We beschrijven een HPLC-gebaseerde methode voor de bepaling van N-acetylneuraminezuur en N-glycolylenuraminezuur in muizenlever en melk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bepaling van Sialic Acids in Lever en Melk Monsters van Wild-type en
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
CMAH (cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuurhydroxylase) is verantwoordelijk voor de oxidatie van cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuren bij zoogdieren. Echter, mensen kunnen cytidine monofosfaat-N-acetylneuraminezuur niet oxideren tot cytidine monofosfaat-N-glycolylneuraminezuur als gevolg van een primaire exon deletie van het CMAH gen. Om de effecten en implicaties van het ontbreken van CMAH-activiteit in meer detail te begrijpen, is een Cmah- knock- outmodel in muizen een grote interesse in basis en toegepast onderzoek. De analysemethode voor het bepalen van het fenotype van dit muismodel wordt hierin gedetailleerd beschreven en is gebaseerd op de detectie van zowel N-acetylneuraminezuur als N-glycolyleenzuurzuur in de lever en melk van wild-type en Cmah- knock- outmuizen . Endogene sialiczuren worden vrijgemaakt en afgeleid met o-fenylendiamine om fluorogene derivaten te genereren, die vervolgens met behulp van HPLC kan worden geanalyseerd. Het gepresenteerde protocol kan zijnOok aangevraagd voor de analyse van melk- en weefselmonsters uit verschillende andere herkomst, en kan van nut zijn om de voedings- en gezondheidseffecten van N-glycolylneuraminezuur te onderzoeken.
Inleiding
N-acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en N-glycolylneuraminezuur (Neu5Gc) zijn de meest voorkomende sialinezuren bij de meeste zoogdieren 1 . Hoewel het mogelijk is om Neu5Ac endogeen te synthetiseren, kunnen mensen niet Neu5Gc produceren door een primaire exon deletie op het CMAH gen dat codeert voor een CMP-Neu5Ac hydroxylase 2 , 3 . Dierlijke voedingsmiddelen kunnen echter voedingsbronnen zijn van Neu5Gc 4 , 5 , 6 , wat leidt tot de productie van anti-Neu5Gc antilichamen en leidt daarom t....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Procedures waarbij dieren betrokken zijn, zijn goedgekeurd door het Ethisch Comité van het Experimentele Dierscentrum van de Landbouwuniversiteit van Nanjing overeenkomstig de nationale richtlijnen voor experimentele dierenwelzijn (Ministerie van Wetenschap en Technologie, PR van China, 2006) bij de dieren in een SPF Faciliteit (toestemming ID: SYXK-J-2011-0037).
1. Cmah Knock-out Muis Model
- Gebruik wildtype C57Bl / 6 muizen van het Comparative Medicine Center van Yangzhou University (China).
OPMERKING: Cmah knock-out muizen werden gegenereerd op basis van de informatie die werd verstrekt uit eerdere
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een schematisch overzicht van de beschreven analysemethode is weergegeven in Figuur 1 en omvat de isolatie van sialinezuren uit melk- en levermonsters van wild-type en Cmah- knock-out mutantmuizen en de fluorescentiedivatisering en HPLC-analyse van deze componenten. Figuur 2 en Figuur 3 tonen representatieve HPLC chromatogrammen van afgeleide sialinezuren van melk- en levermons.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hierin gepresenteerde protocol laat de fenotypische beoordeling van homozygote Cmah- knock-out-muizen toe door de relatieve hoeveelheden Neu5Gc van melk- en levermonsters te analyseren en kwantificeren. De analyse werd uitgevoerd met behulp van een standaard HPLC setup met fluorescentiedetectie. De meest kritische stap van deze procedure is de bereiding van de anionuitwisselingszolen en het uitvoeren van de anionuitwisselingschromatografie; Om de hars goed te regelen en de juiste was- en elueringsf.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natuurwetenschappelijke Stichting van China (subsidie nummers 31471703, A0201300537 en 31671854 voor JV en LL) en het 100 Foreign Talents Plan (subsidienummer JSB2014012 tot JV).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot moet voldoende zijn |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | lege solid phase extractie kolommen |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | om de stroom van de SPE tube te stoppen |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | strakke pasvorm |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector voor HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
Referenties
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
