Fase gedrag van geladen blaasjes onder voorwaarden van symmetrische en asymmetrische oplossing bewaakt met fluorescentie microscopie

Samenvatting

Experimenten op fase gescheiden reus unilamellar blaasjes (GUVs) worden vaak verwaarloosd fysiologische oplossing voorwaarden. Dit werk presenteert benaderingen om te bestuderen van het effect van hoge-zoutgehalte buffer op vloeistof-vloeistof fasenscheiding in geladen multicomponent GUVs als een functie van trans-membraan oplossing asymmetrie en temperatuur.

Samenvatting

Giant unilamellar fase gescheiden blaasjes (GUVs) exposeren naast vloeistof-besteld en vloeistof-ontregelde domeinen zijn een gemeenschappelijke biofysische instrument te onderzoeken van de lipide vlot hypothese. Tal van studies, verwaarlozing echter de gevolgen van fysiologische oplossing. Op die account presenteert het huidige werk het effect van hoge-zoutgehalte buffer en trans-membraan asymmetrie van de oplossing op vloeistof-vloeistof fase-separatie zichtbaar in de geladen GUVs gegroeid uit dioleylphosphatidylglycerol, ei sphingomyelinase en cholesterol. De effecten werden bestudeerd onder isotherme en wisselende temperaturen.

We beschrijven apparatuur en experimentele strategieën die van toepassing zijn voor het toezicht op de stabiliteit van naast elkaar bestaande vloeibare domeinen in geladen blaasjes onder voorwaarden van symmetrische en asymmetrische high-zoutgehalte oplossing. Het gaat hierbij om een aanpak te bereiden geladen multicomponent GUVs in hoog-zoutgehalte buffer bij hoge temperaturen. Het protocol houdt in dat de optie voor het uitvoeren van een gedeeltelijke uitwisseling van de externe oplossing voor een eenvoudige verdunning stap terwijl het minimaliseren van het vesikel verdunning. Een alternatieve benadering wordt gepresenteerd met behulp van een microfluidic apparaat waarmee de uitwisseling van een volledige externe oplossing. De gevolgen van de oplossing voor fase-separatie zichtbaar werden ook bestudeerd onder wisselende temperaturen. Te dien einde presenteren we het basisontwerp en de nut van een in-house ingebouwde temperatuur controle kamer. Bovendien, we nadenken over de beoordeling van de GUV fase staat, valkuilen is gekoppeld en hoe het om deze te omzeilen.

Inleiding

Sinds de waarneming van micron middelgrote domeinen in vloeistof-vloeistof fase gescheiden reus unilamellar blaasjes (GUVs) door fluorescentie microscopie, zijn GUVs gebruikt als een modelsysteem te onderzoeken van de lipide vlot hypothese^{1,2 , 3} . Het gebied van hun vrijstaande dubbelgelaagde ligt in het bereik dat uit biologische cellen, zijn ze geschikt Nabootsers van plasma membranen met de hypothetische vlotten. Talrijke studies over dergelijke GUVs zijn uitgevoerd met blaasjes gedispergeerd in zuiver water, sacharose of lage-zoutgehalte oplossingen^4,5,6,7,8. Deze voorwaarden, maar komen niet overeen met fysiologisch relevante blootstelling van biomembranen aan hoge-zoutgehalte omgevingen en trans-membraan oplossing asymmetrie zoals de voorwaarden voor de cellen zijn.

In dit werk en in een eerdere publicatie van onze groep⁹, werden de Staten van de fase van geladen multicomponent GUVs onderzocht als een functie van de aanwezigheid van zout en oplossing asymmetrie in het membraan. GUVs waren bereid uit mengsels van verschillende verhoudingen van dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), ei sphingomyelinase (eSM) en cholesterol (Chol) in sacharoseoplossing (met osmolariteit van 210 mOsm/kg) of high-zoutgehalte buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210 mOsm/kg). De keuze van het lipide werd gerechtvaardigd door de gegevens reeds verkregen op het fasediagram van dit mengsel^6,8.

Een aantal methoden voor de bereiding van GUVs zijn beschikbaar in de literatuur^10,11,12 (merk op dat hier, zullen we niet overwegen die overdracht van lipiden van een olie-gebaseerde naar een waterige fase waarbij ^{13 , 14} vanwege het inherente gevaar van de resterende olie residuen in het membraan die gevolgen voor de fase-gedrag hebben kunnen). De voorbereiding van GUVs in hoog-zoutgehalte buffer wordt geassocieerd met specifieke uitdagingen. Voor oplossingen van lage Ionische sterkte presenteert de electroformation methode^15,16 een snelle manier om te GUVs bereiden in hoge opbrengsten met kleine gebreken^10,17. De methode is gebaseerd op een laag van lipiden storten op een geleidende oppervlak (de elektrode), drogen ze en hydraterende hen met een waterige oplossing tijdens het toepassen van een AC-veld. Deze methode vereist echter aanpassingen als zout is aanwezig in de waterige oplossing^18,19. Het is ervan uitgegaan dat de drijvende kracht voor vesikel groei door electroformation electroosmosis¹⁶ , die op hoge geleidbaarheid²⁰wordt belemmerd. Vandaar, electroswelling van GUVs in hoog-zoutgehalte oplossingen is niet een eenvoudige aanpak als het optimalisatie voor verschillende zout concentraties aanwezig in de zwelling oplossing vereist. Gel-bijgewoonde vesikel zwelling^21,22 is een potentiële alternatief voor electroformation met snellere tijden van de vorming. Deze aanpak is gebaseerd op de verbeterde lipide film hydratatie wanneer een gel (agarose of polyvinylalcohol (PVA)) wordt gebruikt als substraat. Deze benaderingen, is echter voorzien van het risico van besmetting van de membraan in het geval van agarose gebaseerde zwelling²³ en/of temperatuur grenzen zoals in het geval van PVA gebaseerde zwelling. Ook is een protocol bij het groeien van de GUVs op een substraat van cellulose papier gevestigde²⁴onlangs geweest. Algemene onderwerpen van deze methode zijn het gebrek aan controle over de zuiverheid van het substraat en het gebruik van grote hoeveelheden van lipide. In dit werk, zullen wij introduceren en presenteren van de voordelen van de meest traditionele methode GUV voorbereiding, namelijk de spontane zwelling methode^25,26. Het bestaat uit een lipide laag op een substraat van de lipophobic, het in waterdamp sfeer en latere zwelling in de gewenste zwelling oplossing hydraterende drogen (Zie Figuur 1 en details in de sectie Protocol). Deze methode biedt geen controle over de grootteverdeling blaasje en leidt over het algemeen kleinere blaasjes in vergelijking met de methoden waar de productie wordt bijgestaan door elektrisch veld, polymeer substraat of microfluidic betekent. Echter is de vesikel kwaliteit en grootte geschikt voor de behandeling van de membraan fase staat als onderzocht hier.

Creëren van asymmetrie tussen de oplossingen in het membraan van het vesikel wordt geassocieerd met bepaalde uitdagingen zo goed. Een veel gebruikte aanpak is de directe verdunning van het vesikel suspensie in de gewenste externe oplossing^27,28. Echter, dit vermindert ook de dichtheid van het vesikel distributie. Een andere strategie is te langzaam wisselen de externe oplossing rond GUVs vestigden zich aan de onderkant van een stroom-cel waarmee voor oplossing in - en outflux. Om te voorkomen dat storend of zelfs verliezen de blaasjes met de stroom, zijn lage stroomsnelheid toegepaste⁸, waardoor deze aanpak tijd-inefficiënt. Bovendien garandeert geen van deze benaderingen volledige externe oplossing uitwisseling. Een voor de hand liggende oplossing is om te immobiliseren blaasjes om te voorkomen dat verliezen ze tijdens een externe oplossing uitwisseling. Biotinyleerd GUVs kan bijvoorbeeld worden aangebonden op een streptavidine-gecoate oppervlak²⁹. Echter, deze aanpak kan leiden tot compositorische variaties op de zelfklevend en vandaar de niet-naleving membraan segmenten^30,31. De toepassing van magnetische of elektrische velden wilt overlappen blaasjes resultaten in het opleggen van membraan spanning³². Optisch pincet te vangen een blaasje in dienst vereist hebbend een handvat gekoppeld (dat wil zeggen een kraal), terwijl het gebruik van optische brancards lokale verwarming³³kan betrekken. Overlapping van GUVs kan ook worden bereikt door een groeiende hen op platina draden zonder definitieve detachement³⁴. Dit levert echter blaasjes die niet geïsoleerd zijn en die zijn meestal verbonden met de draden of andere blaasjes door dunne lipide buizen (aanbinden).

Het gepresenteerde werk hoogtepunten strategieën om de bovengenoemde beperkingen te overwinnen. Eerst presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van de spontane zwelling methode aangepast en geoptimaliseerd voor de productie van GUVs in hoog-zoutgehalte buffers. Daarna introduceren we twee benaderingen efficiënt asymmetrische oplossing om voorwaarden te scheppen door eenvoudige verdunning of het gebruik van een microfluidic apparaat. Want ons doel de analyse van de stand van de membraan-fase van GUVs in verschillende oplossing omstandigheden is, in de daaropvolgende paragrafen criteria voor succesvolle statistische analyse en huidige hints voor het vermijden van valse categorisatie.

De analyses werden uitgevoerd onder isotherme voorwaarden en onder wisselende temperaturen. Terwijl de temperatuur control is vaak werkzaam, details over experimentele temperatuur-controle kamers zijn zelden beschreven. Hier, wordt een in-house gebouwde setup GUVs bij verschillende temperaturen worden nageleefd gepresenteerd.

Protocol

1. spontane zwelling van GUVs

Opmerking: Chloroform is een schadelijke stof, die zeer vluchtig is. Alle bewerkingen met chloroform in een zuurkast. Gebruik geen plastic labware zoals Pipetteer tips of plastic verpakkingen voor de overdracht en/of opslag van chloroform oplossingen. Chloroform verteerd organisch materiaal zoals plastic, die de oplossing verontreinigt. Gebruik glas spuiten en glazen recipiënten in plaats daarvan. Bovendien werken zo schoon mogelijk te voorkomen dat de invoering van onzuiverheden, als ze met de membranen interageren kunnen. Merk op dat typische lipide concentraties in laatste GUV voorbereidingen zijn in de micromolar bereik, dus wellicht onzuiverheden in dat concentratiebereik sterk effect op het gedrag van de membraan.

1. Naast de basisuitrusting, beschikken over de volgende items klaar.
   1. Voorbereiden een polytetrafluorethylene (PTFE, beter bekend als Teflon) plaat voor lipide afzetting van lengte ~1.5 cm x 1,5 cm en de juiste dikte. De plaat aan de ene kant met fijn schuurpapier beslepen.
      Opmerking: PTFE is lipophobic en zal niet worden bevochtigd door chloroform oplossingen als glad. Beide zijden van de PTFE-plaat kunnen worden geruwd om verwarring over de juiste kant voor lipide depositie te voorkomen. De dikte van de plaat moet worden gekozen voor de gemakkelijke hantering, bijvoorbeeld dat het is niet ook flexibel en gemakkelijk kan worden gedekt door de hydratatie-oplossing (Zie Figuur 1). Hier hebben we gebruikt platen van ~ 2 mm dikte. Zodra geruwd, de PTFE-plaat kan worden hergebruikt voor nieuwe experimenten na goede reiniging (stap 1.3).
   2. Een afsluitbare glazen ampul van passende omvang (~ 15 mL) voor te bereiden voor de uiteindelijke lipide film hydratatie en vesikel groei.
   3. Bereiden een afsluitbare glazen container waarin de ~ 15 mL glazen ampul past; het zal worden gebruikt voor het maken van een water-verzadigd sfeer voor lipide film pre zwelling, Zie Figuur 1.
2. 4 mM bereiden lipide voorraden in de gewenste verhouding van 1,2 - dioleoyl - sn - glycero - 3 - phospho-(1 ' - rac - glycerol) (natriumzout) (DOPG), ei sphingomyelinase (eSM), en cholesterol (Chol), met extra 0,1 mol % 1,1 ′ - dioctadecyl - 3 , 3,3 ′, 3 ′-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiIC ₁₈) tot een concentratie van de totale lipide van 4 mM. Chloroform als oplosmiddel gebruiken Zie de lijst met materialen.
3. Spoel de PTFE-plaat en de glazen container met commerciële afwasmiddel, ethanol en chloroform in die volgorde, en ten slotte droog ze.
4. Met een glazen injectiespuit, storten en gelijkmatig verspreid 10-15 µL van lipide materieel op de geruwd kant van de PTFE-plaat een uniforme lipide-film te maken. De naald van de spuit te verspreiden de oplossing indien nodig gebruiken.
5. Plaats van de PTFE-plaat op een schoon oppervlak, en droog het samen met de film van de gedeponeerde lipide gedurende 2 uur bij 60 ° C tot het verwijderen van de chloroform. Voor het gemak, storten de plaat op de schoongemaakte en onverharde 15 mL glazen container tijdens opdroging.
   Opmerking: De hoge temperatuur zorgt ervoor dat de lipide-film in een homogene single-liquid staat op dit en alle latere stappen.
6. Na opdroging vullen de vooraf zwelling glas container met gedeïoniseerd water tot een niveau dat kan geen drijfvermogen te kloppen dan de ~ 15 mL glazen ampul (~ 1 cm), Zie Figuur 1.
7. Put de ~ 15 mL glazen ampul met de PTFE-plaat in de bak en bedek het opdat een water-verzadigd sfeer naar voren kan komen, Zie figuur 1B.
   Opmerking: Gecondenseerde water op de innerlijke container muren geeft een goede indicatie voor succesvolle waterdamp verzadiging.
8. Laat de gedeponeerde lipide-film vooraf zwellen binnen de gesloten glazen container bij 60 ° C gedurende 4 uur. Binnen deze periode bereid de gewenste zwelling oplossing.
   Opmerking: Voor vesikel preparaten die kunnen worden uitgevoerd op lagere temperatuur, ditmaal kan worden zeer verkort - tot een paar minuten - als warm water verzadigde stikstof of argon wordt gebruikt voor de pre zwelling in plaats daarvan.
   1. Prepare 200 mM sacharose of 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 aangepast met HCl en warmte tot 60 ° C om de zwelling oplossing.
9. Na de pre zwelling, nemen de ~ 15 mL glas met de PTFE-plaat uit de container. Met een spuit aangesloten op een 0,45 µm filter, ~ 5 mL van de zwelling oplossing in de 15 mL glazen ampul te hydrateren de lipide-film toevoegen.
   Opmerking: Tot vaststelling van een naald naar het filter vereenvoudigt het inbrengen van de zwelling oplossing. Vooraf opwarming van de aarde de spuit en de filter wellicht aan te raden om een single-vloeibare fase staat van de lipide-film terwijl het toevoegen van de zwelling oplossing. Filteren van de oplossing (in-) organische verontreinigingen van bacteriën of zout overhaaste etc. minimaliseert
10. zegel van de ~ 15 mL glazen ampul houden de gehydrateerd lipide-film op de PTFE-plaat om te minimaliseren van verdamping. Indien nodig, gebruik van paraffine film ter verbetering van de verzegeling. Laat de film gehydrateerd lipide bij 60 ° C's nachts voor definitieve GUV zwelling.

2. Oogsten van GUVs

Opmerking: de samenvoeging van GUVs gezwollen en losgemaakt van de PTFE substraat resultaten in een kleine (~ 1 mm) wolk-achtige klomp zichtbaar met het blote oog. Lijkt witachtige wanneer geen fluorescentie kleurstof wordt gebruikt. Het is anders gekleurd volgens het absorptiespectrum van fluorophore. De toevoeging van DiIC ₁₈ maakt de wolk roze (Zie Figuur 2). De blaasjes zijn geconcentreerd in het aggregaat en oogsten het maximaliseert de opbrengst van het vesikel.

1. Koel neer de blaasjes tot kamertemperatuur binnen ~ 1 h. knippen van het puntige einde van een zuiger Pipetteer plastic tip voor het cluster of totaal van blaasjes te passen via de opening ~1/10.
   Opmerking: De koeling tarief is vooral belangrijk als vaste stof-vloeistof-fase-separatie zichtbaar wordt verwacht als het verandert de grootte van solide domeinen. Hier, te vertragen koeling, geplaatst we het monster in contact met een metalen blok grootte 5 x 9.5 cm x 7,5 cm (H x L x B) dat is afgekoeld tot kamertemperatuur binnen 1 h.
2. Pipetteer omhoog het cluster samen met een passende omvang van de zwelling van de oplossing (Zie Figuur 2). Resuspendeer de aggregaat in de zwelling oplossing symmetrische oplossing voorwaarden te creëren, of een gewenste iso-osmotische oplossing asymmetrische oplossing voorwaarden te scheppen.
   Opmerking: De ondergrens van het volume is beperkt door de grootte van het aggregaat volledig worden geoogst. De externe oplossing is verdund en teneinde de exacte concentratie, het volume van de oplossing van het vesikel moet rekening worden gehouden.

3. Observatie van GUVs voor fase staat evaluatie met behulp van fluorescentie microscopie

Opmerking: de GUVs werden doped met DiIC ₁₈ als een TL marker. Deze fluorophore partities bij voorkeur in de vloeistof-ontregelde (Ld) fase. Dit zorgt voor de fluorescentie microscopie waarneming van domeinen als gevolg van fase-separatie zichtbaar in de GUVs. Wij uitgevoerd fase staat beoordeling met epi-fluorescentie microscopie. Deze opmerkingen zijn in principe ook haalbaar met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM), waarmee ook signaal kwantificering (bijvoorbeeld om te bepalen van membraan-unilamellarity). Echter CLSM vereist meer geavanceerde apparatuur en (meestal) epi-fluorescentie opmerkingen voordat u deze scant in ieder geval zijn behulpzaam.

1. Besluiten op een doel (bv 40 X vergroting met een 0.6 numerieke diafragma (nvt) als gebruikte hier) te observeren van de GUVs en het consequent gebruiken bij het vergelijken van fase-Staten van dezelfde samenstelling aan verschillende solution voorwaarden. Gebruik van geschikte filters voor excitatie en emissie golflengte om fluorescentie waarnemingen met de fluorophore gebruikt (b.v. excitatie bij 560 ± 40 nm en 630 ± 75 nm met een 585 nm balk splitter ertussen zoals gebruikt voor DiIC ₁₈).
   Opmerking: De staatsgrenzen fase binnen een fasediagram zal afhangen van de resolutie die de doelstelling realiseert zoals het omschrijft de minimale grootte van micro-domeinen worden gedetecteerd.
2. Voor analyse, selecteer alleen GUVs die voldoen aan de volgende kwaliteitscriteria.
   1. Unilamellarity van het membraan GUV zorgen door visuele waarneming van verschillende blaasjes en vergelijken hun intensiteiten; blaasjes met de laagste fluorescentie emissie-intensiteit zijn waarschijnlijk unilamellar.
      Opmerking: Spontane zwelling kan opleveren vesikel partijen waar een groot deel van de gigantische blaasjes zijn niet unilamellar.
   2. Een extra controle uitvoeren door het kwantificeren van de fluorescentie emissie-intensiteit van zogenaamd unilamellar reus blaasjes en controleer de corresponderende signaal voor verstrooiing binnen de bevolking. Indien geen geheel getal verschillen tussen de verschillende GUVs worden waargenomen, alle van hen zijn waarschijnlijk unilamellar.
      Opmerking: Als de blaasjes zijn bereid uit conventionele lipiden een gevestigde methode zoals spontane zwelling, de aanpak die hierboven wordt beschreven voor de detectie van unilamellar blaasjes is voldoende. Als tot de oprichting van een nieuw GUV voorbereiding protocol of het gebruik van onconventionele lipiden, meer gedetailleerde studies zal moeten unilamellarity bevestigen. Bijvoorbeeld, kunnen de membraan fluorescentie signalen van gelabelde blaasjes bereid door een nieuw protocol worden vergeleken met die van de GUVs bereid door een gevestigde methode; of het membraan porie eiwit α-hemolysine in vesikel membranen ²⁴ kan worden ingevoegd. Kleurstof toegevoegd aan de buitenkant van de blaasjes zou geef hun interieur of niet, afhankelijk van de aanwezigheid van uni- of multilamellar blaasjes, respectievelijk.
   3. Zorgen ervoor dat de GUV een redelijke minimale diameter voor domeinen is moet nog steeds herkenbaar.
   4. Zorgen ervoor dat de GUV (bijna) geen defecten zoals uitpuilende of zelfklevend delen of interne structuren heeft.
3. Pipetteer een aliquoot deel van GUV schorsing op een microscoopglaasje en verzegel het goed. Bereiden van een kamer observatie.
4. Storten het monster op het microscoopglaasje. Eromheen door een spacer siliconen met een centrale ronde uitsparing. Om besmetting te voorkomen, ervoor zorgen dat het tussenstuk niet in contact met het monster. Zegel van het interieur door het plaatsen van een cover slip op de top van de siliconen spacer.
   Opmerking: In plaats van het silicone kunt spacer een Siliconenvet of zelfgemaakte polydimethysiloxane (PDMS) afstandhouders. Afdichten van de kamer zorgt voor minimale verdamping van het monster en onderhoudt iso-osmolar voorwaarden.
5. Laat het monster gedurende ~ 5 min. voor opnieuw evenwichtsinstelling van mogelijke domeinen.
   Opmerking: De mechanische stress van pipetteren kunt mengen de membraan-domeinen, die tijd nodig om hervorming hebben.
6. Plaats van het microscoopglaasje met het monster op het podium van de Microscoop en analyseren van de toestand van de fase van de GUV-partij in een statistische benadering. Observeren van meer dan 30 GUVs per batch en hun fase vaststellen volgens de volgende criteria voor de beoordeling van de staat van GUV fase met DiIC ₁₈ ( Figuur 3).
   Noot: Na hun groei, blaasjes kunnen veranderen hun afzonderlijke composities als gevolg van (bijvoorbeeld) domein ontluikende af of uitwisseling van membraan materiaal via nanobuisjes. GUVs vertonen daarom compositorische variaties binnen de dezelfde batch- ³⁵.
   1. Single-vloeibare fase wordt een vloeistof besteld (Lo) of vloeistof-ontregelde (Ld): ervoor zorgen dat de algehele vorm van de GUV bolvormig en glad is en DiIC ₁₈ wordt homogeen verspreid in het membraan (eerste beelden in de bovenste en onderste panelen in < sterke class = "xfig" > figuur 3).
   2. Twee fasen Lo + Ld coëxistentie staat: ervoor zorgen dat de blaasjes vertonen domeinen die worden weergegeven rond met soepele grenzen; volgens de DiIC ₁₈ partitioneren werking domeinen zijn helderrood (Ld) of donker rood/zwart (Lo) (tweede beelden in hogere en onderste panelen in Figuur 3, in valse kleuren). Zorg ervoor dat de domeinen gratis om te verspreiden op het blaasje oppervlak en kunnen samensmelten.
   3. Twee fasen solid (S) + (S + Lo of S + Ld) coëxistentie vloeibare: ervoor zorgen dat de domeinen kunnen worden weergegeven, vinger-achtige of rondachtige maar met hoekige grenzen (derde afbeeldingen in de bovenste en onderste panelen in Figuur 3). Observeren vloeibare domeinen (rood) op een solide (zwarte) achtergrond die verspreiding niet wordt weergegeven. Integendeel, solid (zwart) domeinen zullen gratis te verspreiden op een vloeibare achtergrond (rood).
   4. Drie-fase S + Lo + Ld coëxistentie: observeren van de drie types van domeinen weergegeven: (i) hoekig zwart domeinen (S), ingebed in (ii) dim (Lo) en (iii) helder (Ld) rode domeinen.
7. De bevolking van GUVs toeschrijven aan de fase staat die is vastgesteld als dominante onder een willekeurige steekproef, zoals in de volgende voorbeelden:
   1. als 20 single-vloeistof GUVs en 15 Lo + Ld GUVs worden waargenomen, overwegen de partij als een single-vloeibare fase.
   2. Als 10 S + L GUVs, 30 Lo + Ld GUVs, en 25 single-vloeistof-GUVs worden waargenomen, overwegen de partij als een Lo + Ld.

4. GUV observatie in Microfluidic apparaat

Opmerking: eerst het microfluidic apparaat fabriceren; de details van de microfluidic apparaat constructie- en montage hebben gekregen elders ^{36 , 37}; Zie Figuur 4 voor een korte beschrijving.

1. Bereiden van verse GUV zwelling oplossing (zout of sacharose volgens stap 1.8.1) en filtreer het door een 0,45 µm filter.
   Opmerking: Alle onzuiverheden in de stromende oplossingen kunnen verstoppen het apparaat microfluidic.
2. Knippen 200 µL zuiger Pipetteer kunststof tips en plaats ze in de gaten in het PDMS deel van het apparaat. Voeg 100 µL en 5 µL van de verse en gefilterde zwelling oplossing naar het reservoir (Zie figuur 5A) en elk van de snede Pipetteer tips, respectievelijk. Centrifugeer het hele apparaat op 900 x g gedurende 10 minuten in een schommel rotor centrifuge vooraf vullen het apparaat te verwijderen lucht.
3. Vooraf vullen de 1 mL glazen injectiespuit en slang met de zwelling oplossing zijn aangesloten en de plunjer positie verplaatsen naar 0 mL.
4. Plaats van de buis in het fluidic stopcontact van het apparaat en plaats de spuit in de spuitpomp.
   Opmerking: De keuze van de spuit en spuit pomp merk is niet belangrijk. Echter, glas spuiten zijn nauwkeuriger en de pomp moeten kunnen functioneren in het bereik van de stroom µL/min.
5. Verbinding maken met een aangepaste druk controle-eenheid naar de 8 inhammen van het besturingselement microfluidic laag (Zie figuur 5A). De druk op de controle-eenheid van druk tot 3 bar (lucht-, stikstof- of argon) ingesteld, maar de kleppen ingesteld op het microfluidic-apparaat naar de gesloten positie.
6. Het microfluidic apparaat, nu aangesloten op de spuit pomp en druk controle-eenheid, op een omgekeerde confocal microscoop stadium.
   1. Gebruik een doelstelling met dezelfde zoomfactor en nb als tijdens de bulk-opmerkingen. Controle als de fase staat statistieken zoals beschreven in stap 3.7 hetzelfde blijven als een ander doel wordt gebruikt om te voorkomen dat observatie artefacten die gebaseerd zijn op verschillende resoluties.
7. De GUVs in het apparaat laden.
   1. Eerste, pipet weg allemaal maar 25 tot 50 µL van de oplossing die is gebleven in het reservoir. Voeg 150 µL van de GUV-oplossing (in sacharose of zout volgens stap 1.8.1, maar overeenkomen met de oplossing gebruikt voor het vooraf vullen van het apparaat in stap 4.1) naar het reservoir en meng door het zachte pipetteren. Stel de injectiespuit op 10 µL/min debiet in trekken modus voor ongeveer 20 min of tot meer dan 90% van de valkuilen zijn bezet.
      Opmerking: Het reservoir niet mag uitvoeren droog. Als dit gebeurt, treedt luchtbellen de micro-kanalen. Meer GUV-oplossing toevoegen aan de reservoir tijdens het laden maar oppassen niet invoeren van luchtbellen, wanneer in het apparaat pipetteren.
8. Open alle van de eenheid drukregelkleppen te sluiten van de microfluidic ring-kleppen rond de vallen/GUVs. Stel de spuitpomp op 0 µL/min. Observeer de GUVs en de record confocal beelden na 1 uur. Wekken en op te sporen van de GUVs volgens de fluorophore gebruikt (b.v. excitatie in 561 nm en detectie tussen 580-620 nm voor DiIC ₁₈). Gebruik dezelfde selectiecriteria uit stap 3.6 , en zorg te noteer de locatie van elke GUV (dat wil zeggen de kolom en rij nummer, Zie Figuur 4)
9. wisselen de oplossing rond de GUVs .
   1. De spuitpomp ingesteld op 0 µL/min en Pipetteer weg alle maar 25 tot 50 µL van de GUV oplossing uit het reservoir. 150 µL van de 2e oplossing (in sacharose of zout volgens stap 1.8.1, afhankelijk van de gewenste oplossing buiten de GUVs) aan het reservoir en de mix toevoegen door zachte pipetteren. Pipetteer weg alle maar 25 tot 50 µL van de bufferoplossing uit het reservoir.
      Opmerking: Deze oplossing moet worden gefilterd met behulp van een 0,45 µm filter ook.
10. Herhaal de vorige stap minstens 5 keer grondig vervangen de oplossing in het reservoir. De spuit ingesteld op 10 µL/min debiet in modus voor ~ 10 min ter vervanging van de oplossing in de micro-kanalen, intrekken.
11. Verminderen de stroomsnelheid naar 1 µL/min. Open de 8 eenheid drukregelkleppen voor 2 s en sluiten weer (resulterend in openen en sluiten van de kleppen van de microfluidic ring). Het debiet ingesteld op 0 µL/min weer.
12. Na 1 h, de GUVs en de record confocal beelden waarnemen. Nogmaals, zorg om op te merken van de kolom en de rij van de micro-kamer waar elke GUV bevindt dat vergelijkingen van de dezelfde GUV vóór en na externe buffer uitwisseling.

5. Ontwerp en de kalibratie van de zaal temperatuurregeling

Opmerking: een geschikte kamer voor temperatuurregeling kan worden verkregen commercieel of huis-gebouwde. Temperatuurregeling wordt gewoonlijk bereikt door thermische koppeling van de kamer met het monster GUV aan een waterbad of een Peltier element. We beschrijven hier, het ontwerp en de karakterisering van een huis-gebouwde temperatuur-controle kamer met een externe water thermostaat. Deze thermostaten zijn beschikbaar in veel laboratoria of kan worden geborgen van oude apparatuur zoals lasers of spectrometers.

1. Assemble een warmtestroom kamer, hier, gemaakt van een aluminium blok, met verbindingslijnen naar een waterbad zoals aangegeven in Figuur 6. Zegel van de openingen aan boven- en onderkant en helder veld observatie van het monster door lijmen cover bril aan het blok inschakelen.
2. Spiegelen de zaal van de stroom aan de kant waar het monster zal worden geplaatst en Pipetteer een druppel van ongeveer 100 µL van de oplossing gebruikt in experimenten volgens stap 1.8.1. Optioneel, een fiber optic temperatuurvoeler (b.v. FISO FTI-10) invoegen of toevoegen van een temperatuurgevoelig kleurstof in een geschikte concentratie, bijvoorbeeld 500 µM Rhodamine B.
3. Monteren de GUV observatie kamer met Siliconenvet gestort in de vorm van de ring of sommige andere spacer (PTFE of rubber) en verzegel het met een glas van de cover 0,17 µm. Zorg ervoor dat de daling van de niet in contact met het afdichtingsmiddel of de spacer om te voorkomen dat de invoering van onzuiverheden.
4. Langzaam Schakel van de vergadering ondersteboven en sluit de externe water thermostaat met passende tubing ernaar. Bijzondere aandacht besteden aan geen water lekken.
5. Set de laagste gewenste temperatuur op de thermostaat externe water en laat het systeem equilibreer totdat de lezing van de temperatuursensor stabiel is, de tijd die nodig is voor de evenwichtsinstelling geeft een schatting van de minimale responstijd van het systeem.
6. Controle experimenten uitvoeren ten minste één keer voordat u begint met het gebruik van de zaal.
   1. Meet de temperatuur van de oplossing (bijvoorbeeld met een glasvezel sonde) en vergelijk deze met de lezing van de thermostaat over het temperatuurbereik van belang.
   2. Check voor een minimale offset van de lezing van de thermostaat en de lineariteit van de gemeten temperaturen.
   3. Controleren voor een verloop van de temperatuur in de kamer van de observatie met behulp van een temperatuur gevoelig kleurstof. Meet de temperatuur van de oplossing via de intensiteit van de fluorescentie of de levensduur van de fluorescentie microscopie (FLIM) voor verschillende afstanden van de onder cover slip ⁴⁰ imaging. Bovendien controleren of er een temperatuurgradiënt in de regio van GUV observatie, zoals weergegeven in Figuur 7.

6. GUV opmerkingen bij wisselende temperaturen

Opmerking: doorgaans voor GUVs waarvan membranen potentieel fase-aparte en die lijken te zijn op waarneming temperatuur T _obs homogene, fase-separatie zichtbaar zullen geïnduceerde onder T _obs (of die wordt waargenomen hangt het temperatuurbereik onderzocht). Omgekeerd, fase gescheiden blaasjes homogene moeten worden bij een temperatuur hoger dan T _obs. Echter, dit hoeft niet het geval voor een bepaalde (complexe) lipide-samenstelling en het wellicht interessant om te scannen altijd de hele toegankelijke temperatuur bereik ³⁸. Het protocol voor observatie en evaluatie van de fase overgang temperaturen niet afhankelijk is van de specifieke methode gebruikt voor de temperatuurregeling.

1. Monteren van de kamer temperatuur waarneming volgens sectie 5, weglaten van de fiber optic temperatuursonde of het temperatuur-gevoelige fluorophore.
2. Instellen van het externe waterbad tot kamertemperatuur (23 ° C) en laat het systeem equilibreer gedurende 10-15 min.
3. Tellen het aantal fase gescheiden blaasjes met behulp van de criteria uit stap 3.6; de totale fase staat van de bevolking GUV een hint over de regio van de temperatuur van de overgang van het systeem geeft. Als de fase staat in het vesikel bevolking nogal heterogene is gaat u rechtstreeks naar stap 6.5.
4. Vergroten (als de meerderheid van de blaasjes fase-gescheiden zijn) of verkleinen (als de meerderheid van de blaasjes homogene zijn) de temperatuur in grof intervallen (bv 1-2 ° C) en laat het systeem equilibreer voor ongeveer 2 min. opnieuw evalueren van de toestand van de fase van de GUV bevolking door middel van een willekeurige proef en varieert de temperatuur tot het blaasje bevolking de status van een heterogene fase geeft.
5. Zodra de bevolking in de buurt van het punt van de faseovergang is (dat wil zeggen de fase staat onder individuele GUVs zijn nogal heterogene), verlagen van de temperatuur interval (bijvoorbeeld 0,5 ° C) te verhogen van de resolutie. Laat het systeem equilibreer gedurende ~ 2 min en de staat van de fase van de GUV-bevolking opnieuw te evalueren door middel van een aselecte steekproef.
6. Zodra het punt van de faseovergang wordt doorgegeven, houden de temperatuur variëren totdat alle GUVs nu homogene of fase-gescheiden, respectievelijk zijn.
7. Controleren voor hysteresis om te evalueren of de evenwichtsinstelling tijden volstaan.
   1. De richting van de temperatuur verandering scan, ik.e. als de scan klaar was voor het verhogen van de temperatuur, de scan te doen door het verlagen van de temperatuur.
   2. Kiezen ten minste een subset van de temperaturen te beoordelen van de GUV bevolking fase staat verhouding (bijvoorbeeld 80% fase gescheiden).
   3. Als aanzienlijke afwijkingen tussen beide richtingen in de fase staat verhouding hysteresis aangeven, het verminderen van de stap-grootte van de temperatuur en/of verhogen de equilibratietijd in stappen 6.4 en 6.5.
   4. Als er geen hysteresis aangegeven door gelijke verhoudingen, kunt u overwegen steeds meer stap grootte en/of evenwichtsinstelling.
8. Plot van de ratio's van fase, staat tegen de temperatuur. Voor kwantificering, passen de gegevens aan een passend model ( Figuur 8).
   Opmerking: Fase overgang bochten meestal voorzien van een sigmoïdale traject en het sigmoïdale Boltzmann-objectmodel biedt een passende set voor montage van parameters:
   
   y: Fractie van uniform/fase-gescheiden GUVs
   een ₁: de eerste breukwaarde met
   een ₂: de definitieve breukwaarde
   T: temperatuur
   T _mix: temperatuur bij half-maximale y
   Y is de Fractie van homogene GUVs, moeten A ₁ en A ₂ worden vastgesteld op 0 en 1, respectievelijk. Als de mengbaarheid wordt overgang uitgegaan sigmoïdale, zodra de breukwaarde wordt gemeten om te 0 bij een bepaalde temperatuur alle fractie waarden voor het temperatuurbereik hieronder worden beschouwd als 0. Omgekeerd, zodra de breukwaarde met 1 bij een bepaalde temperatuur is, alle fractie waarden voor het temperatuurbereik hierboven zijn uitgegaan van 1.

Resultaten

GUV zwelling

Met de spontane zwelling beschreven aanpak hier, GUVs samengesteld uit DOPG, eSM, en Chol's nachts werden gekweekt in 210 mM sacharose of 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 vormen een zichtbaar aggregaat. Oogsten van het aggregaat zorgt voor een hoge vesikel opbrengsten. De hersuspensie in de zwelling oplossing resulteerde in symmetrische trans-membraan oplossing voorwaarden. Asymmetrische voorwaarden te scheppen, het totaal was geresuspendeerde in een iso-osmolar sacharose of high-zoutgehalte oplossing, respectievelijk (Figuur 2). De resulterende verdunning komt overeen met een uitwisseling van quasi-externe oplossing terwijl het minimaliseren van de verdunning van het aantal GUVs.

Fase diagram toewijzing van GUVs met behulp van fluorescentie microscopie

De aanwezigheid van 0.1% van de mol van de fase-specifieke DiIC₁₈ in de GUVs is toegestaan voor de waarneming van hun Staten fase via breed-gebied fluorescentie microscopie. Blaasjes exposeren S + L fase-separatie zichtbaar werden waargenomen door een 63 x / 1.2NA te kunnen lossen fijn gestructureerde vinger-achtige domeinen. Voor alle overige gevallen, een 40 x / 0.6 nb doelstelling werd gebruikt. Om te voorkomen dat artefacten tijdens de visuele inspectie voor GUVs en te maximaliseren reproduceerbaarheid, bepaalde criteria werden vastgesteld dat bepaald welke blaasjes te overwegen voor de fase staat analyse (protocol stap 3.6).

GUVs bereid uit ternaire mengsels van DOPG/eSM/Chol van een breed scala van ratio's gezwollen in sacharose of high-zoutgehalte oplossing en waargenomen bij kamertemperatuur tentoongesteld homogene Lo of Ld fasen, Lo + Ld en S + L fase-separatie zichtbaar, Zie Figuur 3. Figuur 9 toont exemplarisch defecte blaasjes, die niet moeten worden opgenomen in de data-analyse en laat ook zien hoe het identificeren van multilamellar blaasjes.

Als gevolg van hun onbekende geschiedenis zijn GUVs waarschijnlijk binnen-batch compositorische variatie³⁵vertonen. Vandaar, de algemene toestand van de fase van een bepaalde compositie werd vastgesteld in een statistische benadering. GUV populaties van een bepaalde samenstelling van lipide werden toegeschreven aan de fase staat die werd waargenomen als een dominante positie innemen bij een aselecte steekproef (protocol stap 3.6). Toch leverde composities dichtbij de Lo + Ld coëxistentie regio vaak partijen waar de dominante fase staat opgebouwd met een krappe meerderheid. Voor dergelijke vage gevallen, werd de visuele controle herhaald met ten minste drie onafhankelijke monsters. De Fractie van de blaasjes met identieke fase staat (bijvoorbeeld exposerende Lo + Ld fasescheiding) aanwezig zijn binnen de steekproeven was gemiddeld over het aantal experimenten die als het uiteindelijke resultaat (Figuur 10 gezet).

De beschreven protocollen geleid tot voldoende GUV groei over een breed scala van verschillende ratio's van DOPG en eSM Chol in hoge-zoutgehalte en sacharose oplossingen. Uitgebreide regio's binnen de ternaire fasediagram kon worden toegewezen onder zowel symmetrische als asymmetrische high-zoutgehalte oplossing voorwaarden (Figuur 11). De verschillen in het vesikel fase gedrag waargenomen onder andere oplossing voorwaarden werden elders in detail⁹besproken.

Opmerkingen van fase gedrag na volledige buffer uitwisseling met behulp van de microfluidic-methode

Het scheppen van asymmetrische oplossing voorwaarden door verdunning leidt tot residuen van de zwelling oplossing buiten. Onze microfluidic aanpak zorgt voor een uitwisseling van externe totaaloplossing. Figuur 5A toont het microfluidic apparaat volledig geassembleerd in het werkgebied van de confocal microscoop samen met fluidic outlet en druk control inhammen. Buizen worden aangesloten via de metalen pijpjes 90 ° aan ruimte voor uitgezonden licht imaging van bovenaf.

Voor observatie binnen het microfluidic-apparaat, een confocal microscoop met een 63 x / 1.2NA water onderdompeling objectief werd uitgevoerd. Net als bij de eerdere opmerkingen in bulk, werd DiIC₁₈ gebruikt om de vlekken van het membraan. Bij het maken van opmerkingen van de fase staat van GUVs gevangen in het apparaat, wees voorzichtig niet te interpreteren van de gegevens. Als gevolg van de nabijheid van de GUVs naar de berichten, kunnen de excitatie en emissie lichtpaden gedeeltelijk worden geblokkeerd door de PDMS leidt tot de valse verschijning van domeinen (Figuur 12). Hier, is de doorvallend licht detectie nuttig om te controleren of de positie van de GUVs op de posten. Dit ongewenste effect is vooral prominent voor kleine GUVs van minder dan 10 µm in diameter. In deze gevallen zijn de gegevens van verworpen. De confocal afbeelding in Figuur 13 bis toont een vlakke vesikel-sectie die een Lo-domein aanwezig op de GUV blaasje kruist. In dit geval, zou vlakke doorsnede scans verder boven of onder de sectie hebben niet bleek het domein vanwege zijn kleine omvang in vergelijking met die van de GUV, die is waarom het zouden zijn gemist en het blaasje geacht te zijn in een homogene fase staat. Vandaar, een confocal z-stapel moet worden gebruikt om te inspecteren de gehele GUV-oppervlak. Voor breed-gebied microscopie zou dit niet een probleem omdat de hele vesikel tegelijk image kan worden gemaakt.

Tot slot worden voorbeelden gegeven van GUVs vóór en na uitwisseling van de buitenste oplossing waar het is duidelijk wat de fase die Staten van de membranen (Figuur 14 zijn). Elk apparaat beschikt over 60 kamers (elk met een paar berichten te vangen een enkele GUV), waardoor tientallen experimenten per apparaat (Zie Figuur 4). Echter, sommige GUVs kunnen verdwalen tijdens de uitwisseling van de externe oplossing. Dit kan worden geminimaliseerd door de volgende stappen: 1) met behulp van bovien serumalbumine (BSA) coating om te voorkomen dat GUV adhesie/breuk op de posten; coating gebeurt door de muren van de kamer tot 20 mg/mL BSA voor 60 min en daarna spoelen met de werkende buffer bloot te leggen. Een ander zelfklevend molecuul dat kan worden gebruikt is poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol)³⁹. 2) voorzichtig osmotische afstemming van de innerlijke en uiterlijke oplossingen om te voorkomen dat slappe GUVs, die door het centrum van de posten passeren kon of uiteenspatten van GUVs. 3) het optimaliseren van de GUV voorbereiding procedure voor het verkrijgen van blaasjes groter dan ~ 8 µm in diameter ter voorkoming van passage door het centrum van de posten.

Design en karakterisatie van temperatuurgevoelig kamer voor de waarneming van GUV fase Staten

We ontwierpen een eenvoudige flow kamer, die beschikt over verbindingen met de externe water thermostaat (Figuur 6). We verkregen dekamer door frezen van een aluminium blok. Het materiaal van de kamer hoeft in het algemeen, niet om er een hittebehandeling geleidend, zoals het monster is gekoppeld aan het waterbad door de lagere dekking glas zoals afgebeeld in figuur 6B en 6 C.

Onafhankelijk van het exacte ontwerp, moet de prestaties van de kamer worden geëvalueerd. Wij gecontroleerd specifiek voor de lineariteit van de temperatuur van het monster met de temperatuur van de extern-set, een verschuiving van de systematische temperatuur en een verloop van de temperatuur in de kamer. De eerste twee punten kwamen aan bod door directe temperatuurmeting binnen de kamer door een fiber optic temperatuursonde (b.v. FISO FTI-10). Wij ook gecontroleerd voor een temperatuurgradiënt binnen de GUV schorsing. Een dergelijke verloop kan vloeien voort uit warmtestroom aan de buitenkant van de kamer. Ruimtelijk opgelost temperatuurmetingen kan worden verkregen door een temperatuur gevoelige fluorophore⁴⁰, Zie Figuur 7.

Gegevens plotten en gepast te verkrijgen T_mix van fase-gescheiden GUVs

Uitzetten van de Fractie van homogene GUVs over de waargenomen temperatuurbereik resulteerde in een sigmoidally gevormde gegevens punt traject. We passen de gegevens aan de Boltzmann model (protocol afdeling 6.8) waaruit de T_mix zou blijkt ()Figuur 8).

Figuur 1: Experimental stappen tijdens het spontane zwelling protocol (bovenzijde) met de overeenkomstige fase van de groei van het vesikel (lagere paneel). (A) A lipide-homogene film is verspreid op een geruwd PTFE-bord en gedroogd van elk oplosmiddel. (B) de gedroogde lipide film is dan vooraf gezwollen in een water-verzadigd sfeer in een gesloten container met water om de dubbelgelaagde hydratatie. De void glazen ampul bevat de PTFE-plaat en blijft open tijdens deze stap hydratatie. (C) de vooraf gezwollen lipide film wordt eindelijk volledig gehydrateerd door de toevoeging van de gewenste zwelling oplossing op het bord van de PTFE lipide-bekleed binnen de glazen ampul. Om te voorkomen dat de verdamping, is de glazen ampul correct verzegeld tijdens de nachtelijke incubatie. U wilt minimaliseren compositorische variaties binnen een batch, moeten alle stappen worden uitgevoerd bij een temperatuur waar het lipide-mengsel volledig mengbaar is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: GUV oogsten. (A) A gestort lipide foliën bestaande uit DOPG/eSM/Chol op molaire ratio's van 20/60/20 met 0,1 mol % DiIC₁₈ was gezwollen in hoge-zoutgehalte buffer samengesteld uit 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5. Het deksel van de container voor glas was bovendien verzegeld met paraffine film. Het vergrote gebied van belang bevat het resulterende GUV-aggregaat. Zijn rode uiterlijk is een gevolg van de aanwezigheid van DiIC₁₈. (B) de GUVs zijn geoogst met een afgeknotte pipette uiteinde. In dit beeld, de totale was afgepipetteerde omhoog samen met 50 µL van de zwelling van de oplossing, die werden overgedragen naar een verse flacon. (C) asymmetrische trans-membraan oplossing om voorwaarden te scheppen, het totaal was verdund in een andere isotone externe oplossing. Hier, het totaal samen met de 50 µL zwelling oplossing was geresuspendeerde in 950 µL sacharoseoplossing resulterend in een 20 x verdunning van de zwelling oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: GUV imaging. Breed veld fluorescentie beelden van GUVs doped met 0,1 mol % DiIC₁₈ voorbereid en waargenomen bij symmetrische zout of sacharose oplossingen bestaande uit verschillende ratio's van DOPG en eSM Chol (in zout buffer, van links naar rechts: 40/20/40 50/20/30; 30/60/10; in sacharose, van links naar rechts: 30/30/40; 20/60/20; 40/50/10). De beelden tonen GUVs in verschillende (naast elkaar) fase Staten beoordeeld volgens de criteria van het protocol stap 3.6. Hier, blaasjes waren beeld tot en met een 40 X / 0.6 nb doelstelling. Schaal bars = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: lay-out van microfluidic kanaalontwerp. GUVs Voer de onderste fluidic laag (overzicht kanalen) via de inlaat onder een reservoir. Een filter blokkeert ongewenste puin van het apparaat. Zij voert u een matrix van 60 kamers (8 rijen en kolommen van de 15) elke met berichten voor één GUV vangst (Zie invoegen). Elke kamer kan worden geïsoleerd binnen een klep van de ring door een laag (gevulde zwarte kanalen) boven de fluidic laag bediend. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: Microfluidic apparaat. (A) foto van een microfluidic apparaat gebruikt om overlapping van één GUVs en de buitenste oplossing volledig uit te wisselen. Het reservoir toe te voegen oplossingen (1), de 8 x druk inhammen verbonden met de druk controle eenheid (2), en het fluidic stopcontact aangesloten op de spuit en de pomp (3) op het etiket vermeld. Paneel (B) toont de controle-eenheid van druk met 8 kleppen elk reguleren 1 buis op het microfluidic-apparaat aangesloten. Hier kleppen #1 en #2 zijn open en vandaar de overeenkomstige ring kleppen zijn gesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: temperatuur controle kamer. (A) kamervóór de vergadering. (B) Assembled kamer (naar boven) met 2 mm cover glazen vastgelijmd aan de boven- en onderkant. Het oranje rubberen tussenstuk 0.5 mm in hoogte meet en is verzegeld met een 0,17 mm cover slip voor de waarneming van de bijgevoegde GUV schorsing. In deze afbeelding wordt een temperatuursonde voor calibratie doeleinden (bruin fiber verlaten van de kamer aan de rechterkant) ingevoegd. (C) eindmontage in het werkgebied van een omgekeerde Microscoop zonder de temperatuursonde. Het oranje rubberen tussenstuk kampt nu naar beneden. Het rubber is lijm genoeg het monster op zijn plaats houden. Opmerking dat licht kan worden verzonden via het monster waardoor zowel epi-fluorescentie en heldere veldwaarnemingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: ruimtelijk opgelost temperatuur gegevens binnen de kamer observatie verkregen door metingen van de FLIM van een temperatuur gevoelig kleurstof (hier: 500 µM Rhodamine B) ⁴⁰. gegevenspunten verkregen op 0, 10, 30, 300 en 400 µm boven de onderkant cover slip. De rode en blauwe gegevenspunten werden gemeten voor de temperatuur van het waterbad vastgesteld op 30 ° C en 12 ° C, respectievelijk. De zwarte gegevenspunten geven het water bad links naar equilibreer tot kamertemperatuur. Kleine temperatuurschommelingen in de zaal werden waargenomen maar bleef onder 0,5 ° C (grijze balken). De kamer van de totale hoogte is ongeveer 500 µm naargelang de dikte van de spacer (zie hierboven). De foutbalken geven de standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: het lokaliseren van de temperatuur van de mengbaarheid. De grafiek toont de afzonderlijke gegevenspunten van homogene (single-liquid staat) de Fractie van de GUVs bereid uit DOPG/eSM/Chol in de verhouding 30/40/30 doped met 0,1 mol % DiIC₁₈ uit drie onafhankelijke steekproeven (N = 20-40). Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout van middelen. Gegevenspunten waren gemonteerd op de Boltzmann model beschreven in stap 6,8 (continu zwarte lijn) waaruit het domein mengen temperatuur T_mix werd afgeleid (volg rode doorlopende lijn naar abscis) volgens de helft maximaal van de sigmoïdale kromme op de ordinaat (zwarte stippellijn). Oorspronkelijke en uiteindelijke waarden (een₁ en een₂) werden respectievelijk aan 0 en 1, vastgesteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 9: defecte blaasjes. Voorbeelden van gigantische blaasjes bereid vanaf 20/60/20 DOPG/eSM/Chol en doped met 0,1% van de mol als DiIC₁₈ , die niet voldoen aan de criteria in stap 4.2 beeld door breed-gebied fluorescentie microscopie instelt. Intensiteit weergave varieert van individuele beelden zijn geoptimaliseerd voor de intensiteit van de fluorescentie van de afgebeelde vesikel telkens. Als gevolg van de aanwezigheid van extra membraan materiaal en ingekapselde kleinere blaasjes, kan niet de status van de fase van het vesikel in (A) duidelijk worden omschreven. Het uiterlijk van deze gigantische vesikel staat geen voor een betrouwbare visuele inspectie voor lamellarity. Deelvenster (B) schildert een blaasje waarvan het interieur overvol met membraan materiaal is. Dientengevolge is het signaal van de fluorescentie van het membraan van het vesikel exterieur bovenop met zijn interne signaal, waardoor een visualisatie van lamellarity en mogelijke domeinen niet onmogelijk. (C) de intensiteiten van de fluorescentie van drie verschillende reus blaasjes staan in directe vergelijking binnen dezelfde weergave intensiteit. Dit beeld toont dat gigantische multilamellar blaasjes (1, 2) kunnen worden geïdentificeerd door hun grotere fluorescentie-signaal in vergelijking met de GUV (3). Hier, multilamellar evenals de unilamellar reus blaasjes tentoonstelling Lo + Ld fase-separatie zichtbaar. Blaasjes in alle beelden werden beeld tot en met een 40 x / 0.6 nb doelstelling. Schaal bars = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 10: breuk van Lo + Ld fase gescheiden GUVs gemiddeld over ten minste drie onafhankelijke monsters. Blaasjes waren samengesteld uit 30/40/30 DOPG/eSM/Chol dicht bij de grens van de regio Lo + Ld coëxistentie. De foutbalken voor symmetrische sacharose voorwaarden illustreren de-charges-verstrooiing. Het label van de ordinaat beschrijft oplossingen binnen/buiten de blaasjes; sacharose: 210 mM sacharose bevat; zout: 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5; Foutbalken geven de standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 11: fasediagram van GUVs van DOPG, eSM, voorbereid en Chol toegewezen onder voorwaarden van de andere oplossing met behulp van 210 mM sacharose (sacharose) en 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 (zout). GUV fase staat werden onderzocht in sacharose/sucrose (A; bovenste gedeelte), sacharose/zout (in/out) (A; onderste veelhoekige gedeelte), zout/zout (B; bovenste gedeelte) en zout/sacharose (B; lagere veelhoekige sectie). De cartoons illustreren het patroon van de dominante domein binnen de gemarkeerde secties en de bijbehorende voorwaarden van de oplossing. Vesikel fase staten vertegenwoordigd in de lagere veelhoekige gedeelten werden vastgesteld onder asymmetrische oplossing voorwaarden op 20 x GUV verdunning. Aangepast van referentie⁹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 12: artefacten in gevangen GUVs. Voorbeeld van een kleine GUV waar een valse domein kan worden gezien als het gevolg van de nabijheid met de posten (DOPG/eSM/Chol 60/20/20). Het helder-veld verzonden lichte afbeelding toont de posten (grEY) wordt bedekt met de afbeelding van de confocal fluorescentie van de GUV (oranje). De berichten worden gezien patroon te maken een inmenging in het beeld helder-veld. De fluorescentie signaal sluiten de posten (rechts) wordt verminderd, waardoor de schijn van fase-separatie zichtbaar. Schaal bar = 5 µm.

Figuur 13: voorbeelden van twee verschillende GUVs gevangen genomen door de PDMS posten waar de fase Staten duidelijk zichtbaar zijn. (A) Lo + Ld fase gescheiden vesikel gemaakt van DOPG/eSM/Chol 60/20/20. (B) een blaasje gemaakt van 40/30/30 Ld of Lo éénfasig tentoonstellen. Een confocal z-stapel voor de hele vesikel werd onderzocht om te bevestigen dat geen domeinen (out-of-focus) aanwezig waren. De randen van de posten worden gezien op de rechterkant van de beelden (grijs). Schaal bar = 5 µm.

Figuur 14: resulterende fase gedrag na een volledige fluidic uitwisseling met behulp van het apparaat microfluidic. Hetzelfde GUV is aangetoond dat zowel vóór als na oplossing in ruil voor (een) symmetrische salt/zout (in/out) zout/sacharose (in/out) (DOPG/eSM/Chol 60/20/20, schaal bar is 2 µm) en (B) symmetrische sacharose/sucrose (in/out) aan sacharose/zout (in/out) (DOPG eSM/Chol 30/40/30, schaal bar = 3 µm). Aangepast van referentie⁹.

Discussie

Succesvolle productie van GUVs voor fase staat waarnemingen voorwaarden symmetrische en asymmetrische high-zoutgehalte

De protocollen die hier gepresenteerd introduceert een strategie te beoordelen van de invloed van hoge-zoutgehalte buffer en oplossing asymmetrie op de membraan fase staat van geladen GUVs over een brede waaier van composities. Een van de belangrijkste uitdagingen bij de verwezenlijking van dit doel was de productie van geladen GUVs in hoog-zoutgehalte buffers.

Wij met succes geproduceerd GUVs in sacharoseoplossing en hoge-zoutoplossing buffer door een eenvoudige spontane zwelling benadering, waarin een stap pre hydratatie van de gedeponeerde lipide-film en een overnachting definitieve hydratatie voor vesikel groei. Het is belangrijk op te merken dat de lipide-afzetting op een geruwd PTFE plaat om ervoor te zorgen zelfs lipide verspreiden gebeuren moet zodanig dat deze unilamellar blaasjes. Bovendien is het essentieel om elke stap uitvoeren tijdens het blaasje voorbereiding bij een temperatuur waar het lipide-film bevindt zich in een homogeen en vloeibare fase staat. Anders, kan de vesikel bevolking worden polydisperse in samenstelling en bias van de bevolking van de laatste fase staat analyse. Het specifieke protocol voor de spontane zwelling van de opbrengsten van GUVs een blaasje klomp die aan de ene kant de mogelijkheid biedt om resuspendeer het in kleine hoeveelheden te verkrijgen hooggeconcentreerde vesikel dispersies, en aan de andere kant biedt asymmetrische oplossing voorwaarden over het membraan terwijl het minimaliseren van de verdunning van blaasjes^8,28. Het is essentieel dat tijdens vesikel verdunning of externe oplossing wisselen, binnen en buiten osmolarities gecompenseerde blijven morfologie wijzigingen veroorzaakt door osmolariteit incongruenties kunnen veroorzaken of voorkomen van Lo + Ld fase scheiding⁴¹ of, in geval van hypotone voorwaarden, kan leiden tot het blaasje barst.

Hier, resulteerden pogingen te optimaliseren electroformation protocollen in hoge-zoutgehalte oplossing in de productie van geen GUVs terwijl PVA-bijgewoonde zwelling multilamellar blaasjes leverde. Hoewel het vereist langere bereidingstijden en resultaten in vesikel batches van lagere kwaliteit^10,17, de succesvolle productie van geladen blaasjes door spontane zwelling wordt geleverd met extra voordelen. Het vereist minimale inspanning tijdens het resulterend in voldoende opbrengsten voor statistische batch analyses en in tegenstelling tot electroformation, geen geavanceerde apparatuur of optimalisatie nodig waren. Bovendien zijn geen verontreinigingen door oxidatie van lipiden waargenomen^42,43. Volgens de literatuur zijn er geen verschillen tussen de lipide-composities van blaasjes en de bijbehorende bestanden waaruit ze^7,17waren gegroeid. Anderzijds wordt de vesikel vorming op een substraat van PTFE niet gevraagd de opneming van alle verontreinigingen in tegenstelling tot gel-bijgewoonde zwelling methoden waar vreemde moleculen kunnen worden ingevoerd door de substraat-²³. Electroformation wordt geleverd met verdere nadelen aan buitensporige vesikel verdunning gerelateerde bij het maken van asymmetrische oplossing voorwaarden. GUVs geproduceerd door electroformation zijn meestal aanwezig als een homogene dispersie (in tegenstelling tot de opschorting van de sterk geconcentreerde blaasje in de vorm van een klomp gevormd tijdens spontane zwelling). Enigerlei verdunning van de externe oplossing zou aanzienlijk het aantal blaasjes ook verdunnen. Bovendien, in de loop van dit werk die werd naar voren gebracht dat DOPG/eSM/Chol GUVs geproduceerd door electroformation in sacharose werd unstable als verdund in hoge-zoutgehalte buffer. Fluorescentie van lipide patches op het microscoopglaasje aangegeven dat blaasjes voordat hun visuele inspectie mogelijk was zou barsten. Dergelijke instabiliteit kan worden toegeschreven aan de spanning van een verhoogde membraan van blaasjes voorbereid door electroformation in vergelijking met die welke zijn verkregen door spontane zwelling¹⁰.

Hoewel de vesikel verdunning een gemakkelijke en snelle aanpak asymmetrische GUV oplossing voorwaarden te scheppen is, het slechts een deeloplossing externe uitwisseling, zij het in een hoge fractie volbrengt (hier: 95%, Figuur 2), zoals bij verdunning, sporen van de zwelling van de oplossing zal blijven. De keuze van de mate van de uitwisseling van de externe oplossing is een trade-off tussen pipetteren omhoog het blaasje klomp samen met de zwelling oplossing (sectie 2) en niet de verdunning van het te veel. Vandaar, introduceerden we een benadering van de alternatieve microfluidic elders besproken in detail³⁷ , dat voorziet in een snelle en volledige externe oplossing uitwisseling tijdens GUV fase staat waarnemingen om te controleren of de fase staat opmerkingen voor verdund blaasjes. De opmerkingen van fase staat varianten bij de overgang van symmetrische naar asymmetrische oplossing voorwaarden werden ook opgemerkt eens te zijn. Bovendien, beide methoden voor het genereren van asymmetrische oplossing voorwaarden weergegeven hier zijn relatief snel (vergelijk Ref.⁸) en komen met geen bekende risico's van lokale samenstelling (vergelijk verwijzingen^30,31), wijzigingen toename van spanning van de membraan (vergelijk referentie³²), of lokale verwarming (vergelijk referentie³³), wat betreft de alternatieve methoden besproken in de inleiding. Tijdens het microfluidic vangen is een osmotische evenwicht tussen het blaasje interieur en exterieur niet alleen essentieel voor het vermijden van fase staat artefacten zoals hierboven vermeld, maar ook deflatie veroorzaakt door hypertonic oplossing voorwaarden kan de gevangen GUVs te glijden door de posten na een externe oplossing uitwisseling.

Hoewel spontane zwelling met succes toegepast is om te groeien ongeladen blaasjes van een DOPC/eSM/Chol systeem, in andere gevallen, het ontbreken van kosten kunnen afbreuk doen aan GUV zwelling als gevolg van het daaruit voortvloeiende gebrek aan repulsion tussen de individuele bilayers⁴⁴ . Vooraf zwelling verlenging of in te voeren omvangrijk lipide headgroups kan deze kwestie⁴⁵tegengaan. Bovendien is het blaasje stabiliteit na hun verdunning in oplossingen anders dan die van zwelling afwijken voor verschillende lipide composities en verdunning media, die we hier niet hebben onderzocht. We hebben ook niet onderzocht de mogelijkheid van de gemiddelde diameter van de GUV afstemmen met de voorbereiding methode hier gepresenteerd. Maar parameters zoals vesikel samenstelling en zwelling oplossing zijn waarschijnlijk om de resultaten te beïnvloeden. De toepassing van alternatieve methoden⁴⁶ grotere blaasjes voor de lipiden en de oplossingen die hier gebruikt kan opleveren, maar ze kunnen komen met andere nadelen die is gekoppeld aan de methode. De hierboven beschreven aanpak voor de productie van GUVs in symmetrische en asymmetrische high-zoutgehalte voorwaarden biedt een potentieel instrument voor verdere studies van blaasjes samengesteld uit verschillende lipide composities en verspreid in verschillende media. Zoals wij die mogelijkheden niet onderzocht, zal de toekomstige studies tonen hoe in het algemeen de GUV voorbereiding en verdunning methoden kunnen worden toegepast.

Observatie van fase-separatie zichtbaar bij wisselende temperaturen

Er bestaan verschillende experimentele opstellingen geschikt om te studeren van GUVs bij wisselende temperaturen. Terwijl deze opstellingen niet vaak in detail binnen de literatuur beschreven zijn, presenteert het huidige werk een fundamentele vergadering die van toepassing zijn voor dergelijke studies.

Controlemetingen laten zien dat de temperatuur van dit intern ontworpen en gebouwd kamer juist wordt bestuurd door een thermostaat en temperatuurgradiënten binnen de kamer binnen de experimentele temperatuur resolutie. Wordt gewaarborgd dat de experimentele thermische omstandigheden met de lezing van de thermostaat stroken.

Tijdens de beoordeling van GUV fase Staten over een breed temperatuurbereik is het belangrijk dat de waargenomen blaasjes goed zijn geëquilibreerd nadat de temperatuur is veranderd. Een mogelijke manier om ervoor te zorgen dit is te controleren voor hysteresis. Als hysteresis aanwezig is, de temperatuur stappen moeten worden verlaagd en/of evenwichtsinstelling keer verhoogd. Als de temperatuur controle in dit werk komt tot stand door een thermostaat op basis van water, het bereik van temperaturen werken is idealiter beperkt tot 0 - 100 ° C. Dit bereik kan worden uitgebreid met behulp van andere temperatuur controle vloeistoffen zoals olie of door gebruik te maken van andere opstellingen, bijv een Peltier apparaat. In de praktijk wordt de werktemperatuur ook beperkt door mogelijke condensatie of verdamping. Bovendien, voor temperaturen ver weg van de kamertemperatuur wordt het vóórkomen van een steady-state temperatuur verloop in de zaal van de observatie meer kans. Ook kan de beeldvormende apparatuur bij extreme temperaturen worden geschaad. Voor typische temperatuurbereiken geschikt voor lipide vesikel studies (~ 10-50 ° C^7,9) schade aan de observatie apparatuur mag worden beschouwd, maar is meestal niet te verwachten.

Vesikel domein observatie artefacten

Er zijn een aantal bronnen voor observatie artefacten met behulp van breed-gebied fluorescentie microscopie. Allereerst moet men zich ervan bewust dat de maximale resolutie r van het object toegepast voor de visuele inspectie van vesikel fase Staten wordt bepaald door de detectiegrens van lipide domeinen volgens:

waar λ de golflengte van de emissie is, en NA is het numerieke diafragma van de doelstelling. Een typische doelstelling met een 40 x vergroting en een nb voor 0.6 die groene uitstoot detecteert licht ongeveer 560 nm zou bereiken een optische resolutie van ~0.6 µm. Vandaar, studies die blaasjes gemaakt van bepaalde lipide mengsels tussen verschillende staten fase vergelijken voorwaarden gebruik dezelfde doelstelling voor het dezelfde lipide-mengsel.

Een ander artefact is het voorkomen van lipide domeinen als gevolg van lipide-foto-oxidatie als gevolg van een langdurige blootstelling aan excitatie lichte⁴¹. Foto-schade optreedt bij voorkeur op onverzadigde koolwaterstof lipide wordt. In feite, voor sommige lipide-composities, zo'n domein vorming van aanvankelijk homogene blaasjes werd waargenomen hier na een langdurige periode van excitatie blootstelling aan licht (~ 30 s). Ter bestrijding van deze kwestie, de excitatie-licht bleef gericht op één gezichtsveld voor slechts een paar seconden voor de fase staat beoordeling. Vandaar, DiIC₁₈ was geschikt voor onze doeleinden. Andere kleurstoffen, echter kunnen veel gevoeliger en wellicht kunnen worden gehanteerd bij lagere excitatie intensiteiten en kortere excitatie lichte blootstelling tijden.

Mechanische schuifspanning uit de overdracht van de Pipet van de blaasjes mixen mogelijk domeinen tijdelijk, waardoor de schijnbare vesikel fase gedrag verstoren. Voor sommige partijen, verschillende blaasjes toonde verschillende fase gedrag 0 min en 5 min na Pipetteer overbrengen naar de Microscoop dekglaasje aan. De schuifspanning geïnduceerd door de vloeistof stroom in het microfluidic-apparaat is ook aangetoond dat resulteren in domein⁴⁷mengen. Blaasjes moeten voor een voldoende hoeveelheid tijd voor de equilibratietijd voor observatie ongemoeid gelaten worden. Binnen deze studie waren blaasjes gevangen op het microfluidic apparaat voor 1 h ongemoeid gelaten na vesikel laden en oplossing uitwisselingen voor observatie.

Om te voorkomen dat sommige van de bovengenoemde problemen, alsmede de beperkingen die zijn opgelegd door de lichte diffractie limiet, alternatieve methoden zoals nucleaire magnetische resonantie spectroscopie⁴⁸ of super resolutie microscopie technieken⁴⁹ kan worden ingezet.

Conclusie en vooruitzichten

Het gepresenteerde werk toont een aantal methoden waarmee voor de analyse van de invloed van de hoge zoutgehalte symmetrische en asymmetrische oplossing voorwaarden op membraan fase-separatie zichtbaar. Alle van de gepresenteerde methoden zijn geschikt voor andere toepassingen. Het microfluidic-apparaat biedt bijvoorbeeld een platform om te bestuderen van de kinetiek van domein vorming en verdwijnen bij de inductie van asymmetrie van de oplossing. Ook domein uiterlijk als functie van de zoutconcentratie kan worden bestudeerd die manier. Alle methodes kunnen ook worden gebruikt om te kijken naar de invloed op het gedrag van de fase met behulp van een andere oplossingen van belang.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sodium salt	Avanti Polar Lipids	840475C	afgekort als DOPG in de tekst
chicken egg sphingomyelin	Avanti Polar Lipids	860061	afgekort als eSM
cholesterol (ovine wool, > 98 %)	Avanti Polar Lipids	700000	afgekort als Chol
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Molecular Probes	D-282	afgekort als DiIC18
Chloroform, HPLC grade (≥ 99.8 %)	Merck
NaCl (> 99.8 %)	Roth
HCl (37 %)	Roth
Tris (≥ 99.9 %)	Roth
Sucrose (≥ 99.5 %)	Sigma Aldrich
Parafilm
Threaded vial 45x27 mm, 15 mL	Kimble		Soda flat bottom, wit schroefdop
pH meter	Mettler Toledo	MP220
Osmometer	Gonotec	Osmomat030
Epi-fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer D1
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP5
Objective 40x, 0.6 NA	Zeiss	LD Achroplan
Objective 40x, 0.75 NA	Leica	506174
Objective 63x, 0.9 NA	Leica	506148
Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 ± 0.01 mm	Menzel-Gläser
Cover slip, 22x22 mm, 0.17 ± 0.01 mm	Menzel-Gläaser
Parafilm "M"	Bremix Flexible Packaging
Syringes, 5 mL, 10 mL	Braun
0.45 µm syringe filter	GVS North America	Cameo 25AS, 1213723	Acetaat, steriel