in het donker bewaren bij 4 ° C.

5. Fluorescentie levensduur Image (FLIM) microscopie

  1. Start de FLIM software. Open de " Application Suite " van de software uit en schakel deze aan de " FLIM " modus. Ervoor te zorgen dat de WLL is actief in gepulseerde modus.
    Opmerking: De exploitant moet een knop van de hardware om te bereiken pulse modus schakelen.
  2. Zet de schotel met de gekleurde cellen (gekleurd in sectie 4) in het werkgebied van de Microscoop in dezelfde afdrukstand als tijdens de lokale microirradiation, en vinden de bestraalde cellen volgens de rasters op de petrischaal. Beeldacquisitie uitvoeren door confocal microscoop.
    Opmerking: Gebruik de volgende instellingen: 1024 × 1024 pixels, 400 Hz, bidirectionele modus, 16 lijnen, 8 x zoom tot 12 x.
  3. Uitvoeren voordat u begint de meting van de FLIM, een oriënterende proef om aan te tonen van een real-time overzicht van exponentiële afname, door te klikken op " Setup FLIM " en " overname " en druk op " uitvoeren FLIM test ". Optimaliseren van de FLIM parameters voor het monster door de twee belangrijkste parameters als volgt vast te stellen.
    1. Optimaliseren de herhaling van de WLL met de excitatie golflengte afgestemd op de levensduur van het monster (zie hieronder nota). Pas de intensiteit van de laser met de juiste knop, die in het algemeen heet in de software van de confocal microscoop, " laser aanpassing instelling " in de ' afbeelding overname ' menu. Vervolgens berekenen een verval curve (of histogram weergegeven: alle foton tellingen) met behulp van de FLIM software (Zie figuur 4A -B).
      Opmerking: Gebruik de WLL in pulse modus voor excitatie. De software moet worden uitgerust met een puls picker voor WLL, waarmee de selectie van de herhaling tarief (80, 40, 20, of 10 MHz). De golflengte van de excitatie in het geval van de fluorescentie donor, GFP, is 488 nm. De verval-curve is opgenomen met behulp van de FLIM software werkruimte. De parameter (τ D, τ DA) toont exponentiële afname tijden (bijv., fluorescerende levensduur); parameter (A) vertegenwoordigt de amplitude van fluorescerende verval (zie voorbeelden van FLIM gegevens voor GFP-gelabeld p53 en mCherry-gelabeld 53BP1 in figuur 4A -B).
    2. Zorg de graaf herhaling snelheid met behulp van het hulpprogramma acquisitie software (select herhaling snelheid modus). Selecteer de helderste pixels in het monster; de curve voor de helderste pixel moet minder dan 10% van de totale intensiteit van de fluorescentie.
  4. Klik op " meting " en druk op " uitvoeren FLIM ".

6. donor levensduur met behulp van een FLIM Script en de berekening van de FRET efficiëntie

  1. de FRET-FLIM software Start en open de ' Donor ' werkruimte.
  2. Selecteer de " analyse " / " Imaging " tab in het menu en de FLIM script starten door te klikken op " beginnen met ". Gebruik voor optimale FRET-FLIM instellingen, bekende interactie eiwit partners.
    Opmerking: De efficiëntie van de FRET-FLIM voor bekende interactie partners GFP-p53 en mCherry-53BP1 was (34.1 ± 2,3) % ( figuur 4C).
  3. Gebruiken alleen de Donor emissie kanalen (1 of 2) en druk op " snel berekenen-FLIM ".
    Opmerking: De afbeelding en de grafiek wordt zowel bijgewerkt.
  4. In de FRET-FLIM software, stel de schaal van de intensiteit (0 - 4000 punten) en de omvang van de levensduur (0 - 5 ns) handmatig in de software. Met deze aanpak, het visualiseren van de cel van belang en stel de FRET-FLIM meting.
    Opmerking: Deze instelling elimineert verschillen in intensiteit van de fluorescentie onder afzonderlijke cellen in de celpopulatie.
  5. In de vorm van verval, kies het passende model.
    Opmerking: We raden aan n-exponentiële reconvolution en selectie van model parameter " n ". Een optimale pasvorm heeft de volgende criteria: de ingerichte kromme overlays de verval-curve goed en de χ 2 - waarde is gelijk aan 1 ( figuur 4B).
  6. Selecteer de " drempel " / " gebruik drempel " en instellen van de drempel tot 75. Start " eerste Fit ".
    Opmerking: De SPT64 software berekent de gemiddelde donor levensduur bij gebrek aan FRET (" Amplitude gewogen gemiddelde levensduur ", τ Av.Amp)

7. FRET-efficiëntie met behulp van de FLIM-FRET-Script

  1. de Donor/Acceptor werkruimte selecteert en opent u " analyse " | " Imaging " | " levensduur FRET Image ".
  2. Alleen de Donor selecteren als de actieve kanaal en weggooien van Pixel aanpassen afhankelijk van de foton nummer/pixel. Vervolgens voert de softwaremodus genaamd " berekenen FastFLIM ". Als het foton nummer/pixel in de afbeelding laag is, verhogen het weggooien van de Pixel op 4 punten.
  3. De intensiteit ingesteld op 0 - 200 punten en de levensduur van 0 - 5 ns.
  4. Activeren " gebruik drempel " en voer een drempel van 75.
  5. Het passende model ingesteld op " Multi-Exp. Donor ", voer de model-parameter " n ", voer τ Av.Amp (stap 6.6) als een τ D, en activeer " eerste passen ".
  6. Stel de parameters Bkgr Dec, Shift IRF en IRF naar constante waarden door het verwijderen van het merk Bkgr.
    Opmerking: Stel de meerderheid van de parameters constant blijft zo veel mogelijk. Deze aanpak vermindert statistische schommelingen. In dit geval niet op " eerste fit " weer. Beschrijvingen van de genoemde parameters volgen: IRF = Instrument reactie functie, BkgrDec = achtergrond van de exponentiële fit, ShiftIRF = IRF verschuiving van exponentiële reconvolution past, BkgrIRF = IRF achtergrond van exponentiële reconvolution passen. Alle drie parameters worden berekend en kan worden vastgesteld met behulp van de software voor verdere analyse.
  7. Pers " berekenen FRETŔ een FRET afbeelding (die zijn uitgezet in het afbeeldingsgebied FLIM) en FRET efficiëntie histogram worden berekend, en een FRET afstand histogram uitgezet ( figuur 4C). Wanneer de beeldanalyse is voltooid, drukt u op " resultaat opslaan ".
    Nota: Tijdens de FRET experimenten is het noodzakelijk te overwegen dat TL eiwitten omkeerbare overgangen tussen TL (blank) en valt bestuurlijk gezien onder niet-belichting fluorescerende (donker vertonen). Dit kenmerk wordt genoemd " knippert ", en FRET efficiëntie wordt beïnvloed door dit verschijnsel (een verklaring van dit effect werd verstrekt door Vogerl et al. 24).

8. FRAP analyse

  1. plaats de dish in het werkgebied van de Microscoop, transfected cellen uiten de fluorescently tagged proteïne van belang vinden en beeldacquisitie helder veld microscopie met de standaard Microscoop lamp uit te voeren (Zie figuur 2Aa-b) en fluorescentie microscopie modi.
    1. Voor image aquisition, gebruik maken van de wit-light laser (WLL) verbonden met de confocal microscoop (of een laser van keuze, volgens de geselecteerde fluorescerende). Gebruik de volgende instellingen: 512 × 512 pixels, 1000 Hz, bidirectionele modus, lijn gemiddelde 1, 8 x zoom tot 12 x.
    2. Verwerven ten minste 15 prebleaching beelden (op ~ 10% laser kracht) en definiëren van de regio van belang (ROI) in het menu afbeelding acquisitie.
  2. Voor photobleaching experimenten, gebruiken een laser argon (488 nm). De volgende instellingen toe te passen: frame resolutie 512 × 512 pixels, 1000 Hz, bidirectionele modus, 8 x zoom tot en met 10 x.
    Opmerking: Fluorochromes zoals GFP, mCherry en RFP kunnen worden opgewekt door een argon laser werken bij 488 nm of 514 nm.
  3. Gebruiken de FRAP-softwaremodus van de Microscoop van keuze. Tijdens de photobleaching, stel de argon laser ' s vermogen maximaal gebruik van de laser aanpassing knop. Uitvoeren van Beeldacquisitie tussenpozen 0.256 s op 10% laser kracht.
    Opmerking: Voor de postbleaching stappen, gebruik de standaardimage overname modus van de confocal microscoop van keuze.
    1. Monitor fluorescentie hersteltijd na photobleaching (tot 45-50 s na het bleken procedure).
      Opmerking: Zoals blijkt uit Figuur 4 d, is de hersteltijd na photobleaching voor mCherry-gelabeld 53BP1 verschillend op spontane DNA laesies en UVA-straling-geïnduceerde foci. mCherry-53BP1 op UVA laesies herstelde snel in vergelijking met mCherry-53BP1 ophopingen op spontaan voorkomende DNA repair foci; Zie Figuur 4 d en Foltankova et al. 25
  4. de gegevens van de Microscoop software (of software van keuze) exporteren naar een werkblad en statistische analyse uitvoeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van geavanceerde confocale microscopie, zien we een accumulatie van mCherry-gelabeld 53BP1 en mCherry-PCNA eiwitten op DNA laesies. Analyses werden uitgevoerd door lokale microirradiation van levende cellen. Om te herkennen van de nucleaire distributiepatronen van DNA-reparatie-gerelateerde eiwitten in individuele celcyclus fasen, gebruikten we de cellulaire systeem van Fucci, waarmee het mogelijk is te bepalen de G1, de vroege S, en G2 fasen van de cel cyclus (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microscopie technieken vertegenwoordigen basishulpmiddelen in onderzoekslaboratoria. Hier een korte beschrijving van de methoden gebruikt voor de studie van eiwit werving en kinetiek op DNA laesies wordt gepresenteerd. Wij vooral bekend voor onze experimental ervaring op het gebied van lokale microirradiation van levende cellen, en we bespreken de studie van eiwit-kinetiek door FRAP en eiwit-eiwit interactie op DNA laesies door acceptor-bleken FRET28 en de geavanceerde wijziging FRET-FLIM (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de subsidie-Agentschap van de Tsjechische Republiek, project P302-12-G157. Experimenten werden ook ondersteund door de Tsjechische-Noors onderzoek programma CZ09, die wordt begeleid door Noorse fondsen en door het ministerie van onderwijs, jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek (verlenen van nummer: 7F14369).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celcultuur
HeLaATCCCCL-2TM
ES-D3 [D3]ATCCCRL-11632TM
HeLa -Fucci cellenhttp://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEMPAN-BiotechP03-0710
DMEM hoge glucoseSigma-AldrichD6429-500ML
Fetaal bovien serum (FBS)HyCloneSV30180.03
ES Cell FBSGibco16141-079
Niet-essentiële aminozuren (NEAA)Gibco11140-035
mLIF (muis leukemie-remmende factor)Merck MilliporeESG1107
MTG (1-Thioglycerol)Sigma-AldrichM6145-25ML
Penicilline-Streptomycine-oplossingBioseraXC-A4122/100
Trypsine - EDTABioseraXC-T1717/100verdunnen met 1 × PBS in verhouding 1:6
Nunclon celcultuurschaaltjesSigma-AldrichP7866cultivatie van mESCs D3-cellen
µ-Schaal 35m+A15:I35m Grid-500Ibidi GmbH81166microscopische schaal
0,2% GelatineSigma-AldrichG1890-100Gverdunnen in gedestilleerde water en autoclaved
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celtransfectie
GFP-p53-plasmideAddgene12091
mCherry-PCNA-plasmidegenereuze gift van Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1-plasmideAddgene19835
MetafeceteneBiontex Laboratories GmbHT020–2.0
10 × PBSThermo Fisher ScientificAM9625gebruik voor transfectie 1 × PBS verdund in nuclease-vrij water
5-broom-2’-deoxy-uridineSigma-Aldrich11296736001
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Confocale microscopie
Microscoop Leica TCS SP5Leica Microsystems
Microscoop Leica TCS SP8Leica Microsystems
Witte-lichtlaserLeica Microsystems
355-nm laserCoherent Inc.laservermogen 80 mW
405-nm laserLeica Microsystemslaservermogen 50 mW
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Immunofluorescencekleuring
DekglasVWR International Ltd631-1580
4% paraformaldehydeAffymetrix19943 1 LT
Triton X100MP Biomedicals2194854
Saponine uit quillaja-schorsSigma-AldrichS4521
BSASigma-AldrichA2153
53BP1Abcamab21083primair antilichaam
AlexaFluore 647Thermo Fisher ScientificA27040secundair antilichaam
VectashieldVector Laboratories LtdH-1000montagemedium

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858(2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281(2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39(2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593(2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MicrobestralingFRAPFLIMFRETFucci systeemUV laserscelcyclus

Gerelateerde artikelen