Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Samenvatting

Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel hulpmiddel voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties. Traditioneel hebben de meeste experimenten verticale gels gebruikt. Horizontale gels verschaffen echter verschillende voordelen, zoals de mogelijkheid om complexen te monitoren tijdens elektroforese. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese.

Samenvatting

Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel instrument van moleculaire biologie die extensief is gebruikt voor de biochemische analyse van RNA-eiwitinteracties. Deze interacties zijn traditioneel geanalyseerd met polyacrylamidegels die worden gegenereerd tussen twee glazen platen en monsters die verticaal worden geforoteerd. Polyacrylamide gels die in bakken worden gegoten en elektroforeseer horizontaal bieden echter verschillende voordelen. Bijvoorbeeld, horizontale gels die gebruikt worden om complexen te analyseren tussen fluorescerende RNA-substraten en specifieke eiwitten kunnen meerdere malen worden weergegeven als elektroforese vordert. Dit biedt de unieke mogelijkheid om RNA-eiwitcomplexen op verschillende punten tijdens het experiment te volgen. Daarnaast maakt horizontale gelelektroforese het mogelijk om veel monsters parallel te analyseren. Dit kan de tijdcursusproeven aanzienlijk vergemakkelijken en meerdere reacties tegelijk analyseren om verschillende componenten en condities te vergelijken. Hier prOvide een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties.

Inleiding

Elektroforetische mobiliteitsverschuivingsbepalingen (EMSA's) blijken een waardevol biochemisch instrument te zijn om specifieke eiwit-nucleïnezuurinteracties ^{1 , 2 , 3} te analyseren. Deze analyses kunnen belangrijke informatie verschaffen over de bindingsaffiniteit van eiwitten aan RNA of DNA ³ , de componentstochiometrie van nucleïnezuur-eiwitcomplexen ¹ en verschaffen belangrijke nieuwe inzichten over de bindingsspecificiteit van RNA bindende eiwitten via substraatconcurrentie experimenten ¹ .

De traditionele experimentele opstelling voor deze analyses bestaat uit het mengen van gezuiverd eiwit met een radioactief gemerkt RNA-substraat. De resulterende complexen worden vervolgens geanalyseerd met niet-denaturerende (inheemse) polyacrylamidegelen die tussen twee glazen platen worden gegoten, gevolgd door monsterelektroforese in een verticaal apparaat ³. Hoewel deze benadering extensief is gebruikt om belangrijke inzichten te verschaffen in de biochemische mechanismen die de binding van eiwitten tot nucleïnezuren onderbouwen, heeft het ook verschillende beperkingen. Deze basisstrategie heeft bijvoorbeeld een relatief lage doorvoer en het is niet gemakkelijk aan te passen voor toepassingen waarbij parallel bindende reacties nodig zijn. Bovendien is het bij het traditionele verticale apparaat uitdagend om meerdere keren complexen mogelijk te houden tijdens elektroforese ^{3 , 4} .

Hier presenteren we een aanpassing van de EMSA-analyse die gebruik maakt van inheemse polyacrylamidegels die worden gegoten in een flatbed apparaat, horizontale elektroforese en fluorescent gelabelde RNA substraten ^{4 , 5 , 6 , 7} . De opneming van deze relatief eenvoudige wijzigingen van de basis straTegy biedt een aantal sterke voordelen. In het bijzonder leent het horizontale platform formaat zich gemakkelijk om tientallen monsters tegelijkertijd ⁴ te analyseren. Ook voor sommige RNA-eiwitcomplexen, zoals die gevormd tussen het Bicaudal-C-eiwit en zijn RNA-substraatelektroforese in een horizontale gel, verschaft een verhoogd vermogen om afzonderlijke RNA-eiwitcomplexen op te lossen en deze te onderscheiden van het niet-gebonden RNA-substraat.

Protocol

1. Bereiding van de Horizontale Native Polyacrylamide Gel ⁴ .

1. Voorbereiding van de benodigde materialen.
   1. Voor het horizontale gelapparaat gebruik een gelendoos (37 cm x 24 cm) met een 27 cm x 21 cm lade en een capaciteit voor twee combinaties met 24 putjes. Deze installatie biedt in totaal 48 monsters die tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd.
   2. Bereid de volgende reagentia voor: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED en 10% APS (ammoniumpersulfaat).
2. Generatie van een 10% native acrylamide gel.
   1. Voeg in een 500 ml fles 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% acrylamide en water toe aan een eindvolume van 400 ml.
   2. Voeg 4 ml 10% APS en 400 μL TEMED toe. Goed mengen.
   3. Giet de mix in de horizontale gietbak en laat de gel 30 minuten polymeriseren. De gel zal ongeveer 2 cm dik zijn.
      OPMERKING: Gelegels kunnen snel in een dampkap werpenUp polymerisatie. Na polymerisatie blijft een dunne laag vloeistof boven op de gel.
   4. Giet de vloeistof af en spoel met rennende buffer. Verwijder de kam (en) zorgvuldig en spoel de putjes met rennende buffer met een spuit.
3. Bereiding van loopbuffer.
   1. Bereid 2 L van 1x TBE loopbuffer voor de gelkast. Verdun 400 ml 5XTBE met 1600 ml en meng. Plaats 1x TBE buffer in de koude kamer om af te koelen.
4. Voorloop van de gel
   1. Voeg 2 liter koudloopbuffer aan de gelkastoos toe en plaats de gel.
   2. Pre-run de gel bij 120 V gedurende 1 uur bij 4 ° C in een koude kamer. Bereid tijdens deze tijd de bindingsreactie.

2. Bindende reactie ⁸

1. 2.1.Perpareer de volgende reactiekomponenten.
   20 mM DTT
   10 mM BSA
   10 mM gist tRNAs
   5x bindingsbuffer (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20)
   100 nM fluoresceïne gelabelde RNA commercieel gekocht
   Geconcentreerd Bicaudal-C eiwit
   50% glycerol in met DEPC behandeld _H2O
   DEPC behandeld _H2O
2. Monteer de bindingsreactiekomponenten in een RNase-vrije microcentrifugebuis.
   1. Voeg bij de buis 5 μl 10 mM BSA, 5 μl 20 mM DTT, 5 μl 10 mM gist tRNAs, 10 μl 5x bindende buffer.
3. Voeg eiwit toe aan een eindconcentratie van 250 nM in 50 μl. Voeg water toe aan een eindvolume van 45 μl.
4. Voeg 5 μl fluorescent gemerkt RNA substraat toe. Gebruik een in de handel verkochte 3 'fluoresceïne gelabelde 32-nucleotide substraat.
5. Meng en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

3. Analyse van monsters op de natuurlijke horizontale polyacrylamide gel

1. Voeg bij elke reactie 15 μL 50% glycerol toe en meng zachtjes.
2. CarefuVoeg 30 μl van elke reactie op de gel toe. De hoeveelheid monster die in een enkele put kan worden geladen, varieert afhankelijk van de dikte van de gel en de grootte van de putten. We hebben geladen volumes tot 15 μL en zo veel als 45 μL in een enkele bron van gels gecreëerd met een 24-brons kam en gegoten tot een dikte van 2 cm.
3. Nadat u de stroomtoevoer aan de gelapparatuurschakelaar aan het stopcontact hebt aangesloten en de spanning aanpast. Run de gel in 4 ° C op 120 V.
   OPMERKING: Voor het horizontale gelapparaat komt dit overeen met ongeveer 5 V / cm. Voor het verticale gelapparaat is dit 16 V / cm.
   1. Om schade of bleken van het fluorescent gelabelde RNA te voorkomen, voer elektroforese in het donker.
   2. Variërende elektroforese tijden afhankelijk van de specifieke kenmerken van het RNA-eiwit complex dat wordt geanalyseerd.
      OPMERKING: Een belangrijk voordeel van de horizontale EMSA analyse is dat elektroforese kan worden gestopt, de gel afgebeeld en vervolgens de geIk kan terug in het apparaat worden geplaatst en elektroforese kan langer worden voortgezet.

4. Imaging de Gel

1. Analyse uitvoeren met elk instrument dat is ontworpen voor het detecteren en imaging van fluorescerende substraten.
2. Plaats de gel op de imager.
3. Beeldinstellingen aanpassen. Voor fluoresceine-gelabelde RNA liganden, gebruik de volgende instellingen: FAM (golflengte 473 nm), 750 fotomultiplierspanning (PMT), 100 μm pixelgrootte.
4. Scan de gel om de afbeelding vast te leggen.

Resultaten

Om de kracht en de veelzijdigheid van de horizontale inheemse gelelektroforese te demonstreren hebben we de binding van het Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) eiwit geanalyseerd aan een fluorescent gemerkt RNA dat een Bicc1 bindingsplaats bevat. Bicc1-eiwitten functioneren als mRNA-specifieke translatie-repressors om de beslissingen van het celfeest tijdens de moederstadia van dierlijke ontwikkeling ^{9 , 10 ,}

Discussie

Inheemse polyacrylamidegelen zijn een waardevol hulpmiddel om eiwit-RNA-interacties te onderzoeken en traditioneel worden deze gels verticaal ^{2 , 3} elektroforeseert. Wij hebben een wijziging van het protocol gebruikt dat de inheemse polyacrylamide gels creëert en horizontaal ^{1 , 4 , 6 , 7 , 15} elektro...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Horizontal Gel Box	OWL	N/A	Product niet meer gemaakt. Soortgelijke gelboxen zijn te vinden bij Thermo Scientific, A-serie gelboxen. Catalogusnummer: A2-BP
24-well grote horizontale gelelektroforese kammen	OWL	N/A	Product niet meer gemaakt. Soortgelijke gelboxen zijn te vinden bij Thermo Scientific, A-serie gelbox kammen. Catalogusnummer: A2-24C
Powerpac 300	Bio-Rad	1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell	Bio-Rad	165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis	IBI	IB70015
TEMED	IBI	IB70120
APS	IBI	IB70080
Yeast tRNAs	Ambion	AM7119
Fluoresceïne gelabeld RNA	IDT	N/A	Bestelling kan op maat worden gemaakt naar lengte en gewenste sequentie
EDTA tetranatriumzout hydraat	Sigma-Aldrich	E5391-1KG
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-500G
Tris Base Ultrapure	US Biological	T8600
Boorzuur	Fisher Scientific	BP168-500
Kaliumchloride	Fisher Scientific	BP366-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
DEPC	Sigma-Aldrich	1609-47-8
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	3483 12 3
Rundserumalbumine (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8