Met behulp van In Vivo en weefsel en cel Explant benaderingen te bestuderen van de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale Aorta

Samenvatting

Protocollen voor het bestuderen van de embryonale en perinatale lymfkliertest aorta met behulp van in vivo klonale analyse en lot toewijzing, aorta explantaten en geïsoleerde gladde spier cellen zijn gedetailleerd hier. Deze uiteenlopende benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de morfogenese van de embryonale en perinatale aorta in normale ontwikkeling en de pathogenese in ziekte.

Samenvatting

De aorta is de grootste slagader in het lichaam. De aorta muur bestaat uit een binnenlaag van endotheliale cellen, een middenlaag van wisselende elastische lamellen en zachte spiercellen (SMCs) en een buitenlaag van fibroblasten en extracellulaire matrix. In tegenstelling tot de wijdverbreide studie van pathologische modellen (bijvoorbeeld atherosclerose) in de volwassen aorta, is veel minder bekend over de embryonale en perinatale aorta. Hier, wij richten ons op SMCs en protocollen voor de analyse van de voedselproductie en pathogenese van embryonale en perinatale aorta SMCs in normale ontwikkeling en ziekte. In het bijzonder de vier protocollen opgenomen zijn: ik) in vivo embryonale lot mapping en klonen analyse; II) explant embryonale aorta cultuur; III) SMC isolatie van de perinatale aorta; en iv) plaatsing van de subcutane osmotische mini pomp bij zwangere (of niet-drachtige) muizen. Dus, deze benaderingen vergemakkelijken het onderzoek van de origin(s), lot en klonen architectuur van SMCs in de aorta in vivo. Zij maken voor het moduleren van embryonale aorta morfogenese in utero door voortdurende blootstelling aan een farmacologische agenten. Bovendien, geïsoleerde aorta weefsel explants of aorta SMCs inzichten te krijgen in de rol van de specifiek gen doelen tijdens fundamentele processen zoals muscularization, proliferatie en migratie kunnen worden gebruikt. Deze hypothese genererende experimenten op geïsoleerde SMCs en het transplanteren aorta kunnen vervolgens worden beoordeeld in het kader in vivo via farmacologische en genetische benaderingen.

Inleiding

De bloedsomloop systems van meercellige organismen functie voor voedingsstoffen en zuurstof naar de cellen die zijn niet in contact met de externe omgeving en het verwijderen van afvalstoffen en koolstofdioxide van deze cellen. In gewervelde dieren bestaat de primaire bloedsomloop uit het hart, welke pompen bloed door middel van een reeks van bloedvaten. De muren van de grote bloedvaten zoals slagaders en aders, bestaan uit drie lagen: ik) de intima, of binnenlaag van endotheliale cellen; II) de media, of de middelste laag van wisselende omtrek langwerpige zachte spiercellen SMCs en elastische lamellen; en iii) de adventitia, of de buitenlaag van bindweefsel en fibroblasten. De overgrote meerderheid van de studies in vasculaire biologie focus op endotheliale cellen, onderzoek naar de vorming van nieuwe endothelial cel omzoomde buizen door middel van angiogenese. In vergelijking krijgen SMCs relatief weinig aandacht. SMCs zijn echter een kritische celtype in de bouw van de normale arteriële muur en vasculaire pathologieën.

De aorta is de grootste kaliber slagader in het lichaam, het ontvangen van de cardiale output van het linkerventrikel van het hart. Het wordt geteisterd door uiteenlopende ziekten bij de mens, met inbegrip van atherosclerose en aneurysma dissectie. In volwassen organismen, worden de aorta en zijn grote takken intens bestudeerd in modellen van vasculaire ziekte. Bijvoorbeeld, hoog vet dieet gevoed muizen die zijn leeg voor de codering van de low-density lipoprotein receptor of apolipoproteïne E, gene ontwikkelen van atherosclerose, en recente lot toewijzing studies blijkt dat bestaande SMCs aanleiding geven tot meerdere celtypen in de atherosclerotische plaque¹. In de aorta aneurysma omvatten pathologische veranderingen SMC apoptosis en extracellulaire matrix remodelleren van^2,3.

Aanzienlijk minder is gekend over SMC genuitdrukking en pathogenese tijdens de embryonale en perinatale periode. Wij bieden hier protocollen voor studeren embryonale en perinatale aorta SMCs in vivo, in weefsel explantaten en geïsoleerde cellen. Bijvoorbeeld, bakent het eerste deel van het protocol lot mapping en klonen analyse in embryonale muizen. CRE recombinase uitgedrukt onder de controle van de promotor van een cel-specifieke vergemakkelijkt de markering van de specifieke cellen en hun nageslacht^4,5,6; temporele controle van cel-specifieke etikettering kan echter uitdagende zijn tijdens de embryonale ontwikkeling in muizen. In dit verband bieden met embryo's uiting geven aan de voorwaardelijke CreER onder actief in SMCs (e.g.,Myh11 of Acta2) en een Cre-verslaggever, de promotor wij de methoden voor het injecteren van tamoxifen of zijn actieve metaboliet 4-OH-tamoxifen in zwangere dammen en voor het analyseren van de gelabelde cellen in embryo's of postnatale nakomelingen. Bovendien, in tegenstelling tot lot toewijzing studies, waarvoor voornamelijk gebruik maken van Cre verslaggevers met een enkele verslaggever fluorophore^1,7, klonen analyse is aanzienlijk verbeterd met Multi-Color Cre verslaggevers.

De tweede en derde van protocol beschreven methoden om te isoleren en kweken van embryonale aorta explantaten en aorta SMCs van pasgeborenen, respectievelijk. Deze benaderingen toestaan voor het manipuleren van signaalroutes, specifiek in de aorta explantaten of SMCs, en voor het analyseren van de directe effecten van farmacologische agenten. Zo kan de rol van specifieke genen in het weefsel van belang worden vertoond in een veel snellere manier dan door middel van traditionele genetische manipulaties in muizen. Bovendien, de geïsoleerde SMC studies vergemakkelijken de analyse van cel migratie en adhesie, die technisch beperkt in vivo.

Tot slot, de vierde protocol sectie bakent de plaatsing van een subcutane osmotische mini pomp geladen met farmacologische agenten in zwanger (of niet-drachtige) muizen. Deze methode vereenvoudigt de analyse van het effect op de ontwikkeling van het embryo veroorzaakt door agentia die continue infusie vanwege snelle stofwisseling vereisen. Het alternatief voor frequente injecties is niet praktisch voor veel agenten en moet worden voorkomen, aangezien het groot ongemak in de zwangere dam veroorzaken kan.

Protocol

alle protocollen van de muis zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité aan de Yale University.

1. In Vivo embryonale lot Mapping en klonen analyse

Opmerking: We hebben deze benaderingen wijd gebruikt om te evalueren van de oorsprong van cellen en hun klonen architectuur in ontwikkeling en ziekte modellen ^{7 , 8 , 9 , 10}.

1. instellen paring tussen muizen met een CreER en muizen met een verslaggever van de Cre.
   Opmerking: Een CreER wordt gebruikt voor SMC markering; Myh11-CreERT2 of Acta2-CreERT2 muizen ^{11 , 12} wordt meestal gebruikt voor dit doel. ROSA26R-CreERT2 muizen ¹³ hebben we gebruikt voor het in grote lijnen het markeren van embryonale weefsels.
   1. Voor de analyse van het klonen, gebruik een multi-color Cre verslaggever (bijvoorbeeld Confetti of Rainbow [Rb] muizen) ^{8 , 14 , 15} en gebruiken voor het omzetten van de Lot, een eenkleurige Cre verslaggever (bijvoorbeeld ROSA26R-YFP muizen ¹⁶) of de dubbel-kleur Cre verslaggever ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) ¹⁷.
      Opmerking: Deze regeling fok gebruikt volwassen muizen die zijn 2-6 maanden oud (over het algemeen ~ 30 g) en zal het genereren van embryo's met een CreER en een verslaggever Cre.
2. Für die vaginale stekkers in de ochtend met behulp van een metalen sonde en 's middags op de dag van plug detectie als embryonale dag (E) 0,5 overwegen.
3. Scheiden van het vrouwtje van de man, wanneer een stekker wordt gedetecteerd.
4. Voorbereiden 4-OH-tamoxifen en tamoxifen werkende oplossingen.
   1. Voor 4-OH-tamoxifen, los 5 mg in 50 µL van 100% ethanol, vortex gedurende 2 minuten en voeg toe 450 µL van maïsolie. Op het ijs, bewerk ultrasone trillingen ten uitvoer niveau 2 voor 10 s cycli met rust tussen cycli totdat monster afkoelt. Nadat het monster volledig is opgelost (meestal ~ 4-5 cycli van ultrasoonapparaat), nemen 200 µL van sonicated oplossing en los op in 1800 µL van maïsolie om definitieve werkoplossing (4-OH-tamoxifen, 1 mg/mL).
   2. Voor tamoxifen, Verdun tot 50 mg/mL in 100% ethanol en vortex totdat het is opgelost. Verdund in maïsolie te maken van de definitieve werkoplossing (tamoxifen, 10 mg/mL) toe en roer bij 45 ° C om ervoor te zorgen dat het volledig is opgelost.
5. Voor vroege embryonale inductie, injecteren 4-OH-tamoxifen intraperitoneally een zwangere dam.
   1. 4-OH-tamoxifen injecties (tot ~ 150 µg per zwangere muis, of ongeveer 5 mg/kg lichaamsgewicht) gebruikt E5.5 en vervolgens als zij levensvatbaar dam, embryo's en pups opleveren.
   2. Gebruik tamoxifen bij doses van 0,5 - 1,5 mg (of 17-50 mg/kg) voor dammen zwangere met embryo's op ~ E9 en daarna. Gebruik een naald 30G voor alle injecties.
      Opmerking: Filtratie door een 0,22 µm filter wordt meestal gebruikt om alle mengsels vóór injectie te steriliseren.
6. Voor de analyse van het klonen, gebruik intraperitoneaal injecties van hoge doses van 4-OH-tamoxifen (b.v., 5 mg/kg) of tamoxifen (b.v., 50 mg/kg) naar aanleiding van meerdere cellen.
   1. Afzonderlijke cellen markeren, Titreer beneden de 4-OH-tamoxifen of tamoxifen dosis zodanig dat in het weefsel van belang (dat wil zeggen, de aorta), hebben bijna alle embryo's geanalyseerd (zoals hieronder beschreven aan het einde van deze sectie) ofwel geen cellen met het label of de alleen cellen van een enkele kleur; Dit is de drempel dosis.
7. Om te markeren van cellen in de midden-eind zwangerschapsduur periode en op te sporen hun lot of tentiemechanismen in de postnatale muis, injecteren progesteron in de intraperitoneaal holte van de zwangere dam gelijktijdig met tamoxifen in een 1:2 (progesteron: tamoxifen) dosis verhouding.
   Opmerking: Tamoxifen doses zijn 17-50 mg/kg en progesteron doses zijn 8,5-25 mg/kg (dat wil zeggen, de helft van de tamoxifen doses). De progesteron-injectie kan arbeid door ~ 1-2 dagen vertragen.
8. Euthanaseren de dam zwanger van embryo's van een gewenste leeftijd met een daling van de open methode, waar de dam wordt gebracht in een recipiënt met katoen of gaas doorweekt met onverdunde Isofluraan. Bevestigen van dood door het openen van de borstholte om te induceren pneumothorax, door het verwijderen van de vitale organen en/of door het uitvoeren van cervicale dislocatie.
9. Reinigt de buik met 70% ethanol. Gebruik schaar aan de buik opengesneden en ontleden uit de baarmoeder. De embryo's verwijderen van de baarmoeder en zorgvuldig het scheiden van de embryo's van de placenta en de dooierzak met pincet.
10. De embryo's op E15 of ouder door het uitvoeren van de cervicale dislocatie of onthoofding met chirurgische schaar of een scherp mes euthanaseren.
    Opmerking: Embryo's jonger dan E15 snel sterven na euthanasie van de moeder en/of de verwijdering van de embryo's van moeder.
11. Plaats van de embryo's in ijskoude PBS en knip een klein stukje van de staart met behulp van schaar naar genotype voor de verslaggever CreER en Cre.
12. Bevestigen de embryo's in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C voor 2 h. Wash de embryo's die drie keer in PBS en vervolgens uit te broeden de embryo's 30 gewichtspercenten sacharose in PBS in 15 mL buizen, te wachten totdat ze zinken, die tot twee dagen kan duren.
13. Vulling kunststof bevriezing mallen tot 2/3 van maximumgehalte met optimale snijden temperatuur (OCT) samengestelde. Plaats elk embryo verticaal in de mal, volledig ondergedompeld in oktober Incubate gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om te minimaliseren van bubbels.
14. Plaats bevriezing weefsel blokken rechtop in een droog ijs, 70% ethanol bad te bevriezen. Opslaan van de blokken op -80 ° C.
15. De cryostaat temperatuur instellen tot-22 ° C en blokken voor het genereren van transversale secties door de gehele aorta, 10-20 µm dik gesneden. Droog de dia's op RT gedurende 30 minuten vóór ze op te slaan op -80 ° C.
16. Ontdooi de dia's op RT, beschermd tegen licht te vermijden het bleken van fluorophores. Wassen van de dia's met PBS-Tween20 0,1%.
    1. Voor de analyse van het klonen, vlek van de dia's voor kernen (DAPI, 5 mg/mL) en direct beeld andere fluorophores in de regenboog Cre-verslaggever (Cerulean: 433-nm excitatie max, 475-nm uitstoot max; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
       1. Gebruik de volgende filters voor het opsporen van fluorophores met een rechtop fluorescente microscoop: DAPI (excitatie max/bandbreedte 350/50 nm, emissie max/bandbreedte 460/50 nm), Cerulean (excitatie 436/20 nm, emissie 480/40 nm), texas rood (excitatie 560 / 40 nm, emissie 630/75 nm) en aangepaste filter te scheiden van mCherry van mOrange (excitatie 577/10 nm, emissie 630/50 nm).
    2. Voor de toewijzing van de lot met de mTmG Cre verslaggever, detecteren GFP (484 nm, 510 nm), door rechtstreeks imaging of door middel van immunokleuring. Gebruik een GFP-filter (excitatie 470/40 nm, emissie 525/50 nm) voor beeldbewerking met een rechtop fluorescente microscoop.
    3. Voor immunokleuring, incubeer secties met primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C, wassen met 0,1% Triton X-100 in PBS en vervolgens uit te broeden met secundaire antilichamen voor 1 h. Gebruik anti-CD31 (eindconcentratie 0.0016 mg/mL), anti-GFP (0,006 mg/mL) en Cy3-direct geconjugeerd anti-SMA (1:500 in de uiteindelijke verdunning) primaire antilichamen en gebruik secundaire antibodies rechtstreeks geconjugeerd met fluorophores (1:500 in de uiteindelijke verdunning) (Zie de Tabel van de materialen).
17. Afbeelding van dia's met een rechtop fluorescente microscoop (vergroting: 4 X - 20 X) of confocal microscoop (10 X-63 X). Voor hoge vergroting, gebruikt u een confocal imaging 63 x olie doelstelling met een numerieke diafragma voor 1.4-0.6 en een framegrootte van 1024 x 1024 pixels.

2. Explant embryonale Aorta cultuur

Opmerking: deze benadering werd eerder gebruikt om te evalueren van de rol van integrine beta3 in stenose van de transplanteren Eln ^{(- / -)} embryonale aorta ^{9 , 18}.

1. een getimede-zwangere dam bij E15.5 door overtollige Isofluraan inademing, per stap 1.8, boven euthanaseren.
2. Oogst en de embryo's, per stappen 1.9-1.10, boven euthanaseren.
3. Plaats van het embryo blindelings en pin van de uitgebreide ledematen aan de dissectie van bestuur. Visualiseren met een dissectie stereoscoop en gebruik van schaar te snijden een verticale insnijding uit de buik door het borstbeen naar het bovenste thorax. Ontleden weg de thymus, luchtpijp, longen, slokdarm, darm en lever.
4. Het hart ventrally met pincet Trek zachtjes en gebruiken van schaar te ontleden de aorta uit de buurt van de dorsale aspect van de borst- en buikholte Holten. Om los van de aorta, snijd het op de proximale wortel en de distale abdominale posities.
5. Plaatst de aorta in ijskoude steriel PBS in een cel cultuur kap. De aorta overbrengen in een 24-well-plate en cultuur het in DMEM met 0,5% FBS gedurende maximaal 24 uur bij 37 ° C.
   Opmerking: Het kweekmedium kunnen worden aangevuld met een blokkerende antilichamen (bijvoorbeeld anti-integrine αvβ3 antilichaam aan 0,02 mg/mL ⁹; Zie de Tabel van materialen) of een farmacologische agent.
6. Wassen van de aorta tweemaal met PBS en vervolgens repareren met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten
7. Wassen driemaal met PBS en overdracht de aorta naar een 1.5-mL tube met 30% sacharose in PBS. Nadat de aorta zinkt, maken bevroren weefsel blokken, gesneden secties en immunokleuring, zoals hierboven beschreven in stappen 1.13-1.15,.

3. SMC isolatie van de perinatale Aorta

Opmerking: deze aanpak wordt momenteel gebruikt om te vergelijken van de biologie van de aorta SMCs geïsoleerd van Eln ^{(- / -)} en wildtype perinatale muizen.

1. Een RattenUitrustingen pup op postnatale dag (P) 0,5, cervicale dislocatie of door onthoofding met chirurgische schaar of een scherp mes, zoals beschreven in stap 1.10, boven euthanaseren.
2. Stap 2.3 uitvoeren en vervolgens, na het openen van de borstkas en de buik, punctie linkerventrikel met 23G naald. Gebruik plastic buizen de naald verbinden met steriel PBS-bevattende spuit gehouden verticaal op een verhoogde positie zodat PBS mondt uit in het linkerventrikel door de zwaartekracht. Toestaan infusie van steriele PBS in linkerventrikel totdat de lever blanches.
   1. Gebruik van pincet te verwijderen adventitial weefsel aan de buitenkant van de aorta en het ontleden van de aorta, zoals beschreven in stap 2.4.
3. Verteren de aorta in één enkele oplossing van DMEM (500 µL) aangevuld met 225 U/mL collagenase, 2,25 U/mL elastase en 1 x antibiotica-antimycotic gedurende 45 minuten bij 37 ° C. handmatig schudden de buis elke 5-10 min.
4. In de steriele cel cultuur kap, titurate het verteerd weefsel door pipetteren op en neer met een 200-µL pipet voor het genereren van een eencellige schorsing. Spoel de eencellige suspensie voor een tube van 15 mL, voeg toe 2 mL DMEM en centrifugeer bij 920 x g gedurende 5 min op 25 ° C.
5. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 3 mL SMC kweekmedium (DMEM met 10% FBS aangevuld met 1 µg/mL rhFGF, rhEGF van 10 µg/mL, 100 U/mL penicilline/streptomycine en 2,5 µg Mo/mL amfotericine B). Overbrengen naar een cultuur van 35-mm plaat.
   Opmerking: Op de eerste isolatie, ~ 400.000 cellen worden verkregen van een enkele P0.5 wildtype aorta; ~ 300.000 van deze cellen zijn SMCs.
6. Cultuur de cellen bij 37 ° C en omzetten in verse SMC kweekmedium om de 3 dagen. Het gebruik van standaardtechnieken met trypsine, passage de cellen bij confluent. Gebruik voor experimenten, cellen van passages 3-7.

4. Subcutane osmotische mini pomp plaatsing in zwanger (of niet-zwanger) muizen

Opmerking: deze benadering was vroeger continu leveren een farmacologische agent (bijvoorbeeld integrine β3 en β5-remmer cilengitide) embryo's in de baarmoeder ⁹. De pomp werd ingevoegd in de zwangere dam bij E13.5 en behield tot aan de bevalling.

1. Anesthetize de muizen met 2-5% Isofluraan in zuurstof (debiet van 1 L/min) voor inductie en 1-3% voor onderhoud. Gebruiken de teen-snuifje reflex om te controleren van het niveau van de anesthesie en de verdoving agent naar wens aanpassen. Beheren van subcutane buprenorfine (0.05 - 0.1 mg/kg) voor analgesie.
De onderrug scheren
2. met tondeuse. Gebruik van steriele gordijnen, handschoenen en instrumenten en het onderhoud van de muizen op een chirurgische verwarmingsplaat tijdens chirurgie.
3. Plaatst u elke muis in liggend en de rug Schrob met betadine gevolgd door isopropyl alcohol. Ongeveer 3-5 cm rostraal van de basis van de staart in de onderrug, maken met een scalpel een horizontale huid incisie 0.5 - 1.0 cm in lengte zonder de onderliggende spier verwonden.
4. Een hemostat invoegen in de incisie en maken een subcutane zak rostrally voor de innesteling van de pomp door het openen en sluiten van hemostat kaken.
5. Vul een osmotische mini pomp met de agent van keuze, volgens de fabrikant ' s richtsnoeren (Zie de Tabel van de materialen). Plaats van de gevulde pomp in de zak en sluit de incisie met clips of niet-absorbeerbare draadjes van de 6-0. Zorgen dat de totale tijd die chirurgische minder dan 10 min. is
De muizen elke 15 min volgen
6. post-operatively, totdat zij hebben hersteld van sternale ligcomfort. Beheren van subcutane buprenorfine (0.05 - 0.1 mg/kg) elke 6-12 h gedurende 48 uur. Wanneer de muizen hebben volledig hersteld van de narcose, controleren hen dagelijks. De clips verwijderen of hechtingen 7-10 dagen na chirurgie.

Resultaten

In een representatieve klonale analyse van SMCs in embryo's mutant voor Eln (het gen codering van de extracellulaire matrix proteïne elastine), Eln^(+/-), Acta2-CreER^T2 muizen werden gedekt door Eln^(+/-) muizen ook dragen de Multi kleur ROSA26R^(Rb/Rb) verslaggever. Zoals beschreven in stap 1, stekkers werden gecontroleerd, zwangere dammen waren geïnduceerde met een enkele tamoxifen injectie (1,5 mg) bij E12.5 en zij w...

Discussie

In tegenstelling tot het uitgebreide onderzoek van de lymfkliertest aorta en zijn grote takken in volwassen pathologische condities, zoals de modellen van atherosclerose, is minder bekend met betrekking tot de voedselproductie en de pathogenese van de embryonale en perinatale aorta. Hier, wij concentreren op de embryonale/perinatale aorta, specifiek het SMCs, en protocollen om te bestuderen van de aorta door middel van in vivo, weefsel explant, verstrekken en SMC isolatie benaderingen. Deze gratis methoden biede...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tamoxifen	Sigma	T5648
Corn oil	Sigma	C-8267	Vehicle voor tamoxifen
4-OH-tamoxifen	Sigma	H7904	Actieve metaboliet van tamoxifen
Progesteron	Sigma	P8783-5G	Gebruik in de helft van de concentratie van tamoxifen
OCT compound	Sakura tissue tek	4583	Voor het maken van cryoblokken
Cryomolds	Polysciences inc	18986
DAPI	Sigma	D9542	IHC kleuring van de kern, eindconcentratie 5 mg/mL
Cy3 rechtstreeks geconjugeerd anti-SMA antilichaam	Sigma	A2547	IHC kleuring van SMA, eindverdunning 1:500
Anti-CD31 antilichaam	BD Pharmingen	550274	IHC kleuring van GFP, eindconcentratie 0,006 mg/mL
Anti-GFP antilichaam	Thermo Fisher Scientific	A-11121	IHC kleuring van CD31, eindconcentratie 0,0016 mg/mL
Secundair antilichaam geit anti-konijn, Alexa 647	Life Technologies	a21244	IHC kleuring, eindconcentratie 0,004 mg/mL
Secundair antilichaam geit anti-konijn, Alexa 488	Life Technologies	a11008	IHC kleuring, eindconcentratie 0,004 mg/mL
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10567-014	Voor celcultuur
FBS	Thermo Fisher Scientific	10437028
Anti-integrine bèta3 blokkerend antilichaam	BD Biosciences	553343	Clone 2C9.G2, eindconcentratie 0,02 mg/mL
Collageenase	Worthington Biochemical Corp	44H14977A	Voor het verteren van aorta
Elastase	Worthington Biochemical Corp	34K15139	Voor het verteren van aorta
Antibioticum-antimycoticum (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Recombinant humaan FGF	Promega	G5071
Recombinant humaan EGF	Promega	G5021
Penicilline/streptomycine (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Weefselcultuur platen	Corning	CLS430165
Alzet osmotische mini-pomp	Durect Corporation	2001
ECLIPSE 80i Upright Fluorescerende Microscoop	Nikon
TCS SP5	Leica
Branson Sonifier 450	VWR
Myh11-CreERT2 muizen	The Jackson Laboratory	19079
Acta2-CreERT2 muizen			Verkregen van het laboratorium van Dr. Pierre Chambon en Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 muizen	The Jackson Laboratory	8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) muizen	The Jackson Laboratory	026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) muizen	The Jackson Laboratory	006148
ROSA26R(Confetti/Confetti) muizen	The Jackson Laboratory	13731
ROSA26R(Rb/Rb) muizen	Lab of Dr. Irv Weissman		Verkregen van het laboratorium van Dr. Irv Weissman