Methodenartikel

Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

DOI:

10.3791/56025

⸱

31 juli 2017

 , 
1Biomedical Engineering, University of Virginia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd ontwikkeld om tumormicro-milieukomponenten kwantitatief te identificeren bij glioblastoom-patiëntresecties onder toepassing van chromogene immunohistochemie en ImageJ.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de groeiende interesse in de micro-omgeving van de tumor, ontwikkelden we een methode om de micro-milieukomponenten specifiek te bepalen in patiëntenmonsters van glioblastoom, de dodelijkste en meest invasieve hersenkanker. Niet alleen zijn kwantitatieve methoden die gunstig zijn voor het nauwkeurig beschrijven van zieke weefsels, ze kunnen ook potentieel bijdragen tot een nauwkeuriger prognose, diagnose en de ontwikkeling van weefsel-gemanipuleerde systemen en vervangingen. Bij glioblastoom zijn gliale cellen, zoals microglia en astrocyten, onafhankelijk gecorreleerd met een slechte prognose gebaseerd op patholoog-gradering. Echter, de toestand van deze cellen en andere gliale celcomponenten is niet kwantitatief goed beschreven. Dit kan moeilijk zijn door de grote processen die deze glialcellen markeren. Bovendien richten de meeste histologische analyses op het algehele weefselmonster of alleen in het grootste deel van de tumor, in tegenstelling tot het kwantificeren van kwantificaties op basis van regio's witHin het zeer heterogene weefsel. Hier beschrijven we een methode voor het identificeren en kwantitatief analyseren van de populaties van gliale cellen in het tumorvolume en de aangrenzende gebieden van tumorresecties van glioblastoompatiënten. We gebruikten chromogene immunohistochemie om de gliale celpopulaties bij patiënten tumor resecties en ImageJ te identificeren om de percentuele dekking van kleuring voor elke gliale populatie te analyseren. Met deze technieken kunnen we de glialcellen beter omschrijven doorheen de regio's van de glioma tumor micro-omgeving.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en kwaadaardige hersenkanker, wordt gekenmerkt door een zeer diffuse invasie van het primaire tumorvolume in het omliggende gezonde hersenparenchym 1 , 2 . Deze diffuse invasie maakt de tumor bijzonder moeilijk om volledig te resecteren en de invasieve kankercellen die post-therapie blijven, is de meest voorkomende reden voor onvermijdelijk herhaling 2 , 3 , 4 . Vroeger vonden we de diffuse glioma-celinval te remmen om therapeutisch voordelig te zijn 5 , maar weinig bekend is over de complexe mechanismen die bijdragen aan GBM-invasie. De tumor micro-omgeving, of weefsel rondom de kanker, is betrokken bij de progressie van tumoren bij meerdere kankers 6 , 7 . De glioblastoom tumor micro-omgeving, in pArticulair, is relatief onderschat en is uniek complex, het vormen van meerdere gliale cellen, zoals astrocyten, microglia en oligodendrocyten, evenals extracellulaire matrix, oplosbare factoren en biofysische factoren. Experimenteel zijn astrocyten en microglia aangetoond dat de progressie van gliomen en invasie 8 , 9 , 10 toeneemt, maar de samenstelling van alle gliale cellen in de micro-omgeving van de menselijke hersenen is onbekend.

We hebben eerder laten zien dat micro-componenten de overleving van patiënten kunnen voorspellen door cellulaire componenten van de glioblastoom micro-omgeving kwantitatief te analyseren en onze analyses te integreren in een proportioneel risico model 11 . Hier beschrijven we de kwantitatieve analysemethode voor het identificeren van de populaties van glialcellen binnen het tumorvolume en aangrenzende gebieden van tumorresecties van glioblastoom patients. We gebruikten chromogene immunohistochemie om de gliale celpopulaties en ImageJ te identificeren om de procentuele dekking van kleuring voor elke gliale populatie te analyseren. Het beoordelen van de procentuele dekking creëert een simpele meting voor het bepalen van de morfologische verschillen in cellen, met name die welke beïnvloed zijn door interacties met kankercellen. Eerdere studies voor het kwantificeren van histopathologische kleuring gebruiken standaard kleuring zoals hematoxyline en eosin 12 of Masson's trichroom 13 , die niet profiteren van de specificiteit van immunohistochemische kleuring op antilichamen. Onze methode is ontwikkeld om de glialpopulaties rechtstreeks te kwantificeren binnen glioblastoom patiënten tumor resecties, die we willen gebruiken om de complexe glioblastoom micro-omgeving te verhelderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol identificeert cellulaire componenten in formaline-gefixeerde paraffine embedded (FFPE) monsters, zoals gebruikelijk voor gebonden klinische patiëntmonsters. Paraffin embedding zorgt voor het beste onderhoud van de cel- en weefselmorfologie en heeft ook een betere levensduur van secties. De monsters die voor deze analyse werden gebruikt werden toegankelijk via de Universiteit van Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Patiëntmonsters werden geselecteerd door een neuropatholoog op basis van een definitieve diagnose van glioblastoom (astrocytoma, WHO grade IV) die tussen 2010 en 2013 aan de Universiteit van Virginia tumorresecties had voltooid en vóór deze analyse 11 werden ontdekt .

1. FFPE Sample Deparaffinization and Rehydration

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is specifiek voor FFPE-monsters. Terwijl paraffine-ingebedde monsters nuttig kunnen zijn voor deze analyse vanwege het behoud van cellulaire en tMorfologie uitmaken, deze analyse kan ook gedaan worden met bevroren secties. Als u bevroren delen gebruikt, kan dit gedeelte worden weggelaten en ga rechtstreeks naar chromogene immunohistochemie.

  1. Doe de volgende wasjes gedurende 5 minuten: Xyleen, Xyleen, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, Geïoniseerd water, Gegioniseerd water

2. Antigenherwinning

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is nodig om methyleenbruggen te vormen die worden gevormd tijdens formalinfixatie van FFPE-monsters en blootstelling van antigeenplaatsen voor antilichamen om te binden.

  1. Verdun Tris-gebaseerde hoge pH antigeen ontmaskerende oplossing bij fabrikant aanbeveling in gedistilleerd water.
  2. Voer warmte gemedieerde antigeen herwinning met behulp van een magnetron. Andere vormen van warmtegemedieerde terugwinning (zoals drukkoker, plantaardige stoomboiler of kokend water) zouden ook volstaan.
    1. Voeg de verdunde ontmaskeeroplossing toe in een niet-afgesloten magnetronvaartuig. Plaats de glijbanen in het vat. Plaats de glijbanen in de magnetron.
    2. Kook gedurende 20 minuten bij hoge kracht. Bewaar vloeistofniveaus voor verdamping en vul eventueel met gedestilleerd water aan.
  3. Laat de monsters 1 uur bij kamertemperatuur in de oplossing afkoelen.

3. Chromogene immunohistochemie

  1. Omtrek weefselmonster met een hydrofobe pen om het volume van de reagentia die nodig zijn om het monster te dekken te minimaliseren.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat weefselmonsters gehydrateerd zijn en laat ze niet uitdrogen, omdat dit de effectiviteit op de vlek beïnvloedt.
  2. Pipet genoeg permeabilisatieoplossing (Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) + 0,01% Triton-X) om het weefselmonster te dekken (typisch ongeveer 100 - 200 μl).
  3. Verwijder en verwijder oplossing en herhaal stap 3.2.
  4. Incubeer monsters bij kamertemperatuur met blokkerende oplossing (2,5% paars serum + permeabilisatie oplossing).
  5. Incubeer monsters overnacht in 4 ºC met primaire antilichamen verdundIn blokkerende oplossing.
    OPMERKING: Alle primaire antilichamen die hier worden gebruikt worden verdund op 1: 200, maar optimale verdunningen kunnen worden bepaald met behulp van seriële verdunningen, beginnend met de fabrikant aanbeveling. Gedetailleerde informatie over antilichamen gebruikt in dit protocol is eerder gepubliceerd 11 .
  6. Detecteer primaire antilichamen met behulp van een mierikswortelperoxidase polymeer reagens dat overeenstemt met het primaire antilichaam gastheer dier, in navolging van de fabrikant protocol.
  7. Pipet genoeg permeabilisatie oplossing om het weefselmonster te bedekken en gedurende 5 minuten te incuberen.
  8. Verwijder en verwijder oplossing en herhaal stap 3.7.
  9. Incubeer dia in 0,3% H 2 O 2 in 1 x TBS gedurende 15 minuten.
  10. Ontwikkel monsters met een substraat peroxidase diaminobenzidine (DAB) gedurende 2 - 10 minuten totdat de gewenste vlekintensiteit bereikt wordt.
  11. Contrasterende monsters om celkernen te identificeren, zoals bij hematoxyline, volgend fabrikantprotocol.
  12. Ontwater de monsters met 100%Ethanol en xyleen.
  13. Steek monsters permanent op met montagemedia.

4. Regio's van belangidentificatie

  1. Beeldschermen onder brightfieldmicroscopie die geschikt zijn voor hoge resolutiebeelden.
    OPMERKING: Gebruik beeldcamera-componenten met een resolutie van minimaal 20x.
  2. Verplaats camera naar specifieke regio's van belang door weefselmonsters.
  3. Bewaar afbeeldingen als TIFF-bestanden voor kwantificering.

5. Beeldanalyse

  1. Open afbeeldingen in ImageJ voor kwantificering van de procentuele dekking.
  2. Gebruik de invoegtoepassing Threshold Color om paars kleur uit hematoxyline-gekleurde kernen te verwijderen.
  3. Beeld omzetten naar 8-bits.
  4. Voeg drempel toe zonder donkere achtergrond.
  5. Procesafbeelding met een van de 17 vooraf ingestelde ImageJ-drempelfilters ( dwz MaxEntropy), zodat alleen DAB-gebrandde gedeelten in de drempel zijn opgenomen.
    OPMERKING: Selecteer het optimale voorgeladen drempelfilter dat minimaliseertHet opnemen van achtergrondkleuring. Dit kan afhangen van de kwaliteit van kleuring en specificiteit van antilichaam. Gebruik dezelfde drempel voor alle technische replicaten binnen elke patiëntmonster.
  6. Pas drempel toe.
  7. Meet percentage gebied van gedrempeld beeld.
  8. Gemiddelde percentage dekking voor meerdere gebieden binnen elke steekproef.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor deze analyse werden twee regio's van belangen binnen onze tumorresecties - het primaire tumorvolume en de aangrenzende gebieden, hoofdzakelijk samengesteld uit gezond weefsel met diffuse invallende kankercellen ( Figuur 1A , 1B ) - geïdentificeerd door samenwerkende neuropathologen op hematoxyline en eosin-gekleurde patiënt samples. Binnen elk patiëntmonster werden positieve kleuring voor astrocyten ( Figuur 1C<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze methode die hier wordt voorgesteld is een kwantitatieve aanpak voor het analyseren van histologische monsters die zijn gekleurd met behulp van traditionele chromogene immunohistochemie. Huidige methodologie voor dit soort analyses bevat soortgelijke kleurenprotocollen, gevolgd door gradering door onafhankelijke pathologen. Deze methode is betrouwbaar, maar voor een aantal toepassingen is een nauwkeuriger inzicht in de cellulaire samenstelling nodig, zoals beter inzicht in de heterogeniteit in verband met tumoren en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Drs. Fahad Bafakih en Jim Mandell voor het verkrijgen en identificeren van patiëntmonsters, Garrett F. Beeghly voor hulp bij immunohistochemie, en de Biorepository and Tissue Research Facility, de Histologie Core van het Cardiovasculaire Research Center en de Biomoleculaire Analysefaciliteit aan de Universiteit van Virginia voor hulp bij Voorbeeldverwerving, immunohistochemie en beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
XyleenFisher ChemicalX3P
Ethanol
High pH antigeen onthullende oplossingVector LabsH-3301
TBS
Triton-XAmresco9002-93-1
Paarden serum
Anti-ALDH1L1 abcam ab56777
Anti-Iba1 abcam ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specifiek Eiwit1 abcam ab53041
ImmPRESS anti-geitVector LabsMP-7405
ImmPRESS Universeel (anti-muis/konijn)Vector LabsMP-7500
WaterstofperoxideSigma Aldrich216763
ImmPACT DAB substraatVector LabsSK-4105
Hematoxyline contra-kleuringThermoScientific72404
Histochoice MontagemediumAmrescoH157-475
Aperio ScanscopeLeica Biosystems
Image ScanscopeLeica Biosystems
Super HT PAP PenResearch Products International195506

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  3. Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
  4. Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
  5. Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36(2012).
  6. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
  7. Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
  8. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
  9. Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
  10. Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
  11. Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
  12. Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
  13. Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
  14. Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
  15. Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
  16. Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
  17. Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
  18. Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
  19. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
  20. Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
  21. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
  22. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
  23. Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
  24. Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Glioblastoma Tumor MicroenvironmentChromogenic ImmunohistochemistryImageJ AnalysisGlial Cell QuantificationPatient Tumor ResectionsAntigen RetrievalPermeabilization SolutionPrimary AntibodiesDAB SubstrateHematoxylin Counterstain

Gerelateerde artikelen