Dit document wordt beschreven hoe u cardiopulmonale bypass bij muizen. Dit nieuwe model zal het vergemakkelijken van het onderzoek in de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij orgel schade.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cardiopulmonale Bypass in een muismodel: een nieuwe benadering
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Naarmate langdurige cardiopulmonale bypass essentiëler tijdens cardiale interventies, ontstaat een toenemende klinische vraag voor de optimalisering van de procedure en voor het minimaliseren van orgel schade ten gevolge van langdurige alsook omloop. Het doel van deze paper was om aan te tonen een volledig functioneel en klinisch relevante model van cardiopulmonale bypass in een muis. Wij rapporteren over het ontwerp van het apparaat, perfusie circuit optimalisatie en microchirurgische technieken. Dit model is een acute model, dat niet compatibel met overleving te wijten aan de noodzaak voor meerdere bloed tekeningen is. Vanwege het aantal tools beschikbaar voor muizen (b.v., markeringen, uitsparingen, enz.) vergemakkelijkt dit model onderzoek naar de moleculaire mechanismen van orgel schade en het effect van cardiopulmonale bypass ten opzichte van andere comorbidities.
Inleiding
Sinds de introductie van cardiopulmonale bypass (CPB) in de kliniek, heeft het een essentiële rol gespeeld in de Cardiale Heelkunde1. In moderne Cardiale Heelkunde is CPB langdurig essentieel voor het uitvoeren van uitgebreide aorta reconstructies en gecombineerde procedures. Hoewel technologische vooruitgang enorme geweest, het gebruik van alsook omloop is geassocieerd met intra - en postoperatieve systemische en lokale orgel schade2,3.
Grote dierlijke modellen zijn ontwikkeld voor het onderzoek naar de rol van CPB op fysiologische processen4,5. Hoewel deze modellen hebben verstrekt inzicht in enkele van de CPB bijbehorende complicaties, ze zijn zeer kostbaar en moleculaire hulpmiddelen (bijvoorbeeld antistoffen) zijn zeer beperkt. Een meer kosten-efficiënt alternatief is ontwikkeld bij kleine dieren. Sinds hun ontwikkeling, zijn meerdere studies uitgevoerd voor het optimaliseren van een model van het CPB in ratten en konijnen5,6,7,8,9. Deze modellen bieden een goede basis voor metingen van pathofysiologische ziekteprocessen; ze zijn echter nog onvoldoende om te onderzoeken van cellulaire en humorale immunologie als gevolg van het ontbreken van relevante antilichamen en reagentia. Dit schaadt hun rol op het gebied van onderzoek.
We hebben onlangs een muismodel van CPB ontwikkeld. Als gevolg van een grote verscheidenheid van muis-specifieke reagentia en genetisch gemodificeerde muizen zijn Muismodellen in het algemeen het model bij uitstek voor fysiologische, moleculaire en immunologisch onderzoek10,11. Daarom, ons model vergemakkelijkt de studie van het CPB met betrekking tot de verschillende comorbidities als er veel muizen variëteiten verkrijgbaar met klinisch relevante ziekten12,13. Dienovereenkomstig, dit document wordt beschreven, in detail, CPB in muizen. Zuurstof en hemodynamische parameters worden nauwlettend gevolgd na de arrestatie van diepe ademhaling en bloedsomloop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dier bescherming wet (TierSchG) en goedgekeurd door de Commissie van de lokale dierenwelzijn (lagere Saksen staat Bureau voor de bescherming van de consument en voedselveiligheid, Protocol TSA 14/1556). Het minimale gewicht van muis geschikt voor dit model is 25 g.
1. preoperatieve voorbereiding
Opmerking: alle procedures worden uitgevoerd in schone, niet-steriele omstandigheden met gesteriliseerde met autoclaaf instrumenten.
- Plaats 50-60 8 cm lange propyleen holle vezels parallel in een buis en verbinden met een T-adapter aan beide zijden. Vul de ruimte tussen de holle vezels en de externe tak van de T-adapter met lijm.
- Toestaan ten minste 24 uur voor de lijm te verharden. Snijd de holle vezels uitbreiding uit van de T-adapter met behulp van een standaard microtoom en trek de Siliconen slang naar de verbindingspunten.
- Een naald 27 G metalen (vanaf een branule van 26G) invoegen in een 2 Fr polyurethaan canule. Use een chirurgisch mes & micro-schaar onder een microscoop (8-12 X vergroting) om drie tot vier fenestrations van ongeveer 0,15 cm elke binnen het distale derde deel van de canule om te verzekeren optimale veneuze return stroom.
- Verwijderen de draad wanneer voltooid. Gebruik katoenen wissers voor botte dissectie en intrekking van structuren. Gaas swabs (5 x 5 cm 2) gebruiken om te genieten van overtollige vocht om weefsel uitdroging te voorkomen.
- Bereiden de vulvolume. Toevoegen voor de voltooiing, 30 IU heparine per mL priming oplossing en 2,5% v/v van een 8,4% oplossing van NaHCO 3 voor het bufferen. Bewaar deze oplossing bij 4 ° C tot gebruikt.
- Vul het CPB-circuit (d.w.z., pomp, lucht trapper, leidingen en beide cannulas) met 850 µL instructieoplossing via de veneuze canule. Eenmaal gevuld, houden de CPB circulerende totdat het dier klaar voor cannulation is.
2. Dierlijke verdoving
- te beheren van anesthesie, plaats het dier in een kamer met inductie onder 2,5% v/v Isofluraan/zuurstof mengsel. Bevestig goede verdoving door ramingskosten pedaal terugtrekking reflex, staart snuifje reflex en oog knipperen reflex. Toepassing veterinaire oog zalf Voorkom oog droogheid.
- Plaats het dier op een opwarming pad met temperatuur-regeling functie. Lichaamstemperatuur meten met een sonde rectally geplaatst en aangesloten op het data-acquisitiesysteem.
- Na volledige verdoving wordt bereikt, intubate de dierlijke orotracheally met behulp van een plastic braunule van 20G, invoegen van het mondeling en duwen het in de luchtpijp onder visuele controle. Beginnen met mechanische ventilatie met behulp van een vaporizer van Isofluraan aangesloten op een muis-ventilator. Afhankelijk van het dier gewicht, de ventilatie zodanig aanpassen dat een ademhalingsvolume van 250-350 µL wordt bereikt.
- Om te verzekeren van volledige Analgesie, injecteren subcutaan 5 mg/kg lichaamsgewicht van de dieren carprofen. Het wordt aanbevolen dat Isofluraan concentratie worden gehouden tussen 1,3 tot 2,5% in zuurstof. Isofluraan concentratie kan handmatig worden aangepast afhankelijk van de fase van de procedure.
3. Chirurgische Procedures
- na volledige narcose en Intubatie wordt bereikt, voeren een middellijn huid incisie aan de hals met een scherpe fijne schaar, spieren op een botte manier te scheiden en bloot de juiste halsslagader en de linker halsslagader. Tijdens de voorbereiding, coaguleren kleine vaartuigen met behulp van een veterinaire coagulator verbonden met bipolaire pincet om minimaal bloedverlies.
- Na de voorbereiding van de jugular schepen, afbinden cranially het distale segment van de linker gemeenschappelijke halsslagader te zijn met behulp van 8-0 zijde hechtingen bifurcatie.
- Verbinden de distale einde van een canule 27 G aan de arteriële instroom buis met behulp van een siliconen connector (0,5 mm ID, 1 mm OD), plaats 8-0 zijde hechtdraad slip knots op het proximale segment van de slagader, en steek het uiteinde van de canule in de halsslagader.
- Na de correcte plaatsing van het uiteinde van de canule, verder het uiteinde van de canule zodat zij 3-4 mm proximally tot de aortaboog bevat. Het uiteinde van de canule door beveiligen met 8-0 zijde knopen bevestigen.
- Using microchirurgische Tang en schaar, bot en scherpe dissectie uitvoeren, bloot de juiste halsslagader door botte voorbereiding van weefsel lateraal naar de musculus sternocleidomastoideus, dicht bij het sleutelbeen, en plaats een 8-0 zijde knoop aan het distale eind en een 8-0 lus proximale eind.
- Na Afbinding van het distale deel van de halsslagader, plaatst u het uiteinde van de veneuze canule in de juiste halsslagader en de vorderingen op weg naar de juiste atrium en beveiligen met behulp van de zijde knoop. Voor optimale veneuze terugkeer, het mogelijk moet vooraf de veneuze tip in het rechterventrikel.
- Zodra de juiste canule positie is bereikt, verrichten systemische heparinization door toevoeging van 2,5 IU heparine per gram de dierlijke lichaamsgewicht via directe intraveneuze injectie in de halsslagader.
- Voor real-time invasieve druk monitoring, cannulate de linker femorale slagader. De liesstreek bloot en voorzichtig het scheiden van de gemeenschappelijke femorale slagader van de femorale ader en femur zenuw onder 25 X vergroting.
- Ligate het distale deel van de femorale slagader. Tijdelijk occlude het proximale deel met een slip-knoop en maak een kleine incisie op de voorste muur met behulp van micro-pincet.
- Daarna een 1 Fr polyurethaan canule invoegen de femorale slagader en veilig met een zijde 10-0 hechtdraad. Deze canule wordt gebruikt voor het uitpakken van bloedmonsters voor gas bloedwaarden.
- Na de succesvolle plaatsing van de arteriële en veneuze cannulas, cardiopulmonale bypass te initiëren door te draaien op de pomp. De tijd tussen intubatie starten van CPB is ongeveer 45 min. Start met een debiet van 0,5 mL/min, afhankelijk van systemische druk metingen, en verhoging van de bloedstroom binnen 2 min tot full-flow (4-6 mL/min) door het verhogen van het toerental van de pomp.
- Onder volledige controle, het uitvoeren van een bovenste sternotomy met behulp van scherpe schaar vanaf het manubrium en 5 mm in de caudal richting gaan. Stollen de sternale randen onmiddellijk om te voorkomen bloeden. De aortaboog bloot door te trekken van de juiste halsslagader in de craniale richting.
- Voor optimale controle, gratis omtrek de aortaboog van de zwezerik en de omringende weefsel te vergemakkelijken klemmen. Plaats een 8-0 zijde lus rond de oplopende aorta. Als u wilt plaatsen de cross klem voor cardioplegia, trek de zijde lus in de craniale richting naar betere bloot de oplopende aorta.
4. Cardiopulmonale Bypass en bloed Gas-analyse
- voor bloed gas-analyse (BGA), glazen capillaire buizen te gebruiken voor het verzamelen van 60-90 µL arteriële bloed via de femorale slagader katheter.
- Gebruik van een kleine klem op de slang silicone en loskoppelen van de slang van de katheter. Release druk langzaam op de klem om gecontroleerde vullen van het capillair.
- Opnieuw koppelen de Siliconen slang aan de katheter. Capillaire buisjes invoegen de blood gas analyzer voor metingen op de volgende tijdstippen:
10 min na de inleiding van het CPB met ventilatie (BGA1)
na 25 min van CPB en 15 min van respiratoire arrestatie (BGA2)
na 40 min van CPB en 30 min van respiratoire arrestatie (BGA3)
na 55 min van CPB, 45 min van respiratoire en 20 min van hartstilstand (BGA4)
- onder stabiele CPB stroom, initia de luchtwegen arrestatie te door te stoppen met ventilatie.
- Na beëindiging van de ventilatie, de opwarming pad ingesteld op 28 ºC en start topisch koeling het dier tot 28 ºC lichaamstemperatuur binnen de eerste 20 min van respiratoire arrestatie met behulp van gaas gedrenkt in koud zout.
- Zodra een lichaamstemperatuur van 28 ºC is bereikt, en na een totaal van 30 min van respiratoire arrestatie, 0.3 mL 7,45% KCl oplossing beheren in het CPB circuit te leiden cardioplegia.
- Voor cross klemmen van de aorta, trekken de eerder geplaatste zijde lus (stap 3.10) in de craniale richting voor betere blootstelling en een micro-serrefine klem zetten het ascenderende deel van de aorta.
- Voeren een totaal van 60 min respiratoire arrestatie en 30 min van hartstilstand. Verwijder de klem micro-serrefine van de oplopende aorta tot reperfusie van het hart. Tegelijkertijd opnieuw ventileren en warm het dier tot 37 ° C.
- Na reperfusie is voltooid en het dier normothermia bereikt, beëindigen van het CPB door het uitschakelen van de pomp en blijven volgen van fysiologische metingen (b.v. lichaamstemperatuur, ECG, en invasieve bloeddruk) gedurende 20 minuten
- Aan het einde van het experiment, exsanguinate het dier onder volledige verdoving (5% Isofluraan) en het verzamelen van bloed en organen voor verdere analyse 14.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft de perfusie circuit, chirurgische ingrepen, en controle van fysiologische parameters tijdens CPB van een muis. Wanneer uitgevoerd door een goed geschoolde microsurgeon, de resultaten zijn consequent en reproducibly verkregen.
Te handhaven voldoende weefsel perfusie, wordt de gemiddelde arteriële druk altijd gehouden tussen 40 en 60 mmHg door aanpassing van de CPB-doorbloeding en het toevoegen van extra vo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben een volledig functionerende klinisch relevante model ontwikkeld van CPB in een muis. Met meer dan dertig muizenstammen met cardiovasculaire ziekten, zou ons model een uitgangspunt voor de ontwikkeling van nieuwe prospectieve protocollen aan CPB gerelateerde. Bovendien, als gevolg van de overvloed van muis-specifieke reagentia en knock-out-out muizen, dit model kan alleen geen vervanging van het huidige model van de rat van CPB maar vergemakkelijkt dissectie van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | prime volume, 1:1 met Tetraspan |
| Tetraspan 6% HES-oplossing | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | prime volume, 1:1 met Sterofundin |
| Heparine Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2.5 IU per ml prime-oplossing |
| NaHCO3 8,4% oplossing | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in prime-oplossing |
| KCL 7,45 % oplossing | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 0.1 mL voor cardioplegia |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/LK |
| 1 Fr PU-katheter | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | carotis |
| 2 Fr PU-katheter | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | jugulaire ader |
| Vasofix Safety katheter 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | orotracheale intubatie |
| 8-0 Zijde-draad gevlochten | Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA | 75290 | ligatuur |
| Isofluraan | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | narcose |
| CLINITUBES bloedcapillairen | Radiomed GmbH | 51750132 | bloedmonster 60 - 95 microliter |
| Veergesneden schaar - 6 mm bladen | Fine Science Tools GmbH | 15020-15 | instrumenten |
| Veergesneden schaar - 2 mm bladen | Fine Science Tools GmbH | 15000-03 | instrumenten |
| Halsted-Mosquito Hemostaat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | instrumenten |
| Dumont #55 Pincet | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | instrumenten |
| Castroviejo Micro Naaldhouder - 9 cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | instrumenten |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | instrumenten |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | instrumenten |
| MiniVent Ventilator voor muizen (Model 845) | Harvard Apparatus | 73-0044 | mechanische ventilatie |
| Isofluraan Verdamper Drager 19.1 | Drägerwerk AG & Co. KGaA | anesthesie 1,3 - 2,5% | |
| PowerLab data-verzamelapparaat 4/35 | ADInstruments Ltd, Nieuw-Zeeland | PL3504 | invasieve druk, ECG, temperatuur |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | bloedgasanalyse | |
| NMRI muizen | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | mannetje, 30 - 35 g, 12 weken oud, minimaal 1 week voor het experiment ondergebracht |
Referenties
- Edmunds, L. Cardiopulmonary Bypass after 50 Years. N. Engl. J. Med. 351 (16), 1601-1603 (2004).
- Goto, T., Maekawa, K. Cerebral dysfunction after coronary artery bypass surgery. J. Anesth. 28 (2), 242-248 (2014).
- Uysal, S., Reich, D. L. Neurocognitive outcomes of cardiac surgery. J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 27 (5), 958-971 (2013).
- Ballaux, P. K., Gourlay, T., Ratnatunga, C. P., Taylor, K. M. A literature review of cardiopulmonary bypass models for rats. Perfusion. 14 (6), 411-417 (1999).
- Jungwirth, B., de Lange, F. Animal models of cardiopulmonary bypass: development, applications, and impact. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 14 (2), 136-140 (2010).
- Günzinger, R., et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol. 102 (6), 508-517 (2007).
- Waterbury, T., Clark, T. J., Niles, S., Farivar, R. S. Rat model of cardiopulmonary bypass for deep hypothermic circulatory arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (6), 1549-1551 (2011).
- Schnoering, H., et al. A newly developed miniaturized heart-lung machine-expression of inflammation in a small animal model. Artif. Organs. 34 (11), 911-917 (2010).
- Kim, J., et al. The responses of tissues from the brain, heart, kidney, and liver to resuscitation following prolonged cardiac arrest by examining mitochondrial respiration in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016, (2016).
- Shappell, S. B., Gurpinar, T., Lechago, J., Suki, W. N., Truong, L. D. Chronic obstructive uropathy in severe combined immunodeficient (SCID) mice: lymphocyte infiltration is not required for progressive tubulointerstitial injury. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (6), 1008-1017 (1998).
- Majzoub, J. A., Muglia, L. J. Knockout mice. N. Engl. J. Med. , 904-907 (1996).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ. Res. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc. Pathol. 15 (6), 318-330 (2006).
- Iurascu-Gagea, M., Craig, S. Euthanasia and necropsy. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster, and other rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press (Elsevier). 117-141 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
