Methodenartikel

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

DOI:

10.3791/56011

⸱

28 juli 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, KU Leuven

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA-bindende eiwitten (RBP's) bepalen de fates van RNA's. Zij nemen deel aan alle RNA biogenese pathways en dragen bij tot post-transcriptie gene regulatie (PTGR) van messenger RNAs (mRNAs). In de afgelopen jaren zijn een aantal mRNA gebonden proteomen uit gist- en zoogdiercellijnen succesvol geïsoleerd door gebruik te maken van een nieuwe methode genaamd "mRNA interactome capture", die het mogelijk maakt om mRNA-bindende eiwitten (mRBP's) te identificeren. Direct vanuit een fysiologische omgeving. De werkwijze bestaat uit in vivo ultraviolette (UV) verknoping, aftrek en zuivering van messenger ribonucleoproteïne complexen (mRNPs) door oligo (dT) kralen, en de daaropvolgende identificatie van de verknoopte eiwitten door middel van massaspectrometrie (MS). Heel recent, door dezelfde methode toe te passen, zijn verschillende planten mRNA gebonden proteomen gelijktijdig gerapporteerd uit verschillende Arabidopsis weefsel bronnen: geëtolideerde zaailingen, bladweefsel,Blad mesofyl protoplasten, en gekweekte wortelcellen. Hier presenteren wij de geoptimaliseerde mRNA interactome capture methode voor Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten, een celtype dat dient als een veelzijdig hulpmiddel voor experimenten die diverse cellulaire assays omvatten. De voorwaarden voor optimale eiwitopbrengst omvatten de hoeveelheid startweefsel en de duur van UV-bestraling. In het mRNA gebonden proteoom verkregen uit een middelgrote experiment (10 7 cellen) bleek dat RBP's die op RNA-bindende capaciteit beschikten, te oververtegenwoordigd waren en veel nieuwe RBP's werden geïdentificeerd. Het experiment kan opgeschaald worden (10 9 cellen), en de geoptimaliseerde methode kan toegepast worden op andere plantencel typen en soorten om in grote mate te isoleren, te catalogeren en mRNA-gebonden proteomen te vergelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryoten gebruiken meerdere RNA biogenese regulerende pathways om cellulaire biologische processen te behouden. Onder de bekende typen RNA is mRNA zeer divers en draagt ​​de coderingscapaciteit van eiwitten en hun isoformes 1. De PTGR-weg leidt de fatsussen van pre-mRNAs 2 , 3 . RBP's uit verschillende genfamilies regelen de regulering van RNA, en in PTGR leiden specifieke mRBPs mRNAs door directe fysieke interacties, die functionele mRNP's vormen. Daarom is het identificeren en karakteriseren van mRBP's en hun mRNP's van cruciaal belang om de regulering van cellulaire mRNA-metabolisme 2 te begrijpen. In de afgelopen drie decennia zijn diverse in vitro methoden - waaronder RNA-elektroforetische mobiliteitsverschuiving (REMSA) -assays, systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijkingstests (SELEX) gebaseerd op bibliotheek-afgeleide constructen, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radioactief gemerk of kwantitatiefFluorescentie-RNA-bindingsbepalingen, röntgenkristallografie en NMR-spectroscopie 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - zijn op grote schaal toegepast op studies van RBP's, voornamelijk uit zoogdiercellen. De resultaten van deze studies van zoogdieren RBP's kunnen worden gezocht via de RNA-bindende Protein DataBase (RBPDB), die de gepubliceerde waarnemingen 10 verzamelt .

Hoewel deze in vitro benaderingen krachtige tools zijn, bepalen ze de gebonden RNA-motieven uit een bepaald RNA-pool van sequenties en zijn daarom beperkt in hun vermogen om nieuwe doel RNA's te ontdekken. Hetzelfde geldt voor berekeningsstrategieën om genoom-brede RBP's te voorspellen, die zijn gebaseerd op het behoud van eiwitsequentie en structuur 15 . Om dit te overwinnen is een nieuwe experimentele methode haS is vastgesteld die het mogelijk maakt om de RNA-motieven te identificeren die een RBP van belang heeft, alsmede voor de bepaling van de precieze plaats van binding. Deze methode, genaamd "verknoping en immunoprecipitatie" (CLIP), bestaat uit in vivo UV-verknoping gevolgd door immunoprecipitatie 11 . Vroege studies hebben aangetoond dat fotoactivering van DNA- en RNA-nucleotiden kan optreden bij excitatie UV-golflengten groter dan 245 nm. De reactie door thymidine lijkt gunstig te zijn (rang in volgorde van verminderde fotoreactiviteit: dT> dC> rU> rC, dA, dG) 12 . Door gebruik te maken van UV-licht met een golflengte van 254 nm (UV-C) werd geconstateerd dat covalente bindingen tussen RNA-nucleotiden en eiwitresiduen worden gecreëerd bij slechts enkele Astromen (Å). Het fenomeen wordt dus de "nul-lengte" verknoping van RNA en RBP genoemd. Dit kan gevolgd worden door een strikte zuivering procedure Duur met weinig achtergrond 13 , 14 .

Een complementaire strategie voor CLIP is het combineren van in vivo UV-verknoping met eiwitidentificatie om het landschap van RBP's te beschrijven. Een aantal van dergelijke genoomwijdte mRNA gebonden proteomen zijn geïsoleerd uit gistcellen, embryonale stamcellen (ESC's) en menselijke cellijnen ( dwz HEK293 en HeLa) met behulp van deze nieuwe experimentele aanpak, genaamd "mRNA interactome capture" 18 , 19 , 20 , 21 . De methode bestaat uit in vivo UV-verknoping gevolgd door mRNP zuivering en MS-gebaseerde proteomics. Door deze strategie toe te passen, zijn veel nieuwe "maanlichtende" RBP's die niet-kanonieke RBD's bevatten, ontdekt en is het duidelijk geworden dat meer eiwitten RNA-bindende capaciteiten hebben dan eerder werd verondersteld"> 15 , 16 , 17. Het gebruik van deze methode zorgt voor nieuwe toepassingen en voor de mogelijkheid om nieuwe biologische vragen te beantwoorden bij het onderzoeken van RBP's. Bijvoorbeeld, heeft een recente studie het behoud van het mRNA gebonden proteome onderzocht (de kern RBP Proteome) tussen gist en menselijke cellen 22 .

Plant RBP's zijn al gebleken betrokken te zijn bij groei en ontwikkeling ( bijv . In de posttranscriptie regulatie van bloeitijd, de circadiaanse klok en genuitdrukking in mitochondriën en chloroplasten) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Bovendien worden ze gedacht aan functies in de cellulaire processen die reageren op abiotische stressen ( bijvoorbeeld koud, droogte, saLinheid en absciszuur (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Er zijn meer dan 200 voorspelde RBP genen in het Arabidopsis thaliana genoom, gebaseerd op RNA herkenningsmotief (RRM) en K homologie (KH) domein sequentie motieven; In rijst zijn ongeveer 250 genoteerd 35 , 36 . Het is opmerkelijk dat veel voorspelde RBP's uniek zijn voor planten ( bijv. Geen metazoan-orthologen tot ongeveer 50% van de voorspelde Arabidopsis- RBP's die een RRM-domein bevatten) 35 , wat suggereert dat veel nieuwe functies kunnen dienen. De functies van de meeste voorspelde RBP's blijven uncharacterized 23 .

De isolatie van mRNA gebonden proteomen uit Arabidopsis geëtolideerde zaailingen, bladweefsel, gekweekte wortelcellen en bladmemofyl protoplasten door het gebruik vanMRNA interactome capture is recentelijk gerapporteerd 38 , 39 . Deze studies tonen het sterke potentieel om in de nabije toekomst systematisch de functionele RBP's in planten te catalogeren. Hier presenteren we een protocol voor mRNA interactome capture van plant protoplasten (dat wil zeggen cellen zonder celwanden). Arabidopsis thaliana blad mesofyl protoplasten zijn het belangrijkste type bladcel. De geïsoleerde protoplasten zorgen voor optimale toegang van UV licht aan de cellen. Dit celtype kan gebruikt worden in analyses die transient eiwitten voor functionele karakterisering 40 , 41 uitdrukken. Bovendien is protoplasting toegepast op verscheidene andere plantencelsoorten en soorten 42 , 43 , 44 ( bijv. Petersson et al ., 2009; Bargmann en Birnbaum, 2010; en Hong et al ., 2012).

De methode omvat in totaal 11 stappen ( figuur 1A ). Arabidopsis blad mesofyl protoplasten worden eerst geïsoleerd (stap 1) en worden vervolgens UV bestraald om verknoopte mRNPs (stap 2) te vormen. Wanneer protoplasten worden gelicht onder denatureringsomstandigheden (stap 3), worden de verknoopte mRNP's in lysis / bindingsbuffer vrijgegeven en door oligo-d (T) 25 kralen (stap 4) getrokken. Na verscheidene ronden strengende wassen worden de mRNP's gezuiverd en verder geanalyseerd. De gedenatureerde peptiden van mRBPs worden verteerd door eiwitase K voordat de verknoopte mRNA's worden gezuiverd en de RNA-kwaliteit wordt geverifieerd door qRT-PCR (stappen 5 en 6). Na behandeling met RNase en eiwitconcentratie (stap 7) wordt de proteïnekwaliteit geregeld door SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en zilverkleuring (stap 8). Het verschil in eiwitbandpatronen kan gemakkelijk worden geïllustreerd tussen een verknoopt monster (CL) en een niet-verknoopt monster (niet-CL;Het negatieve controle monster van protoplasten die niet aan UV-bestraling worden blootgesteld). De identificatie van eiwitten wordt bereikt door middel van MS-gebaseerde proteomics. De eiwitten uit het CL-monster worden gescheiden door eendimensionale polyacrylamidegelelektroforese (1D-PAGE) om mogelijke achtergrondverontreiniging te verwijderen, "in-gel gedigereerd" in korte peptiden met behulp van trypsine, en worden gezuiverd (stap 9). Nano reverse-phase vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (nano-LC-MS) maakt het mogelijk de hoeveelheid definitieve eiwitten in het mRNA gebonden proteome te bepalen (stap 10). Tenslotte worden de geïdentificeerde mRBP's gekenmerkt en gecatalogiseerd met behulp van bioinformatische analyse (stap 11).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Arabidopsis Blad Mesophyll Protoplast Isolatie

OPMERKING: Arabidopsis blad mesofyl protoplasten zijn in hoofdzaak geïsoleerd, zoals beschreven door Yoo et al ., 2007, met verscheidene wijzigingen 40 .

  1. Groei van planten
    1. Week ongeveer 200 Arabidopsis thaliana Col-0 ecotype zaden in gesteriliseerd water gedurende 2 dagen bij 4 ° C in het donker voor stratificatie.
      OPMERKING: Dit aantal zaden is voldoende voor een non-CL monster en een CL monster (zie stap 1.3).
    2. Bereid potten op met een 50% ( v / v ) mengsel van grond en vermiculiet en week de potjes met gedestilleerd water in een dienblad om de grond te nat.
    3. Zaai en verdeel de gestratificeerde zaden op natte grond. Bedek de zaden niet met extra grond omdat Arabidopsis zaden licht nodig hebben voor ontkieming.
      OPMERKING: De plantengroeiomstandigheden zijn een 12 uur lange / 12-uurse durende cyclus bij 23 ° C,Met een lichtintensiteit van 100 μmol m -2 s -1 , in een groeikamer voor 5 weken voor bloei. 4 weken oude planten kunnen ook gebruikt worden 40 .
      OPMERKING: Alle beschreven materialen en reagentia van stap 1.2.1 tot en met 3.2.3 zijn voor twee monsters ( dwz één non-CL monster (het controlemonster dat niet onderworpen is aan UV-C bestraling) en een CL-monster (het onderzoek Monster dat onderworpen is aan UV-C bestraling)).
  2. Bereiding van isotonische enzymoplossing
    1. Maak 80 ml primaire isotonische enzymoplossing (400 mM mannitol, 20 mM KCl en 20 mM MES-buffer (pH 5,7)) en verwarm de oplossing onmiddellijk in een incubator van 60 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Voeg 1,2 g Cellulase R10 ( w / v 1,5%) en 0,32 g Macerozyme R10 ( w / v 0,4%) poeder toe aan de warme primaire isotone enzymoplossing.
    3. Breng het enzympoeier zorgvuldig in oplossing door zacht roeren toe te passen. TikVerwarm de oplossing in een 60 ° C incubator gedurende 10 minuten totdat de enzymoplossing helder lichtbruin is.
    4. Koel de oplossing op ijs gedurende 3 minuten en voeg 800 ul van 1 M CaCl2 en 800 ui 10% (w / v) BSA aan de oplossing.
    5. Homogeniseer de oplossing door pipettering en filtering via een 0,22 μm filter. Aliquot deze laatste isotone enzymoplossing in twee grote Petrischalen (150 mm x 20 mm).
  3. Voorbereiding van Arabidopsis rozet bladstrips
    OPMERKING: 150 bladeren voor elke Petri schotel worden aanbevolen voor een non-CL monster of een CL monster.
    1. Kies en snijd totaal 300 volledig uitgezette 2e - of 3e -paar echte bladeren (gemiddeld 3-4 per rozet) in 0,5- tot 1-mm leaf strips met een nieuwe en scherp scheermesje.
    2. Plaats de strips onmiddellijk in de isotone enzymoplossing.
      OPMERKING: Om het contact met licht te vermijden, moet u altijd t afdekkenHij Petri Schotels Met Aluminiumfolie. Vermijd de bladeren niet. Bevestig dat alle strips in de oplossing ondergedompeld zijn en niet op het oppervlak drijven.
  4. Isolatie van Arabidopsis blad mesofyl protoplasten
    1. Leg de aluminiumfolie bedekte Petri-schotels in vacuümdrogers en infiltreer de bladstrips onder 30 minuten onder vacuüm. Vervolgens incubateer de Petri-schotels in duisternis zonder gedurende 2.5 uur bij kamertemperatuur te schudden.
    2. Schud de schotels horizontaal voorzichtig en kort, met de poging om de protoplasten volledig in de enzymoplossing te laten vallen.
  5. Oogsten en tellen van de protoplasten
    1. Filter de protoplast suspensie door een nylon gaas van 35 tot 75 μm. Aliquot het filtraat van elk monster in twee 50 ml ronde bodembuizen (ongeveer 20 ml filtraat in elke buis).
    2. Spoel elke Petri schotel met 10 ml W5 buffer (154 mM NaCl, 125 mM CaCl 2, 5 mM KCl en 2 mM MES buffer (pH 5,7)) om de rest van de protoplasten over te brengen naar de enzymoplossing. Voeg dit 10 ml filtraat van elk monster toe aan de buizen. Bedek de buizen met aluminiumfolie en houd ze op ijs.
    3. Spin alle vier buizen gedurende 5 minuten bij 100 xg om de protoplasten te pelletiseren. Gooi de supernatant weg en verwijder de protoplastpellets in elke buis voorzichtig met 10 ml W5-buffer.
      OPMERKING: Bij het resuspenderen van de protoplastpellets, draai de buis voorzichtig omlaag en draai de buis voorzichtig met de hand tot de pellets verdwenen zijn. Pipet de pellet niet direct om te vermijden dat de cellen worden beschadigd.
    4. Herhaal stap 1.5.3 eenmaal en combineer de protoplast suspensie van twee buizen van elk monster in een 50 ml ronde onderbuis. Houd de buizen op ijs.
    5. Tel de protoplasten met behulp van een hemocytometer.
      OPMERKING: Elke 20 cellen binnen 25 kubussen zijn gelijk aan 2 x 10 5 protoplasten / ml. 150 bladeren moeten ongeveer 1 x 107 cellen opleveren.Moduleren om een ​​gelijke totale aantal protoplasten in de niet-CL en CL-monsters te hebben.
    6. Houd de protoplasten op ijs gedurende 30 minuten. Vervolgens draai de buizen gedurende 5 minuten bij 100 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de protoplasten per buis met 20 ml MMG-oplossing (400 mM mannitol, 15 mM MgCl2 en 4 mM MES buffer (pH 5,7)).

2. In vivo mRNA-eiwit verknoping door UV-bestraling

OPMERKING: Houd de non-CL monsterbuis op ijs. Het CL monster moet direct UV bestraald worden.

  1. Breng de protoplast suspensie met 1 x 107 cellen uit de CL-monsterbuis over op een nieuwe grote Petri-schotel (150 mm x 20 mm) en voeg 30 ml ijskoude MMg-oplossing toe om het plaatoppervlak te bedekken. Spreid de cellen in de hele MMg-buffer door zacht pipetteren. Plaats de Petri-schotel onmiddellijk zonder de bovenklep in een UV-verknopingsapparaat.
    OPMERKING: De hoogte tussen de UV-lampEn de petri schotel is 8 cm.
  2. Bestral het monster met 254 nm golflengte UV licht en 0,00875 W / cm 2 UV intensiteit gedurende 1 min, 3 min of 5 min. Na bestraling, snijd de protoplast-suspensie snel in twee nieuwe 50 ml ronde bodembuizen. Was de bodem van de schotel met een extra 5 ml ijskoude MMg oplossing om de rest van de protoplasten te verzamelen en deze cel suspensie aan deze twee buizen toe te voegen.
    OPMERKING: 1 min werd gekozen als optimale conditie. De uitleg staat in de representatieve resultaten .

3. Protoplast Lysis onder Denaturerende Voorwaarden

  1. Bereiding van protoplastpellets voor lysis
    1. Spin de niet-CL monsterbuis samen met de twee CL monsterbuizen van stap 2 bij 100 xg gedurende 5 minuten en wrijf de supernatant af. Plaats de buis van de protoplastpelletjes van het niet-CL-monster op ijs.
    2. Voeg 10 ml ijskoude MMg oplossing toe aan elke CL monsterbuis, genDe pellets opnieuw resuspenderen en combineren ze terug in een 50 ml ronde bodembuis. Spin de buis bij 100 xg gedurende 5 minuten. Na het verwijderen van de supernatant, houd de CL-proefbuis protoplast pellet op ijs.
  2. Protoplastlysis en homogeniserende protoplastlysaat
    1. Voeg 9 ml ijskoude lysis / bindingsbuffer (500 mM LiCl, 0,5% ( w / v ) lithiumdodecylsulfaat (LiDS), 5 mM dithiothreitol (DTT), 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM EDTA (pH 8,0)) aan de celpellet van elk monster. Licht de protoplasten ongeveer 20 minuten omhoog en omlaag om ongeveer 20 keer te pipetteren totdat de suspensie homogeen lichtgroen is.
    2. Pas het protoplastlysaat twee keer door een 50 ml glazen spuit met een smalle naald (0,9 x 25 mm 2 ) voor homogenisatie. Incubeer het lysaat op ijs gedurende 10 minuten. Vries de lysaten in vloeibare stikstof en houd deze bij maximaal 3 weken bij -80 ° C.

4. MRNP aftrek en zuiveringDoor Oligo-d (T) 25 Kralen

OPMERKING: Alle onderstaande materialen en reagentia, van stap 4.1 tot stap 4.4, zijn alleen voor één monster ( dwz één non-CL monster of een CL monster). Het protoplastlysaat moet onmiddellijk worden toegevoegd aan de buizen die kralen bevatten, nadat de kralen supernatant lysis / bindingsbuffer is weggegooid.

  1. Bereiding van oligo-d (T) 25 magnetische kralen voor oligo (dT) capture
    1. Ontdooi het bevroren protoplastlysaat bij kamertemperatuur. Wanneer het lysaat volledig ontdooid is, houd de buis lysaat op ijs.
    2. Aliquot 1,8 ml oligo-d (T) 25 magnetische kralen (5 mg / ml) in 6 nieuwe 2 ml ronde bodem microcentrifuge buizen op ijs. In elke buis was de suspensie suspensie homogeen met 600 μl lysis / bindingsbuffer met korte pipettering omhoog en omlaag en voorzichtig te roteren bij 4 ° C gedurende 2 minuten. Houd de kralen op ijs.
  2. Verbindend
    1. PlaatsAlle 6 buizen bevatten de kralen in een magnetisch rek bij 4 ° C gedurende 3 minuten, wat resulteert in de magnetische opname van de kralen en het opruimen van de suspensie.
      OPMERKING: Wanneer de buizen in het magnetische rek zijn geplaatst, wacht tot de kralen volledig zijn gevangen, ten minste 3 minuten.
    2. Gooi de supernatant weg en ga meteen 9 ml protoplastlisaat in deze 6 buizen. Meng goed door pipetteren tot een homogene bruine suspensie verschijnt en incubeer de kralen in protoplastlysaat bij 4 ° C gedurende 1 uur door zachte rotatie aan te brengen.
      OPMERKING: een incubatietijd van 30 minuten tot 1 uur wordt aanbevolen.
  3. het wassen
    1. Plaats de buizen opnieuw in het magnetische rek bij 4 ° C gedurende 3 minuten. Wanneer alle kralen aan de zijkant van de buizen worden vastgelegd, haal het protoplastlysaat in 6 nieuwe 2 ml ronde bodemmicrocentrifugebuizen op en houd ze tijdelijk op 4 ° C. Verwerp het protoplastlysaat niet onmiddellijk; Houd het lysaat vastBij 4 ° C.
    2. Voeg 1,5 ml ijskoude wasbuffer 1 (500 mM LiCl, 0,1% ( w / v ) LiDS, 5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM EDTA (pH 8,0) toe aan de parels In elke buis. Resuspendeer de kralen en draai de lichte rotatie gedurende 1 minuut aan. Plaats de buizen opnieuw in het magnetische rek bij 4 ° C gedurende 3 minuten en gooi de supernatant weg. Herhaal deze wasstap met een wasbuffer.
    3. Herhaal dezelfde procedure van deze wasstap twee keer met 1,5 ml ijskoude wasbuffer 2 (500 mM LiCl, 5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM EDTA (pH 8,0)) en eenmaal gebruikmakend van 1,5 ml ijskoude laagzoutbuffer (200 mM LiCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM EDTA (pH 8,0)).
      OPMERKING: Als de mRNP's efficiënt geïsoleerd zijn uit het protoplastlysaat, zou er een "halo" zichtbaar moeten zijn rond de kraalpelletje in het CL-monster tijdens de wasstap met wasbuffer 2 ( Figuur 1B ).
  4. elutie
    1. Voeg 500 μL toeVan elueringsbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM EDTA (pH 8,0)) aan de kralen in elke buis. Resulteer de kralen voorzichtig en incubeer gedurende 3 minuten bij 50 ° C om de poly (A) -taafde RNA's te ontlaten. Resulteer de kralen eenmaal door pipettering. Plaats de buizen 5 minuten in de magnetische rek bij 4 ° C.
    2. Breng alle eluenten (ongeveer 3 ml in totaal) over en combineer deze met een schoon, steriel RNase-vrij, 15 ml kegelbuis op ijs.
      OPMERKING: De kwaliteit en hoeveelheid RNA kunnen meteen worden bepaald met behulp van een spectrofotometer.
      OPMERKING: De RNA-concentratie van elk monster is ongeveer 10 ng / μl, met een A 260 / A 280- verhouding van 1,9. De A 260 / A 280 verhouding zou tussen 1,6 en 2,0 moeten zijn omdat de geïsoleerde poly (A) -taafde RNA's gewoonlijk meer dan 70% zuiver zijn. Als de RNA-concentratie te laag is, verhoog het aantal startprotoplasten tot maximaal 10 9 . samplesKan in vloeibare stikstof worden bevroren en bij langdurige opslag bij 80 ° C gehouden worden.
    3. Herhaal stap 4.2 tot stap 4.4 voor nog eens twee rondes en gebruik de oligo-d (T) 25 kralen opnieuw om de poly (A) getekende RNA's uit de protoplastlisaat af te dekken.
      OPMERKING: Na drie ronden van de aftrekprocedure moeten er in totaal 9 ml eluens voor elk non-CL- of CL-monster zijn. Doe al het werk bij 4 ° C om de afbraak van RNA te vermijden. Volg stap 4.5 of stap 4.6 om de kralen opnieuw te gebruiken of te regenereren.
  5. Bereiding van opnieuw gebruikte oligo-d (T) 25 kralen
    1. Was de kralen tweemaal met 1 ml ijskoude elutiebuffer en één keer met 1 ml ijskoude lysis / bindingsbuffer om de zout LiCl-concentratie terug te zetten naar 500 mM.
    2. Volg stap 4.1, verwijder de supernatant, verplaats het opgeslagen protoplastlysaat in elke buis en herhaal de hele procedure van stap 4.2 tot stap 4.4 voor nog twee ronden.
  6. Regeneratie van oligo-d (T) 25 kralen
    OPMERKING: Kralen kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor een ander experiment (maximaal hergebruik is drie keer).
    1. Volg stap 4.4, voeg 1 ml 0,1 M NaOH toe aan de kralen en incubeer door gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te roteren. Voor elke buis twee keer wassen met 1 ml wasbuffer 1 en 3 keer met 1x PBS (pH 7,4) die 0,1% Tween-20 bevat voor evenwicht. Houd de kralen uit elke buis in 300 μL steriele RNase-vrije 1x PBS (pH 7,4) die 0,1% Tween-20 bij 4 ° C bevat voor langdurige opslag.
      OPMERKING: Kralen gebruikt voor Arabidopsis CL monsters in dit experiment kunnen de volgende keer alleen voor dezelfde plantmonsters worden gebruikt.

5. Proteïnase K Behandeling en mRNA zuivering

  1. Proteinase K behandeling
    1. Voeg 8 μL Proteinase K oplossing (2 μg / μL) toe aan 1 ml van het eluens van elk monster om de UV-verknoopte eiwitten te verteren. BrIefly vortex.
  2. MRNA zuivering
    1. Incubeer het eluent bij 37 ° C gedurende 1 uur. Zuiver het RNA met behulp van de RNA zuiveringsset om resterende verontreinigingen te verwijderen.
      OPMERKING: Na zuivering zijn de RNA's klaar voor de RNA-kwaliteitstest met behulp van de qRT-PCR-analyse.
      OPMERKING: Andere kits, zoals RNA mini kit en TRIzol reagens, kunnen ook gebruikt worden 14 .

6. qRT-PCR-analyse

  1. Reverse transcriptie
    1. Bereik efficiënte synthese van eerste-strand cDNA met behulp van het omgekeerde transcriptiesysteem, met 1 μg RNA als de sjabloon. Verdun het monster tot 5 ng / μL met nuclease-vrij water.
  2. CDNA kwantificering met behulp van qRT-PCR
    1. Vergroot en kwantificeer het cDNA met behulp van de qPCR master mix en de real-time PCR cycler, met 10 ng cDNA als de sjabloon. Gebruik het volgende PCR-programma: 95 ° C gedurende 10 minuten(Stadium 1, één cyclus) en 95 ° C gedurende 15 s en 60 ° C gedurende 1 minuut (stadium 2, 40 cycli).
      OPMERKING: Het hier gebruikte referentiegen was een endogeen interne controle gen, UBQ10 (AT4G05320). QRT-PCR primers voor UBQ10 en 18S rRNA werden beschreven in Li et al ., 2014 en Durut et al ., 2014 respectievelijk 45 , 46 . Primer sequenties staan ​​vermeld in de Materiaal Tabel .

7. RNase Behandeling en mRBP Concentratie

  1. RNase behandeling
    1. Voeg ongeveer 100 U RNase-cocktail met RNase A en RNase T1 in 8 ml eluent toe. Inclusief een negatief-controle monster met RNase cocktail waarin het eluent wordt vervangen door nuclease-vrij water. Kortom draaikolk en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  2. MRBP concentratie
    1. Na RNase-spijsvertering, concentreer het eluent-usinG centrifugale filtereenheden. Het eindvolume is 75 μl, met een totale eiwitopbrengst van ongeveer 2 μg van elk monster na concentratie. Plaats de monsters bij -80 ° C voor langdurige opslag.

8. SDS-PAGE en Silver Staining

  1. SDS-PAGE
    1. Meng 25 μL van het geconcentreerde eluens (CL monster) of het controle monster (niet-CL monster) met 15 μl 2x laadkleuring. Verhit het monster bij 95 ° C gedurende 5 minuten en laad het op een SDS-PAGE gel die 5% stapelgel bevat en 12% oplosbare gel, inclusief een eiwitmarkering.
    2. Kondenseer de eiwitten bij 60 V gedurende 40 minuten en scheid bij 160 V gedurende ongeveer 1 uur totdat de laadkleuring het einde van de oplossende gel bereikt.
  2. Silver-staining assay
    1. Was de SDS-PAGE gel tweemaal per keer met ultrauw water gedurende 5 minuten. Voer het zilververf van de eiwitten uit door gebruik te maken van een commercieel zilvervlekstuk.
      OPMERKING: De eiwitbanden moeten binnen 5 minuten getoond worden. Als de banden langer dan 5 minuten zichtbaar zijn met een zeer lichte kleur, wordt het voorgesteld om het aantal startprotoplasten te verhogen tot maximaal 10 9 .

9. Trypsine Digest of Protein Bands en Peptide Purification

  1. Trypsine verteren
    OPMERKING: Voer een tweede 1D-PAGE gel uit door nog eens 25 μL geconcentreerde mRBP oplossing van elk monster voor mRBP identificatie te nemen; Zilvergekleurde gels kunnen niet gebruikt worden omdat ze niet compatibel zijn met MS-analyse.
    1. Na het uitvoeren van de 1D-PAGE gel, fixeer de gel in fixatieoplossing (50% ( v / v ) methanol en 10% ( v / v azijnzuur) gedurende 1 uur. Vlek de gel in vlekoplossing (0,1% ( w / v ) Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% ( v / v ) methanol en 10% ( v / v ) azijnzuur gedurende 20 minuten met zacht schudden. Verlos de gel in de weg oplossing (40% ( v / v ) methanol en 10% ( v/ V) azijnzuur) gedurende 1 uur. Na de afbraak, houd de gel in 5% ( v / v ) azijnzuur.
      OPMERKING: Tijdens het vernietigen kan de nieuwe destain oplossing worden vervangen totdat de achtergrond volledig is vernietigd.
    2. Knip de banden van belang uit de gel. Knip de banden verder in stukken van ongeveer 1 mm 3 voor de daaropvolgende optimale trypsine vertering en extractie van peptiden. Hydrateren gelstukken met 50 pl 100 mM ammoniumbicarbonaat (NH4 HCO 3) gedurende 10 minuten. Bedek de gelstukken helemaal af.
      1. Verwijder de hydraterende oplossing voorzichtig en dehydrateren de gelstukken met acetonitril (CH3CN) gedurende 10 min. Verwijder de acetonitriloplossing voorzichtig.
      2. Herhaal het proces van hydratatie tot uitdroging tweemaal. Tenslotte verwijder de acetonitriloplossing.
        OPMERKING: De gel looptijd hangt af van het doel van het experiment. Een langere tijd laat een goede scheiding van eiwitten toe, zodat het gekleurde specifieke gelverbodDS kan worden uitgesneden voor verdere analyse. Als het doel is om de eiwitten te bewaren en verontreinigingen te verwijderen, is een korte termijn voldoende.
    3. Voeg 500 μl 6,6 mM DTT-oplossing toe en incubeer de gelstukken gedurende 10 minuten. Verwijder de DTT-oplossing en doe de gelstukken tweemaal met 500 μl 95% ( v / v ) acetonitriloplossing.
      1. Na het wassen, verwijder de acetonitriloplossing en incubeer de gelstukken met 500 μL 55 mM iodazijnzuur (IAA) oplossing gedurende 10 minuten in de duisternis.
      2. Na incubatie, verwijder de oplossing en was de gelstukken opnieuw met 500 μL 95% ( v / v ) acetonitriloplossing. Droog de gelstukken.
    4. Integreer de gelstukken geheel met 25 pl digestie buffer (50 mM NH4 HCO 3, 5 mM CaCl2, en 6 ng / ul trypsine) en houden op ijs gedurende 45 minuten te laten de trypsine doordringen in de gel. Incubeer de gelstukken gedurende de nacht bij 37 ° C voor en Zymatische spijsvertering.
  2. Peptide zuivering
    1. Voeg 80 ul van 50 mM NH4 HCO 3 de gelstukken in digestiebuffer en vortex herhaaldelijk om de tryptische peptiden te extraheren. Verzamel het extract. Herhaal deze extractietijd tweemaal met 80 μL 50% ( v / v ) CH 3 CN en 5% ( v / v ) mierenzuur (FA).
      OPMERKING: Het totale uiteindelijke extract moet ongeveer 240 μL zijn.
    2. Pool en concentreer de extracten in ongeveer 10 μl door vacuümconcentratie of lyofilisatie en voeg 25 μl 0,1% ( v / v ) waterige trifluorazijnzuur (TFA) oplossing toe. Verwijder de monsters met μ-C18 kolommen, volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Elueer de peptiden met 4-10 pl 60% (w / v) CH3CN en 0,1% (v / v) FA. Lyophiliseer (vriesdroog) de peptiden en sla ze op -20 ° C tot analyse.
Titel "> 10. Nano-LC-MS

  1. Nano reverse-phase vloeistofchromatografie
    OPMERKING: Doe de LC-MS analyse met een massaspectrometer die online gekoppeld is met een vloeistofchromatografie instrument. Dit instrument moet uitgerust zijn met een C18 kolom (2 μm deeltje, 100 Å poriegrootte en 50 μm x 15 cm in afmeting).
    1. Resuspendeer de gevriesdroogde peptiden in 16 ul oplossing (2% (v / v) CH3CN en 0,1% (v / v) FA). Spuit 5 μL peptideoplossing in met een stromingssnelheid van 5 μl / min op een C18-voorloper (3 μm deeltjesgrootte, 100 Å poriegrootte, nanoviper en 75 μm x 2 cm in afmeting).
    2. 10.1.2. De peptiden scheiden met een 95 min-gradiënt met een stromingssnelheid van 300 nL / min. Tijdens dit scheidingsgradiënt, verhoog de mobiele fase B van 4 tot 10%, 10% tot 25% en 25% tot 45% in respectievelijk 5 minuten, 50 minuten en 18 minuten. Ten slotte verhoog de mobiele fase B steil naar 95% in 1 minuut. NaElk 95 min scheidingsgradiënt past een inherente spoeltrap toe die een 10 min-gradiënt van 4% tot 95% in 5 minuten bevat.
      OPMERKING: Mobiele fase A 99,9% H2O en 0,1% (v / v) FA en mobiele fase B is 19,92% H2O, 80% (w / v) CH3CN en 0,08% (v / v ) FA.
  2. Massaspectrometrie analyse
    1. Bedien de massaspectrometer in dataafhankelijke modus met een massabereik van 400 tot 1.600 m / z.
    2. Selecteer tot tien van de meest intense ionen in MS1 ​​om de fragmentatie spectra te genereren. Stel de resolutie in op maximaal 70.000 full width bij half maximum (FWHM) voor MS1 en 17.000 voor MS2, met een doelwit van automatische versterking (AGC) van 3.000.000 en 1.000.000 ionen en een maximale ioninjectietijd (IT) van 256 en 64 ms voor MS1 En respectievelijk MS2.
    3. Stel de dynamische uitsluiting in op 10 s om herhaalde fragmentatie van de meest overvloedige ionen te vermijden.
      OPMERKING: hier zijn ionen met één of meer dan zes ladingen eXcluded voor MS2.
  3. Kwalitatieve proteomics: peptide- en eiwitidentificatie
    1. Analyseer fragmentatie spectra met behulp van software zoals Peaks studio software 47 , 48 , 49 .
      OPMERKING: Andere softwarepakketten zijn ook beschikbaar voor peptide-identificatie, zoals NovoHMM 30 en PepNovo 37 voor de novo sequencing en SEQUEST 54 en Mascot 55 voor database zoeken.
    2. Combineer spectra met dezelfde massa (<2 ppm verschil) en retentietijden (<2 min) en behoud alleen spectra met een kwaliteitsdrempel hoger dan 0,65 om de Swiss-Prot-database (versie: december 2013) te zoeken voor de taxonomie die is ingesteld op model Plant Arabidopsis Thaliana . Gebruik de volgende zoekparameters: een voorlopermassetolerantie van 10 ppm door het gebruik van de monOisotopische massa; Een fragment massa tolerantie van 20 mmu; Trypsine als het spijsverteringsenzym, met maximaal 2 gemiste spleten; Cysteïne carbamidomethylering als de vaste wijziging; Methionine oxidatie als de variabele modificatie; En maximaal 3 variabele post-translationele modificaties per peptide. Na identificatie stelt u de score drempels voor betrouwbare peptide- en eiwitidentificatie in, zodat een valse ontdekkingsfrequentie (FDR) <5% wordt verkregen.
  4. Kwantitatieve proteomics: statistische analyse van massaspectrometrie data
    1. Gebruik LC-MS ( bijv. Progenesis) voor de etiketvrije kwantificering van proteomics data.
      OPMERKING: MS1 peptide piek gebieden (of intensiteit) zijn gekoppeld aan de peptiden die door de studio software zijn geïdentificeerd volgens hun massa, met de tolerante fout op maximaal 10 ppm.
      OPMERKING: Deze software berekent het overvloed van een peptide door de piekoppervlakken van alle ladingsstaten tussen 2 + en 8 + . De kwantitatieve data is gekoppeld aan de PEAKS peptide identificatie door een inhouse script (massa matching met de tolerante fout bij maximaal 10 ppm).
    2. Bereken de gemiddelde log2-vouwveranderingen (CL / niet-CL) voor elk peptide. Groepeer de vouwveranderingen van de unieke peptiden door eiwitten.
      OPMERKING: In elke groep komt de uiteindelijke vouwverandering van een eiwit overeen met de gemiddelde vouwveranderingen van zijn peptiden.
    3. Bereken de p-waarde met behulp van de t- toets van de student voor elke groep om de statistische betekenis te evalueren. Pas R-softwarepakket toe (versie 3.3.0) om de p-waarden voor de FDR van alle groepen te corrigeren met behulp van de Benjamini-Hochberg (BH) methode.
    4. Teken de vulkaanplot met behulp van het functiepakket "Kalibreren" (versie 1.7.2) dat compatibel is met het R-softwarepakket (versie 3.3.0).
      OPMERKING: hier zijn de -log10-aangepaste p-waarden (-log10 (bijv. P-waarde)) een functie van de log2-voudige wijzigingen van alle geïdentificeerde eiwitten. Proteïnen zijnBehandeld als positieve hits in het mRNA gebonden proteoom als hun log2-voudige veranderingen groter zijn dan 2, met of zonder betekenis.

11. Catalogus van het geïdentificeerde mRNA gebonden proteome

  1. Klassificeer de geïdentificeerde eiwitten van stap 10 in drie categorieën op basis van de items van "moleculaire functies en biologisch proces" via de Gene Ontology (GO) database en "familie en domein" via de InterPro database.
  2. Zoals categorie I, of "Ribosomale eiwitten" bevat alle gedetecteerde ribosomale eiwitten, definiëren eiwitten uit categorie II, of "Main RBPs," zoals geannoteerde eiwitdomeinen die interactie hebben met RNA's of koppelen aan RNA-binding met bekende of onbekende functies in RNA-biologie .
  3. Aangezien eiwitten met bekende of onbekende functies in RNA-biologie zonder geannoteerde RNA-bindende domeinen in categorie III of "Kandidaat RBP's" worden gedefinieerd, definiëren enzymen uit categorie III op basis van annotaties van de INtEnz database.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben een karakteristieke halo waargenomen die de kralenpelletje in het CL-monster omsluit, in wasstap 4.3 met wasbuffer 2 ( Figuur 1B ). Hoewel het niet is onderzocht, kan dit fenomeen waarschijnlijk worden verklaard door de interferentie van verknoopte mRNP complexen met kraal aggregatie tijdens de magnetische opname waardoor een meer diffuus aggregaat wordt gevormd. Het geeft aan dat de oligo-d (T) 25 kraalvangst effectief was

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben succesvol mRNA interactome capture toegepast, ontwikkeld voor gist en menselijke cellen, om blad mesofyl protoplasten te planten. Bladmacofylcellen zijn de belangrijkste aardweefsel in plantenblaadjes. Het grote voordeel van deze methode is dat het in vivo verknoping gebruikt om de eiwitten uit een fysiologische omgeving te ontdekken.

In dit protocol presenteren we voornamelijk een aantal geoptimaliseerde experimentele condities ( bijvoorbeeld het aantal protoplas...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen het laboratorium van prof. Joris Winderickx, die de UV-verknopingsapparaat heeft voorzien van de conventionele UV-lamp. KG wordt ondersteund door het onderzoeksfonds KU Leuven en erkent steun van FWO-subsidie ​​G065713N.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
0.8 M MannitolSigmaM1902-500GPrimary isotonic Enzyme solution &
MMg solution
2 M KClMERCKArt. 4935Primary isotonic Enzyme solution &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)		Sigma-aldrichM2933Primary isotonic Enzyme solution,
W5 buffer &
MMg solution,
Filtration sterilization
Cellulase R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g		Final isotonic enzyme solution
Macerozyme R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.MACEROZYME R-10, 10gFinal isotonic enzyme solution
10% (w/v) BSA
(Bovine Serum Albumin)		Sigma-aldrichA7906-100GFinal isotonic enzyme solution &
Filtration sterilization
1 M CaCl2Chem-Lab NVCL00.0317.1000Final isotonic enzyme solution,
W5 buffer &
Digestion buffer
1 M NaClFisher ChemicalS/3160/60W5 buffer
2 M MgCl2SigmaM8266-100GMMg solution
1 M LiCl
(Lithium Chloride)		Acros199885000Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
Low salt buffer
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)		Sigma-aldrichL4632-25GLysis/binding buffer,
Wash buffer 1 &
Filtration sterilization
1 M DTT
(Dithiothreitol)		Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
Wash buffer 2		307866Lysis/binding buffer,
1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))Acros &
Fisher Chemical		167620010 &
H/1200/PB15		Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)Sigma-aldrichED-500GLysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
Tween 20MERCK8.22184.0500Regeneration of oligo-d(T)25 beads
0.1 M NaOHVWR PROLABO CHEMICALS28244.295Regeneration of oligo-d(T)25 beads
1x PBS (pH 7.4)
(Phosphate Buffered Saline)
containing
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)		Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		Regeneration of oligo-d(T)25 beads
Proteinase K solution (2 μg/μL)Thermo Fisher Scientific11789020Protein digestion
Loading dyeInvitrogenLC5925SDS-PAGE
qPCR master mixPromegaA6001qRT-PCR assay
RNase CocktailThermo Fisher ScientificAM2286RNA digestion
MethanolSigma-aldrich322415Gel fixation and gel destaining
Acetic acidSigma-aldrich537020Gel fixation and gel destaining
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Fisher Scientific20278Gel staining
1 M NH4HCO3
(Ammonium bicarbonate)
 		Sigma-aldrich09830-500GGel hydration &
Digestion buffer
CH3CN
(Acetonitrile)		Sigma-aldrich34851-100MLGel dehydration &
Peptide dissolving solution
IAA
(Iodoacetic acid)		Sigma-aldrichI4386-10GAlkylating agent
TFA
(Trifluoroacetic acid)		Sigma-aldrich302031-10X1MLPeptide dissolving solution
FA
(Formic acid)		Sigma-aldrich06554-5GPeptide extraction
Trypsin solution (6 ng/μL)PromegaV5280Digestion buffer
NameCompanyCatalog NumberComments
EQUIPMENT
SoilPeltracomLP2DPlant growth
Vermiculite 3Sibli AS05VERMICULIETPlant growth
Petri dish (150 x 20 mm)Sarstedt82.1184.500Carrier for protoplast suspension
0.22 μm filterMilliporeSE2M229104Homogenization of final isotonic enzyme solution
RazorbladeAgar ScientificT585Rosette leaf strips
35-75 μm nylon meshSEFAR NITEX74010Protoplast suspension filtration
50 mL round bottom tubesSigma-aldrichT1918-10EACarrier for protoplast suspension
Hemocytometer
(Bürker hemocytometer)		MARIENFELD650030Protoplast cell counting
UV crosslinking apparatus
(

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
  2. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  3. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
  4. Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
  5. Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
  6. Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
  7. Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
  8. Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
  9. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  10. Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, Database issue D301-D308 (2011).
  11. Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
  12. Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
  13. Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
  14. Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
  15. Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
  16. Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
  17. Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
  18. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  19. Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  20. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  21. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
  22. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
  23. Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
  24. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
  25. Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
  26. Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
  27. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
  28. Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986(2013).
  29. Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
  30. Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
  31. Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
  32. Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
  33. Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
  34. Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
  35. Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
  36. Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
  37. Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
  38. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
  39. Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  40. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  41. Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
  42. Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
  43. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
  44. Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
  45. Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
  46. Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
  47. Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
  48. Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
  49. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587(2012).
  50. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
  51. Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
  52. Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
  53. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
  54. Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
  55. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

UV crosslinkingOligo dT beadsmassaspectrometrieRNA bindende eiwittenArabidopsis thalianapost transcriptionele regulatieproteomanalysecellyse

Gerelateerde artikelen