Engraftment van de tumor in een muismodel van Xenograft van menselijke mantel cel lymfoom

Samenvatting

Mantel cel lymfoom (MCL) is een moeilijk te behandelen stoornis van de B-cel en het is even moeilijk vast te stellen een muismodel van xenograft van primaire MCL te bestuderen en ontwikkelen van therapeutics. Hier beschrijven we de succesvolle invoering van MCL xenografts bij muizen om te helpen begrijpen van de onderliggende biologie.

Samenvatting

B-lymfocyten zijn belangrijke spelers in de immuun cel verkeer en ze vooral thuis van en wonen in de lymfoïde organen. Terwijl normaal B cellen slechts verspreiden wanneer gestimuleerd door T-lymfocyten, oncogene B cellen overleven en autonoom uit te breiden in ongedefinieerde orgel niches. Mantel cel lymfoom (MCL) is een dergelijke stoornis van de B-cel, waar het tarief van de mediane overleving van patiënten is 4-5 jaar. Dit vraagt om de behoefte aan doeltreffende mechanismen die de homing en engraftment van deze cellen worden geblokkeerd teneinde het voortbestaan en de levensduur van patiënten. Daarom is het streven naar het ontwikkelen van een xenograft muismodel voor het bestuderen van de werkzaamheid van MCL therapeutics door het blokkeren van de homing mechanisme in vivo van het allergrootste belang. Ontwikkeling van dierlijke ontvangers voor menselijke cel xenotransplantatie vroege fase drugs testen zijn lang uitgeoefend, zoals relevante preklinische Muismodellen zijn cruciaal voor het scherm nieuwe therapeutische agenten. Deze diermodel is ontwikkeld om te voorkomen dat menselijke graft afwijzing en om een model voor ziekten bij de mens kan, en het een uiterst nuttig hulpmiddel te bestuderen van de progressie van de ziekte van verschillende lymfoom typen en preklinische testen van kandidaat-geneesmiddelen voor hematologic maligniteiten, zoals MCL. We een muismodel van xenograft die zal dienen als een uitstekend middel om te bestuderen en ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen voor MCL opgericht.

Inleiding

Lymfocyten door de natuur een belangrijke rol spelen in de immuun toezicht en lymfocyt mensenhandel is een cruciale stap in de montage van antigeen specifieke immuniteit^1,2. Dit proces omvat migratie van naïeve T lymfocyten van de thymus naar de bloedstroom, en vandaar naar secundaire lymfoïde organen, met inbegrip van lymfklieren, Peyer de patches, of milt, waar ze elkaar ontmoeten cognaat antigenen. De B-lymfocyten onderscheiden in het beenmerg en in de follikels van secundaire lymfoïde organen³als naïef cellen migreren. Sommige van deze B-cellen antigeen met hun receptor binden en worden geactiveerd door specifieke T-cellen. Proliferatie en differentiatie van deze B-cellen duwt de niet-geactiveerde, naïef B-cellen in de zone van de mantel van de follikel. Geactiveerde cellen kunnen dan onderscheid worden gemaakt in het geheugen B cellen, die het lichaam patrouilleren, of oudere in immunoglobulin afscheidende plasmacellen die naar het beenmerg^{4 migreren}.

MCL treedt op als naïef B lymfocyten in de mantel zone tot een tumor omvormen. Deze cellen van het lymfoom bevinden zich in de communicatie van de lymfoïde organen en vermenigvuldigen onafhankelijk van specifieke T-lymfocyten controle. Echter, in een bepaalde fase van dichtheid ze ontsnappen uit deze niche en recirculate in de bloedbaan op zoek voor niches in andere organen. Gezien de complexiteit van celadhesie-moleculen en de promiscuïteit van chemokines en hun receptoren, het mechanisme van deze cellulaire mensenhandel in vivo slecht wordt begrepen en daarom belemmert therapie. Nieuwe methoden nodig zijn om effectief blokkeren dit migratieproces om te voorkomen dat de cellen van het lymfoom B bereiken van nieuwe microenvironments.

MCL is één van de meest moeilijk te behandelen van B-cel maligniteiten. De ontwikkeling van een neoplastische fenotype van MCL is het resultaat van een meerstaps cascade, gekenmerkt door de acquisitie van unieke biologische eigenschappen. Op het moment van diagnose presenteren de meeste patiënten (70%) al met een gedissemineerde ziekte, met een meerderheid van gevallen extranodal betrokkenheid in de milt, het beenmerg en/of de gastro-intestinale tractus^5,6tentoonstellen. Bij behandelde patiënten is herval door resistente tumoren binnen een paar jaar gebruikelijk, hoewel conventionele chemotherapie hoge kwijtschelding tarieven op korte termijn^{7,8 induceert}. Hier presenteren we een nieuw model van de ziekte die kan helpen bij het begrijpen van de MCL verspreiding en de onderliggende biologie: we vastgesteld een menselijke MCL xenograft muismodel dat afkomstig van de primaire tumorcellen van patiënten is. Wij hopen dat dit model helpen zal ontwikkelen van therapeutische strategieën MCL verspreiding tegen te gaan, en eventueel nieuwe klinische perspectieven bieden voor optimale diagnose en behandeling van recidiverende patiënten.

Protocol

De menselijke bloedmonsters werden gebruikt volgens de procedures die zijn goedgekeurd door de lokale ethische en menselijke experimenten comités van het universitair ziekenhuis van Genève.

Dierlijke procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de institutionele ethisch comité van Animal Care in Genève, Zwitserland en de kantonnale Veterinair Bureau (autorisatienummer: GE/26/15).

1. bereiding van primaire perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) door dichtheid verlopende scheiding

Opmerking: 3-5 mL van perifeer bloed is verkregen uit patiënten presenteren met MCL in een leukemische fase. De diagnose was opgericht volgens de standaard diagnostische criteria voor stroom cytometry (CD5 +, CD23−, CD200 +, monoklonaal B-celpopulatie), en vervolgens bevestigd door de aanwezigheid van de chromosomale translocatie t(11;14) en overexpressie van cycline D1. In alle gevallen monoclonal B-cellen gevormd voor > 90% van de totale B-celpopulatie. De resterende cellen waren voornamelijk monocyten en sommige T-cellen.

1. Verdun (1:1) 5 mL bloedmonster MCL met 5 mL Roswell Park Memorial Instituut voedingsbodem 1640 (RPMI) (figuur 1A).
2. Omkeren van de dichtheid kleurovergang media (Tabel of Materials) meerdere malen vóór gebruik om homogenisatie van het mengsel.
3. Voeg 5 mL van de kleurovergang media dichtheid in een tube van 15 mL centrifuge met behulp van een pipet aspirator.
4. Zachtjes laag het bloedmonster van het verdunde op de dichtheid kleurovergang media in de centrifugebuis van 15 mL met behulp van een aspirator (het bloed dichtheid kleurovergang media verhouding moet 2:1, bijvoorbeeld, 10 mL bloed tot 5 mL van de kleurovergang media dichtheid). Worden moet gewaakt om niet mix de twee lagen (figuur 1B, C).
5. Centrifugeer het monster bij 400 x g gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur met de remmen van de centrifuge uitgeschakeld.
6. Voorzichtig de middelste laag (witachtige, dunne ring gemarkeerd met een pijl (Figuur 1 d, E)) met behulp van een steriele Pipet van Pasteur, gecombineerd met de mononucleaire cellen en ze vervolgens overbrengen naar een schone buis.
7. Wassen van mononucleaire cellen
   1. Schatten van de omvang van de overgedragen celsuspensie en toevoegen aan het 3 delen van steriele 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% bovien serumalbumine (BSA).
   2. Meng de opschorting door pipetteren op en neer meerdere malen.
   3. Centrifugeer de schorsing bij 400-500 x g gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Verwijder het supernatant voor het verkrijgen van de cel pellet en herhaal nogmaals het wassen stap.
   5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in het gewenste volume, bijvoorbeeld, 1 of 2 mL PBS.
   6. Het aantal cellen door een geautomatiseerde cel teller of handmatig met behulp van een hemocytometer (Neubauer kamer).

2. de verrijking van B-cellen door B-cel negatieve selectie

1. De cellen in PBS om een eindconcentratie van 50 x 10⁶ cellen/mL verdund.
2. De cellen overbrengen in een 5 mL ronde onderkant polystyreen buis. Voeg 100 µL van antilichaam cocktail uit de B-cel verrijking kit 2 ml celsuspensie, en meng zachtjes door pipetteren op en neer (Figuur 2-1).
3. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
4. Kort vortex de magnetische deeltjes voorziet in de B-cel verrijking kit 30 s (Figuur 2-2). Voeg 150 µL van de magnetische deeltjes tot 2 mL van het monster.
5. Incubeer het monster voor een andere 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Het monstervolume brengen door 2,5 mL met 1 x PBS met 2% foetaal kalfsserum (FCS) en 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Plaats de buis in de magneet en Incubeer de buis voor een ander 3-5 min (Figuur 2-3).
7. Halen van de magneet met de buis op zijn plaats, en in een continue beweging, decanteren in de buis zodat de verrijkte celsuspensie wordt verzameld in een verse buis (Figuur 2-4). De cellen door een geautomatiseerde cel teller of handmatig met behulp van een hemocytometer te verkrijgen van de totale opbrengst van de B-cellen tellen.
   Opmerking: Het rendement is meestal ~ 10⁵ B cellen/mL voor normale B-cellen en 5-50 x 10⁶ cellen/mL voor MCL.
8. Bevestiging van de zuiverheid van de verrijking van de B-cel
   1. Nemen ~ 50.000 cellen en Incubeer de cellen met anti-CD19/CD20 antilichamen (1:20 verdunning) en anti-CD45 antilichaam gekoppeld aan verschillende fluorochromes (1:10 verdunning) bij kamertemperatuur gedurende 15-30 minuten.
   2. Met 1 mL 1 x PBS + 1% BSA wassen, centrifugeren van de cellen bij 400-500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cellen in ~ 200 µL van PBS.
   3. De celsteekproeven verwerven door stroom cytometry en te analyseren voor de zuiverheid van B-cellen. Zuiverheid is meestal > 90% door deze methode (Figuur 3).

3. ontwikkeling van het Model van de muis Xenograft

1. Schorten ~ 40-60 x 10⁶ cellen in 150-200 µL van 1 x PBS (volume nodig is om te injecteren per muis).
2. 150 µL van de celsuspensie intraveneus injecteren (i.v.) in elke ader van de staart van 6-7 week oud immunodeficiëntie knik scid gamma (NSG) muizen ongeacht het geslacht (figuur 4A).
3. Laat de muizen te ontwikkelen van menselijke lymfoom ~ 10 weken.
   Opmerking: Primaire menselijke lymfoom cellen veel langer duren om te ontwikkelen van de tumor ten opzichte van menselijke lymphoma cellijnen (~ 3 weken).
4. Wanneer de dieren beginnen te symptomen vertonen van een dodelijke ziekte als gewichtsverlies, offeren gegolfde haar, verminderde activiteit, hind-limb verlamming, enz., de muizen door CO₂ verstikking gevolgd door cardiale hart punctie te verkrijgen van bloed.
5. Verzamel verschillende organen zoals beenmerg, milt en lever door het ontleden van de muizen en verzamelen van perifeer bloed door het bloed van het hart tekenen op het moment van offer voor tumor engraftment analyse (figuur 4B -F).

4. chimerism analyse van Tumor cel geaccepteerd in verschillende organen

1. Na het verzamelen van de verschillende organen, verwerken door mechanische verstoring voor het genereren van eencellige schorsingen na lysis van de rode bloedcellen (RBC) met behulp van 200 µL 1 x ammoniumchloride kalium buffer voor bloed en het beenmerg, 500 µL voor milt en 2 mL voor lever .
2. Tellen en vlekken van de cellen met behulp van menselijke B-cel specifieke antilichamen, dat wil zeggen, anti-CD19, anti-CD20 en anti-CD45.
   Opmerking: NSG muizen geen B-cellen en vandaar p.a., cellen zijn gekleurd met menselijke specifieke B-cel markeringen.
3. Het analyseren van de cellen die elk orgel door stroom cytometry afgeleid door gating op B cellen (CD19 + CD20 +, CD45 +).
4. Kwantificeren van de werk tumorcellen in verschillende organen afgeleid van MCL geïnjecteerd muizen op basis van de gated cellen zoals aangegeven in stap 4.3 (Figuur 4 g).
   Opmerking: Zie Tabel van materialen voor details.

Resultaten

Het manuscript wordt beschreven van een geoptimaliseerde protocol voor de succesvolle ontwikkeling van een muismodel van xenograft voor engraftment van cellen van het MCL. Voorbereiding van een zuivere celpopulatie (in dit geval MCL cellen), is zeer cruciaal voor het ontwikkelen van succesvolle MCL xenografts. Figuur 1 geeft de voorbereidende stappen voor mononucleaire cel isolatie uit van MCL patiënt bloed door dichtheid verlopende scheiding. De mononucleair...

Discussie

Klinische proeven zijn mogelijk voor drugs die zijn in een vergevorderd stadium van ontwikkeling, maar kunnen niet worden gebruikt voor drugontdekking. Inspanningen voor de ontwikkeling van dierlijke ontvangers voor menselijke cel xenotransplantatie om te testen van de vroege fase drugs zijn lang uitgeoefend. Hier presenteren we een dierlijk model dat vermijdt menselijke graft afwijzing en een model voor ziekten bij de mens, zoals MCL tot stand kan brengen. Dit is op dit moment een van de modernste xenograft model te bes...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ficoll-paque media	GE Healthcare	17-1440-02	voor scheiding van mononucleaire cellen
RPMI Medium 1640	Gibco-Life technologies	61870-010	voor verdunning van bloedmonster
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	wassen van cellen
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A8412	voor bereiding van PBS met 1% BSA gebruikt bij het wassen van cellen tijdens isolatie
CD19-APC700	Beckman Coulter	B49212	menselijk pan-B cel marker
CD20-APC	Beckman Coulter	A21693	menselijk pan-B cel marker
CD20-ECD	Beckman Coulter	IM3607	menselijk pan-B cel marker
CD5-PC 5.5	Beckman Coulter	PN A70203	menselijk T cel marker
CD23-PE	Pharmingen	555711	Celoppervlak-eiwit typisch afwezig in MCL
CD45 KO	Beckman Coulter	B36294	Pan-leukecyten marker
CD200-PE	Pharmingen	552475	Celoppervlak-eiwit typisch afwezig in MCL
NOD scid gamma (NSG) muizen	Charles River Laboratories	5557	gebruikt voor het ontwikkelen van MCL xenografts in deze studie
Easy sep Human B cell verrijkingskit	Stem cell technologies	19054	gebruikt om B-cellen te verrijken om pure cellen te verkrijgen voor injectie in muizen
FACS	Beckman Coulter	Navios	gebruikt om MCL-monster te karakteriseren en de organen te bestuderen voor MCL-aanplant
1X ammonium chloride potassium buffer			rode bloed lysis buffer (NH4Cl 8.024 mg/l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA.Na2·2H2O 3.722 mg/l )