Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

Samenvatting

Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.

Samenvatting

De aanwezigheid van onvolledige chimerism is in een groot deel van de patiënten na beenmergtransplantatie voor thalassemie grote of sikkelcelziekte hebt genoteerd. Deze constatering heeft enorme implicaties, als latere therapeutische immunomodulatie strategieën klinische resultaten kunnen verbeteren. Conventioneel, wordt polymerase kettingreactie gebaseerde analyse van korte tandem herhalingen gebruikt voor het identificeren van chimerism in donor-afgeleide cellen van het bloed. Echter, deze methode is beperkt tot genucleëerde cellen en geen onderscheid maken tussen gedissocieerde eencellige geslachten. We toegepast van de analyse van korte tandem herhalingen te stromen van hematopoïetische voorlopercellen cytometrische-gesorteerd en vergeleken dit met de analyse van korte tandem herhalingen verkregen uit geselecteerde burst-vormende eenheid - erythroid kolonies, beide verzameld uit het bot beenmerg. Met deze methode zijn wij in staat om aan te tonen van de verschillende proliferatie en differentiatie van cellen van de donor in het compartiment van de erythroid. Deze techniek in aanmerking komt voor het voltooien van de huidige monitoring van chimerism in de stamcel transplantatie instellen en dus kan worden toegepast in de toekomst klinische studies, stamcelonderzoek en het ontwerp van gene therapie proeven.

Inleiding

Allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) is de enige beschikbare curatieve aanpak voor een verscheidenheid van aangeboren erfelijke aandoeningen van het hematopoietische systeem, ziektevrije overleving tarieven van meer dan 90% bereiken, want anders zeer aangetast en beperkte levensduur patiënten¹. De werkzaamheid van dit belangrijk therapeutisch instrument is geoptimaliseerd door het beperken van de toxiciteit van pre- en na transplantatie regimes², maar ook door interventies gericht op het behoud van stabiele graft functie, die wordt gekwantificeerd door het nauwe toezicht op donor-afgeleide cellen^3,4,5.

In het algemeen, impliceert volledige chimerism (CC) de totale vervanging van het compartiment van de lymphohematopoietic door donor-afgeleide cellen, overwegende dat de term gemengd chimerism (MC) wordt gebruikt als donor - en ontvanger-afgeleide cellen tegelijk aanwezig in verschillende zijn verhoudingen. Split chimerism (SC) duidt de coëxistentie van gemengde chimerism waargenomen in eencellige lineages, zoals in het compartiment van de erythroid. Snelle bepaling van de status van de chimerism na HSCT is van cruciaal belang, aangezien het kan helpen identificeren van patiënten vatbaar voor ziekte herval en starten van de daaropvolgende immunomodulerende strategieën, zoals donor lymfocyt infusies of vermindering van immunosuppressieve therapieën⁶.

Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het toezicht op engraftment na HSCT. Isotyping van immunoglobulinen en analyse van cytogenetica hebben slechte gevoeligheid en zijn beperkt in hun vermogen om het detecteren van polymorfisme^7,8. De invoering van fluorescente in situ -hybridisatie (FISH) gevoeligheid in chimerism monitoring na HSCT kan verbeteren, maar is beperkt tot seks-mismatched allografts⁹. Op dit moment de Kettingreactie van de polymerase (PCR) is de meest voorkomende methode gebruikt voor het opsporen van chimerism en is gebaseerd op de Elektroforese van het gel van de conventionele agarose-acrylamide variabele nummer tandem herhalingen (VNTRs) of korte tandem herhaalt (STRs). Routinematig gebruikt is kwantitatieve PCR kundig voor speurder een zeer klein deel van de resterende donor cellen na HSCT. De belangrijkste beperking van de studies tot nu toe is dat MC detection is vrijwel uitsluitend beperkt tot de aanwezigheid van genucleëerde cellen, in plaats van rijpe erytrocyten, namelijk cellen dat functioneel cruciaal voor patiënten ondervinden Hemoglobinopathieën. Bij patiënten met verschillende bloedgroepen is het goed te beseffen dat cytofluorometric analyse vermag chimerism in rode bloedcellen te identificeren met behulp van monoklonale antilichamen gericht op de erytrocyt antigenen ABO en C, c, D, E en e^{10 , 11}. een verschillende, maar zeer interessant middel voor de beoordeling van de chimerism in het geslacht erythroid is de combinatie van stroom cytometrische sorteert van erythroid voorlopercellen en selectie van verschillende types van erythroid voorlopercellen kweken in clonogenic tests, gevolgd door analyse van STR¹². Deze aanpak is kunnen kwantificeren van de relatieve verhoudingen van donor-versus-ontvanger chimerism in het compartiment van de erythroid en kan worden gebruikt in de strategie om te ondersteunen de prothese beenmerg.

Protocol

1. isolatie van hematopoietische beenmergcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren

1. monster kleuring
   1. vóór de aanvang van het proces, de volgende items moeten worden verzameld en bereid:
      1. verloop media voor de bereiding van mononucleaire cellen (GM), 50 mL conische buizen
      2. 12 x 75 mm flow buizen voor kleuring cellen
      3. Staining buffer: fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 3% foetaal kalfsserum (FCS)
      4. pipetten < / l Ik >
      5. FC blok en kleuring van antilichamen (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Met deze combinatie van fluorescerende er is verwaarloosbaar spillover naar andere kanalen, maar elke andere geschikte fluorescerende combinatie is ook mogelijk.
      6. Compensatie kralen (indien nodig)
      7. Ophanging buffer: Hank ' s evenwichtig zout oplossing (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
      8. Blauwe Trypan en hemocytometer
      9. Collectie buizen: elk rijk medium met hoge serum buizen (met 1 mL FCS + 25 mM HEPES) kan worden gebruikt voor het verzamelen van gesorteerde cellen.
      10. Het beenmerg monster: geïnformeerde toestemming voor het beenmerg biopsie uit de iliacale crest van de rug van de heup bot is meestal vereist. Het monster van het beenmerg is dan gehouden in EDTA spuiten op RT tot vlekken. De volgende stappen van het protocol worden uitgevoerd met inachtneming van de richtsnoeren van de instelling ' s menselijke ethiek onderzoekscommissie voor menselijk welzijn.
   2. Genereren een eencellige schorsing van het monster van het beenmerg. Voeg 3 mL GM tot de centrifugebuis. Zorgvuldig laag de 4 mL van de eencellige vering op de GM-oplossing. Centrifugeer bij 550 g gedurende 30 minuten bij 20 ° Celsius (C) (rem is uitgeschakeld). Tekenen van de bovenste laag met plasma en bloedplaatjes met behulp van een steriele precisiepipet, waardoor de mononucleaire cellaag ongestoord op de interface. De laag van mononucleaire cellen overbrengen in een steriele centrifugebuis met behulp van een precisiepipet steriele.
   3. Na het wassen met 5 mL buffer kleuring, resuspendeer de cellen in 2 mL schorsing buffer en bepaal de concentratie van de cel. Plaats 5 µL celsuspensie in een reageerbuis schroefdop. Voeg 95 µL van 0,2% Trypan blauwe vlek. Meng grondig. Laat staan gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vul een hemocytometer voor het tellen van de cel. Onder een Microscoop, observeren als niet-levensvatbare zijn gekleurd en levensvatbare cellen tellen.
   4. Centrifugeren van de cellen bij 250 g gedurende 10 minuten bij 20 ° C, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de kleuring van buffer bij een concentratie van maximaal 1 x 10-⁶ per 100 µL.
   5. Blok FcR door het gebruik van 2,5 µg Fc blok per 1 x 10 ⁶ cellen op ijs gedurende 10-15 minuten
   6. Toevoegen de juiste combinatie van 10 µg mAb aan vlek 1 x 10 ⁶ cellen en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C in het donker, gevolgd door een wassen stap met 3 mL buffer kleuring. Voor correcte vergoeding, zijn kleine porties van de cellen (of bij voorkeur compensatie kralen) gekleurd met één antilichamen elke; één aliquot resterende onbevlekt.
   7. Aanpassen van de concentratie tot 20 x 10 ⁶ cellen/mL.
   8. Set up en optimaliseren van de cel sorteerder. Het proces van het opzetten van een stroom cytometer en software is gestandaardiseerd met een gedetailleerde instructies door het bedrijf en hoeft te worden uitgevoerd door naar behoren opgeleid personeel.
2. Sorteren op de sorter cel
   1. bereiden collectie buizen uit stap 1.1.1.9.
   2. Een sjabloon instellen waarmee een bivariate complot omvat om weer vooruit scatter (FSC) en kant scatter (SSC).
   3. Uitvoeren van de cellen en het aanpassen van FSC/SSC om de bevolking van belang op schaal
   4. Opnemen van de negatieve controle buis.
   5. De buizen enkele positieve controle uitgevoerd; de gegevens voor elke buis opneemt.
   6. Berekenen vergoeding handmatig of automatisch met de functie verstrekt door de software van de acquisitie.
   7. Het experimentele monster verwerven en hen op een bivariate FSC/SSC dot perceel ( figuur 1A) zowel lymfatische en myeloïde cellen poort. Paren en aggregaten uitsluiten door het vergelijken van de verschillende signalen van FSC (d.w.z., hoogte, breedte en gebied) ( figuur 1B). Visualiseren van de singlet-cellen op een perceel van de bivariate dot CD45 en CD36 weer te geven ( Figuur 1 c). Gebeurtenissen positief voor CD45 zijn leukocyten (waaronder hun progenitorcellen), die voor CD45 negatieve en positieve voor CD36 zijn erythroid progenitoren. Gebruik gating tools om definiëren CD36 + (indien gewenst, deze cellen kunnen verder worden onderverdeeld in CD36 hoge en lage uiten cellen) en CD45 + cellen. Visualiseer CD45 + gebeurtenissen in een ander punt perceel CD34 en SSC parameters weer te geven. Gebruik hulpmiddelen om CD34 + cellen (leukocyte progenitoren) en SSC hoge cellen (myeloïde cellen in verschillende stadia van differentiatie) te definiëren gating.
   8. Zodra poorten hebben vastgesteld, de poorten kunnen worden geselecteerd voor sorteren in externe collectie buizen.
   9. Ga verder met het sorteren bij 4 ° C, totdat het vereiste aantal cellen is verkregen
   10. Uitvoeren van een analyse van de post sorteren om te bepalen van de zuiverheid van de gesorteerde cel populaties ( figuur 1E, 1F).

2. Clonogenic test

1. bereiding van reagentia
   voordat u begint het proces, de volgende items moeten worden verzameld en voorbereid:
   1. pipetten, 100 mm platen
   2. Trypan blauw en hemocytometer
   3. reconstrueren menselijke recombinante erytropoëtine (EPO) bij 500 U/mL in steriel PBS met ten minste 0,1% menselijk serum albumine. Deze oplossing in kleine porties verdelen en houd bij-20 ° C om herhaalde bevriezen-ontdooien.
   4. Voorbereiden voltooien Iscove ' s gewijzigd Dulbecco ' s Medium (IMDM) met de eindconcentraties van 5% FCS, 2 mM Glutamine, 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine (PS). Menselijke recombinante erytropoëtine (EPO) bij verschillende concentraties in aparte putten toevoegen aan het volledige IMDM medium: 3 eenheden EOB per putje, 6 eenheden EOB per putje en 12 EOB eenheden per putje (1 x, 2 x, 4 x EPO respectievelijk).
2. Voorbereiding van beenmergcellen
   1. 10 mL van het monster van de beenmerg verdund met 20 mL PBS langzaam lagen zijn geplaatst op de top van 15 mL dichtheid kleurovergang medium in een conische buis van 50 mL, handhaven van duidelijke interface tussen de twee fasen en u nder steriele omstandigheden. Centrifugeer dan de conische buisjes van 15 mL bij 550 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) met versnelling ingesteld als 9 en vertraging instellen als 0 (of rem uitschakelen).
   2. Na het centrifugeren, verwijderen van de interface in een nieuwe tube van 50 mL en voeg PBS tot een eindvolume van 50 mL.
   3. Na het centrifugeren met 250 g gedurende 10 minuten bij 10 ° C Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in volledige IMDM medium bij ongeveer 0,5 x 10 ⁶ cellen/mL. 10 µL van de celsuspensie rekening een microtube, meng met een gelijk volume Trypan blauwe oplossing (0,4%) en rekenen met behulp van een hemocytometer.
   4. Optional: CD34 + cellen zijn verrijkt door magnetische cel sorteren met het Milteny CD34 kralen volgens de instructies die zijn gegeven door de vervaardiging. Het belangrijkste voordeel van deze verrijking stap is om te ontdekken de kwaliteit van hematopoietische stamcellen, die zijn geteeld op een semi-solide matrix toegevoegd met 50 ng/mL stamcel factor (SCF), 20 ng/mL granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), 20 ng/mL interleukine-3 (IL-3), 20 ng/mL Interleukine-6 (IL-6), 20 ng/mL granulocyt kolonie-stimulerende factor (G-CSF) en 3 verschillende concentraties van het EOB in 1.4.
   5. Verdun de cellen tot 0,1 - 0,15 x 10 ⁶ mononucleaire cellen/mL of 2 x 10 ³ CD34 ⁺ cellen/mL door toevoeging van volledige IMDM medium aangevuld met EPO en overdracht 300 µL tot 3 mL Methocult H4434 medium. Na agitatie en een korte broedtijd 5 min plaat drie keer 1,1 mL op een 35 mm-schotel. Twee van deze cultuur gerechten samen met een derde - gevuld met water - worden geplaatst in 100 mm platen.
   6. Cellen worden gekweekt in een incubator bevochtigde 37 ° C met 5% CO ₂ voor 14 dagen.
3. Analyse van kolonies
   1. kolonies worden volgens hun morfologie gescoord met een omgekeerde Microscoop op 40 X vergroting in een cultuur schotel gemarkeerd met een scorende raster. Voor de toepassing van onze assay, de kolonie vormende eenheden (kve) zijn ingedeeld in 4 categorieën: multipotential voorlopercellen (CFU-GEMM), granulocyt-macrofaag voorlopercellen (CFU-GM), burst zelftappende eenheid-erythroid (BFU-E) en kolonievormende eenheid-erythroid (CFU-E). Raadpleeg de fabrikant van ' s instructies voor verdere kolonie subclassification.
   2. Voor verdere analyse, cellen van de CFU assay plaat worden teruggevorderd afzonderlijk volgens de 4 categorieën door op te schorten bij kamertemperatuur 4 mL PBS met 2% FCS/IMDM. Na centrifugeren bij 400 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, de cellen zijn geresuspendeerde in PBS, geteld en verwerkt voor DNA-extractie.

3. Analyse van Chimerism

1. DNA isolatie
   1. Pellet de cellen door centrifugeren op 400 g gedurende 10 minuten
   2. Isoleren DNA met een bloed DNA extractie kit (QIAmp DNA bloed extractie kit). Vooraf de elutie buffer (AE) warm bij 37 ° C te verbeteren van het rendement van DNA geëlueerd.
   3. Meet de DNA-concentratie met Nanodrop ND-1000 spectra fotometer. Monsters met OD 260/280 tussen 1.8-2.0 worden gebruikt voor verdere analyse.
   4. DNA verdunnen met DNAase gratis H ₂ O 0.1 ng/µL in een totaal volume van 50 µL.
2. STR-analyse
   1. de PCR reactie instellen door het mengen van reactie Mix, AmplTaq Gold Polymerase van DNA en Profiler Plus Primer Set met 20 µL genomic DNA (0.1 ng/µL) volgens de handleiding (de primer-kit bevat de labelloze inleidingen in de buffer te versterken de STR loci D3S1358, vWA FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, en D7S820 en de amelogenin van de marker geslacht). Omvatten nuclease-gratis water als negatieve controle en 9947A als positieve controle. Pre transplantatie DNA van donor en ontvanger zijn ook inbegrepen.
   2. Uitvoeren van PCR reactie Eppendorf mastercycler verloop met de volgende voorwaarden: 95 ° C gedurende 11 min, 28 amplificatie cycli van 95 ° C voor 1 min, 59 ° C voor 1 min en 72 ° C gedurende 1 min, gevolgd door 60° C gedurende 45 min.
   3. Set up fragment analyse reactie door toevoeging van 12 µL Hi-Di-Formamid en 0,5 µL GeneScan 500 ROX grootte standaard (alle toegepast Biosystems) 1 µL van het PCR-product. Op eerste en laatste positie nodig is een allèlique Ladder (Genotyper Amp Fl STR blauw, groen II en geel, toegepast Biosystems).
   4. Start elektroforese en acquisitie met het instrument van elektroforese.
   5. Analyseren Loci, allelen en piekhoogten van monsters en besturingselementen met de software ¹³.

Resultaten

Scheiding van lymphohematopoietic voorlopercellen door het sorteren van de cel FACS

Wij tonen hier resultaten dan het sorteren van de nodige cel populaties voor downstream STR analyse. Beenmergcellen werden gekleurd met V450-geconjugeerde anti-CD45, de FITC-geconjugeerd anti-CD36 en de APC-geconjugeerde anti-CD34. De bevolking van belang is de Megakaryocyt erythroid progenitoren (MEP), nucleated cellen die veran...

Discussie

Het doel van de huidige studie is bedoeld als het publiek een combinatie van twee benaderingen voor het analyseren van de chimerism van de donor/ontvanger in erythroid progenitoren HSCT na bij patiënten behandeld voor Hemoglobinopathieën: 1.) fluorescentie-geactiveerde cel sorteren van hematopoietische stamcellen in beenmerg monsters gevolgd door analyse van korte tandem herhalingen en 2.) kolonie-vormende eenheid groeit van beenmergcellen, indeling van de kolonies in verschillende types van voorlopercellen gevolgd door ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	Verwijder RBC
50 mL conische buizen	Falcon	14-432-22	Steekproefvoorbereiding
12 x 75 mm flow tubes	Falcon	352002	FACS-sortering
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Gibco	10010023	PBS
Foetaal runder serum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (hitte-inactivering)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypanblauw	Gibco	15250061
Hemocytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatische celtelling
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspensiebuffer in FACS-analyse
HEPES	Gibco	15630080	Onderdeel van suspensiebuffer
FcR	BD Bioscience	564220	Blokkeer FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS-sorteerder
Recombinant  menselijke erythropoëtine	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPO
Isocove's Modified Dulbecco's Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Onderdeel van Cultuurmedium
CD34+ magnetische kralen	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ zuivering
Recombinant  menselijke G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Recombinant  menselijke SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Recombinant  menselijke GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Recombinant  menselijke IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Recombinant  menselijke IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blood extractie kit	Qiagen	51306	DNA Isolatie
Nanodrop ND-1000 spectra fotometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA Kwantificering
DNAase vrij H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA Bereiding
AmplTaq Gold DNA Polymerase	Applied Bioscience	N8080240	PCR
Eppendorf mastercycler gradiënt	Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Applied Bioscience	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Size Standard	Applied Bioscience	4310361	PCR
3130 Genetic Analyzer	Applied Bioscience	313001R	PCR