Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een methode om bacterie-cineffecten op de Gut Microbiota van Muizen te beoordelen

13.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56053

⸱

25 juli 2017

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 2Department of Food Safety and Infection Biology, Norwegian University of Life Sciences (NMBU), 3Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid (UCM), 4Faculty of Chemistry, Biotechnology and Food Science, Norwegian University of Life Sciences (NMBU)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Bacteriocinen zijn van mening dat ze een sleutelrol spelen bij het definiëren van microbiële diversiteit in verschillende ecologische niches. Hier beschrijven we een efficiënte procedure om te beoordelen hoe bacteriocinen invloed hebben op de darmmicrobiota samenstelling in een diermodel.

Samenvatting

Zeer intrigerende vragen ontstaan ​​door onze vooruitgangskennis over de microbiota samenstelling van de darm en de relatie met de gezondheid, met name met betrekking tot de factoren die bijdragen tot het behoud van het bevolkingsbalans. Er zijn echter beperkte beschikbare methodologieën om deze factoren te evalueren. Bacteriocinen zijn antimicrobiële peptiden geproduceerd door vele bacteriën die een concurrentievoordeel voor voedselverwerving en / of niche-vestiging kunnen veroorzaken. Veel probiotische melkzuurbacteriën (LAB) stammen hebben een groot potentieel om de gezondheid van mens en dier te bevorderen door de groei van pathogenen te voorkomen. Ze kunnen ook gebruikt worden voor immunomodulatie, omdat ze bacteriocinen produceren. Echter, de antagonistische activiteit van bacteriocinen wordt normaal gesproken bepaald door laboratorium bioassays onder goed gedefinieerde maar over vereenvoudigde condities in vergelijking met de complexe darmomgeving bij mensen en dieren, waar bacteriën multifactoriale invloeden uit de gastheer en honderden microbiële soorten s hebbenDezelfde niche hebben. Dit werk beschrijft een volledige en efficiënte procedure om het effect te beoordelen Van een verscheidenheid aan bacteriocinen met verschillende doelspecificiteiten in een muizenstelsel. Veranderingen in de microbiota samenstelling tijdens de bacteriocine behandeling worden gecontroleerd met behulp van composities 16S rDNA sequencing. Onze aanpak maakt gebruik van zowel de bacteriocinproducenten als hun isogene, niet-bacteriocine-producerende mutanten, waarbij de laatstgenoemde het vermogen geeft om bacteriocine-gerelateerd te maken van niet-bacteriocinverwante modificaties van de microbiota. De fecale DNA-extractie en 16S rDNA sequencing methoden zijn consistent en vormen samen met de bioinformatica een krachtige procedure om zwakke veranderingen in de bacteriële profielen te vinden en om correlaties te bepalen in termen van cholesterol en triglyceride concentratie tussen bacteriepopulaties en gezondheidsmarkers. Ons protocol is generisch en kan dus gebruikt worden om andere verbindingen of voedingsstoffen te bestuderen met de mogelijkheid om de gastheermicro te veranderenRobiota samenstelling, hetzij bij het bestuderen van toxiciteit of gunstige effecten.

Inleiding

Bacteriocinen zijn antimicrobiële peptiden geproduceerd door een breed scala van bacteriële species 1 , 2 . Deze verbindingen en hun producenten, met name LAB, zijn al decennia wereldwijd verkend en geëxploiteerd voor hun mogelijke toepassingen in voedselbehoud en medicijnen 3 . Verschillende bacteriocinen zijn bekend om belangrijke pathogenen te doden, waaronder soorten Listeria, Enterococcus, Staphylococcus en Bacillus . Sommige bacteriocinen hebben zelfs de mogelijkheid om de immuunrespons 4 te moduleren. Veel bacteriocinen hebben relatief smalle spectra, een eigenschap die in sommige toepassingen zeer gewaardeerd wordt. Bijvoorbeeld, sommige smal spectrum bacteriocinen kunnen worden gebruikt om specifieke activiteit te richten tegen geselecteerde groepen van problematische bacteriën, zonder veel storing op de commensale of voordelige flora die dezelfde niche delen; Dit is vooral essentieel in de gut envirOnment, waar talrijke gunstige microben op interactieve en dynamische wijze gedijen 5 . Bacteriocinen zijn ook zeer aantrekkelijk voor profylactisch of probiotisch gebruik, omdat ze de (uit) groei van pathogenen, pathobionten of opportunistische bacteriën kunnen onderdrukken die de darmhomeostase 6 , 7 kunnen onevenwichtigen.

In termen van hun aard en fysisch-chemische eigenschappen zijn bacteriocinen zeer divers, omdat ze verschillende structuren, doelspecificiteiten, werkingsmethoden, enz. Hebben . De meeste bacteriocinen zijn in detail in de in vitro- instellingen bestudeerd, maar zeer weinig zijn in voedsel getest Matrices 8 , 9 of in vivo, zoals in een darmdarm 6 , 10 . De in vitro eigenschappen kunnen in grote mate verschillen wanneer ze in vivo worden beoordeeld door de complexiteit oF de darmomgeving en ook aan vermoedelijke onbedoelde effecten op gunstige bacteriën. De meeste probiotica zijn LAB. Ze produceren een scala aan andere metabolieten, waaronder korte keten vetzuren, die bekend zijn om de fysiologie van de gastheer te beïnvloeden, evenals antimicrobiële eigenschappen aan te tonen tegen bepaalde bacteriën. Daarom, in het geval van probiotische stammen die bacteriocinen produceren, is het het beste om realistische analyses vast te leggen, zoals gezonde dieren met normale microbiota.

In de huidige studie bieden we een strategie die het mogelijk maakt om het effect van verschillende bacteriocine-producerende stammen te beoordelen, waarvan bacteriocinen verschillende remmende spectra hebben op gezonde muizen. Onze strategie omvat het voeden van muizen met isogene niet-bacteriocin mutanten, die de differentiatie van bacteriocine-gemedieerde effecten mogelijk maken van niet-bacteriocine gemedieerde effecten. Sequencing 16S rDNA maakt het mogelijk om de dynamische veranderingen van de bacteriële populatie in de darm te volgen. SubsEquivalent statistische analyse deciphers correlaties tussen bacteriële soorten en ook tussen bacteriële soorten en gemeten fysiologische parameters ( bijvoorbeeld lichaamsgewicht, serum biochemische parameters, enz. ). Wij geloven dat het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, ook van toepassing is op andere probiotische of prebiotische toepassingen buiten de studie van bacteriocinen bij levende dieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Zorg en behandeling moeten worden uitgevoerd bij een gespecialiseerde dierenverzorgingseenheid. De hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de bijbehorende ethische commissie van de Universiteit van Valencia en de lokale overheden, in overeenstemming met de beginselen van laboratoriumdierzorg die verplicht zijn bij de Europese Unie en 2010/63 / EU en de Spaanse regering RD 53/2013 over de bescherming van dieren Gebruikt voor wetenschappelijke doeleinden, om het 3R-principe in dierproeven te respecteren (Vervanging, Reductie, Verfijning).

1. Bevroren Bacteriële Culturen gebruikt om muizen inoculeren

  1. Inademen individuele stammen van LAB in 5 ml hart-hart infusie (BHI) medium en groei ze gedurende 20 - 24 uur (overnacht) bij 30 ° C.
  2. Verdun elke nacht bacteriële cultuur 100-voudig in BHI door overdracht van 2 ml nachtcultuur tot 200 ml BHI. Kweek ze bij 30 ° C gedurende 20 - 24 uur.
    OPMERKING: Stammen die in deze studie worden gebruikt, staan ​​vermeld in tabel 1.
  3. Harvest ceLls door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  4. Verwijder de supernatant en doe de cellen twee keer door elke celpellet in 100 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op te suspenderen en de cellen te verzamelen zoals in stap 1.3.
  5. Na de tweede was, schakel elke celpelletje op in 20 ml ijskoude 15% glycerol in PBS.
  6. Aliquot de cel suspensie in 1 ml volumes in buizen en sla ze vervolgens op -80 ° C tot gebruik.
    OPMERKING: Cellen dienen binnen 1-2 maanden na dit punt te worden gebruikt.
  7. Bepaal het celnummer vóór de opslag en voorafgaand aan toediening, zodat het aantal levende cellen die aan muizen wordt gegeven, bekend is.
    1. Voor celtelling, maak tienvoudige seriële verdunningen van cellen in ijskoude 0,9% natriumchloride (NaCl) oplossing. Spreid 100 μl van elke verdunning op een BHI agarplaat. Incubeer overnacht (20 - 24 uur) bij 30 ° C voor celgroei en kolonievorming, de laatste om kolonievormende eenheden (cfu) / ml te bepalen.
  8. Om bacteriën bevattend drinkwater te maken, verdun cellen van elke bacteriële veercultuur in 100 ml steriel, gefilterd drinkwater, met een uiteindelijke gemiddelde cfu van 10 9 / ml water. Tabel levende cellen, na de verdunning en na 24 uur eenmaal per week gedurende de eerste twee weken van de bacteriebehandeling, voor bacteriële overlevingsbeoordeling.

2. Muizenassay en Experimenteel Ontwerp

Opmerking: Specifieke pathogeenvrije (SPF) BALB / c jonge vrouwelijke muizen (6 - 8 weken) zijn nodig voor dit experiment; Hier werden in totaal 100 dieren gekocht.

  1. Geef de muizen het vrije toegang tot gepelleteerde voedsel en water gedurende het experiment.
  2. Ontwerp het experiment en bereken de kracht.
    1. Als elke behandeling zijn eigen controle heeft, gebruik dan een gepaarde case-control design (t-test). Gebruik een voorlopige test om de gemiddelde en standaardfout van de belangrijkste effect (en) te bepalen die worden bepaald.
    2. Optimaliseer de kracht van de test en het aantal dieren die per groep nodig zijn, met behulp van verschillende methoden en vrij beschikbare programma's 11 .
    3. Om te testen voor de effecten van bacteriocine producent versus niet-producenten stammen, gebruik 9 dieren per experimentele toestand.
      OPMERKING: Dit nummer werd bepaald op basis van de experimentele standaardfout en leverde een bevredigende kracht (0,7-1,0) en een significantieniveau lager dan 0,05.
      OPMERKING: In het gegeven voorbeeld werden 11 groepen muizen gemaakt, een per kooi. Tien koeren stemden overeen met de behandelingen met 5 bateriocine-producerende stammen en de overeenkomstige 5 isogene niet-producerende stammen; de 11e kooi had 10 muizen en vormden de onbehandelde controle.
  3. Na de aankomst van de muizen naar de veeteelt, verspreid ze de dieren in kooien en oorlabels om de individuele tracking mogelijk te maken. Acclimatiseer de muizen naar de veeteelt en voorwaarden voor een week voor proceeding.
  4. Bereid het drinkwater voor bacteriën op, zoals beschreven in stap 1.8, en plaats drinkwaterflessen in de bijbehorende onafhankelijke kooien die duidelijk geïdentificeerd zijn, zodat de muizen in elke kooi dezelfde waterfles delen.
    OPMERKING: De controlegroep moet in een aparte kooi worden gehouden, zonder contact met de geteste bacteriën.
  5. Bereid elke dag een nieuwe fles met vers drinkwater (100 ml) op en voeg vers ontdooide bacteriële suspensies toe. Doe dit gedurende 15 opeenvolgende dagen.
  6. Volg de bacteriënbehandeling met een periode van twee weken, gedurende welke periode muizen bacteriënvrij water drinken ( Figuur 1 ).

3. Verzamelen van monsters

  1. Verzamel fecale monsters.
    1. Bereid geautoclaveerde kooien (leeg) en steriele tang en label steriele 1,5 ml buizen voor elke muis.
    2. Verzamel monsters op hetzelfde moment van de dag om variaties in de microbiota samenstelling te vermijden tijdens de thIn de loop van een dag. Voor optimale resultaten verzamelt u verse monsters apart.
      OPMERKING: Vroeg in de ochtend verzamelen feces bij voorkeur muizen die spontaan ontlopen.
    3. Maak een lege kooi met 70% alcohol schoon en plaats een muis binnen. Laat het ontlasten en verzamel 2 - 4 fecale pellets met behulp van steriele tang en plaats ze in 1,5 ml buizen.
      OPMERKING: soms is het voldoende om de muisstaart naar boven te houden; De ontlasting kan dan direct van de anus in een buis worden verzameld.
    4. Ontvang fecale monsters van elke muis eenmaal per week tijdens het vier weken experiment ( Figuur 1 ). Verzamel de eerste monsters op dag een (T0, tijd nul), net voor de blootstelling van de muizen aan bacteriën. Verzamel de volgende fecale monsters op dagen 7, 14, 21 en 28.
    5. Koel de monsters bij 4 ° C tot hun transport naar het laboratorium, waar ze bij -80 ° C bevroren zijn. Plan alvast en geef voldoende opslagdozen, als een groot aantal feCal samples worden verzameld tijdens het experiment.
  2. Weeg alle muizen elke week op de dag van de fecale verzameling.
  3. Het verzamelen van bloed monsters van het gezicht ader uit alle muizen op de 15e dag, de laatste dag van bacteriën toediening en bepalen de niveaus van triglyceriden, totaal cholesterol, high-density lipoproteïne (HDL) en lage dichtheid lipoproteïne (LDL) in het bloed serum.
    OPMERKING: Ervaren personeel moet het bloed verzamelen om de stress in de dieren te verminderen.

4. LAB Counting en Bacteriocin Activity

  1. Weeg één fecale pellet van elk monster in een 1,5 ml buis en voeg een voldoende volume ijskoude 0,9% NaCl toe om een ​​10% (w / v) oplossing te verkrijgen. Gebruik steriele micropestles voor 1,5 ml buizen om de fecale suspensie te homogeniseren en tienvoudige seriële verdunningen te bereiden in ijskoude 0,9% NaCl.
  2. Tel het totale aantal LAB cellen.
    1. Vervolg verdunde cellen (100 μl) naar 4 ml voorverwarmde MaN Rogosa Sharpe (MRS) zachte agar (50 ° C, 0,8% agar). Meng door vortexing voordat de cellen op een solide MRS agarplaat gieten (1,5% agar).
    2. Droog de plaat door het deksel 5-10 minuten in de steriele afzuigkap uit te zetten voordat de cellen gedurende 20-24 uur bij 30 ° C worden geïncubeerd voor celgroei en kolonievorming.
  3. Tel bacteriocine producerende cellen.
    1. Vervolg verdunde cellen (100 μl) van de bacteriocine-producent naar 4 ml voorverwarmde MRS zachte agar (50 ° C, 0,8% agar), meng door vortexen en giet de cellen op een MRS agarplaat (1,5% agar); Deze laag heet de eerste laag.
    2. Breng nog eens 4 ml celvrije MRS zachte agar (0,8% agar) over op de eerste laag om alle cellen in de zachte agar te embedden.
      OPMERKING: Deze laag is bedoeld om te voorkomen dat cellen als kolonies op het oppervlak van de agarplaten groeien. Cellen die op het oppervlak groeien, worden gemakkelijk verplaatst bij het gieten van indicatorcellen op de top (stap 4.3.4) enZal daarom de uitlegging van de resultaten compliceren. Deze laag wordt de tweede laag genoemd.
    3. Droog de plaat door het deksel 5-10 minuten af ​​te zetten in de steriele kap voordat u 20 tot 24 uur bij 30 ° C wordt geïncubeerd voor celgroei en kolonievorming.
    4. Om bacteriocine-producerende kolonies te identificeren, meng 40 μL van een overnachtingskweek van een geschikte indicatorstam, zoals getoond in Tabel 1 , met 4 ml voorverwarmde zachte agar. Giet het mengsel op de plaat; Deze laag wordt aangeduid als de derde laag.
    5. Droog de plaat door het deksel 5-10 minuten af ​​te zetten in de steriele kap voordat u 20 tot 24 uur bij 30 ° C wordt geïncubeerd voor celgroei en kolonievorming.
      OPMERKING: Bacteriocine-producerende kolonies hebben duidelijke (remmende) zones rond de kolonies ( Figuur 2 ).

5. DNA-extractie, 16S rDNA amplificatie en sequentiebepaling

OPMERKING: stappen fOf DNA-extractie worden beschreven voor het gebruik van een commerciele kit ( bijvoorbeeld Realpure "SSS" Kit).

  1. Suspenseer 1 - 2 fecale muizenpellets (~ 200 mg) in 300 μl lysisoplossing.
  2. Breng het monster over naar een 2 ml microtube waarin ongeveer 0,5 g glazen kralen (diameter: 0,1 mm) eerder zijn geplaatst.
  3. Voeg 1 μl mutanolysine bij 10 U / μL en 2 μl lysozym bij 20 mg / ml aan elk monster toe en incubeer gedurende 40 tot 60 minuten bij 37 ° C. Ga door met een van de standaardprotocollen voor DNA-extractie uit fecale monsters 12 .
  4. Breng twee cycli van de kraalstapjes aan, 1 min elk.
  5. Voeg 2 μl eiwitase K toe en meng het grondig.
  6. Incubeer gedurende 20 minuten en vortex elke 5 minuten.
  7. Koel de monsters op 37 ° C en voeg 1 μL 5 μg / ml RNase A toe aan het monster. Meng grondig.
  8. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 - 60 minuten.
  9. Koel de monsters naar kamertemperatuur en voeg 180 μL toeVan eiwit neerslag oplossing. Vortex krachtig bij maximale snelheid gedurende 20 - 30 s.
  10. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 5 minuten. Als er deeltjes in het supernatant drijven, incubeer de monsters 5 minuten in ijs en centrifugeer dan opnieuw.
  11. Breng de supernatant die het DNA bevat, over op een nieuwe 1,5 ml microtube die 300 μl isopropanol bevat.
  12. Meng door de buizen 20-30 keer om te keren en incubeer gedurende 1 uur bij -20 ° C. Alternatief, inkubeer de buizen langer gedurende een periode ( bijv. 'S nachts).
  13. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 2 minuten.
  14. Verwijder de supernatant en droog de buis op absorberend papier. Voeg 300 μl 70% ethanol toe om de DNA-pellet te wassen.
  15. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 minuut, verwijder de supernatant en laat de pellet drogen gedurende ongeveer 15 minuten.
  16. Zodra de pellet droog is, voeg 100 μL steriel water of Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) buffer toe en laat de pellet opnieuw suspenderen.
  17. Om eventuele remmende effecten te eliminerenVerbindingen tijdens de volgende stappen, reinig het DNA. Meng geëxtraheerd DNA met 2 volumes (200 μl) buffer NTI om de bindingsomstandigheden voor stap 5.15 aan te passen.
  18. Plaats een siliciumdioxide bevattende PCR opruimingskolom in een verzamelbuis (2 ml) en laad het monster.
  19. Centrifuge gedurende 30 s bij 11.000 x g. Weggooi de doorstroom.
  20. Was het siliciumdioxide membraan met 700 μl buffer NT3 en herhaal stap 5.16.
  21. Droog het siliciumdioxide membraan door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 11.000 xg om eventuele resterende ethanolhoudende wasbuffer NT3 te verwijderen.
  22. Breng de kolom over naar een nieuwe 1,5 ml microtube en incubeer gedurende 2 - 5 minuten bij 70 ° C voor de totale verwijdering van de ethanol.
  23. Voeg 30 μl water van PCR-gehalte toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 70 ° C. Eluten door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 11.000 x g.
  24. Kwantificeer het DNA met behulp van een UV / Vis spectrofotometer of een fluorometrische methode.
  25. Normaliseer en pool de DNA-monsters van muizen die dezelfde kooi delen bij ea Ch tijdspunt.
  26. Om individuele variaties in de tijd te waarnemen, sequentie DNA-monsters van drie willekeurig geselecteerde muizen uit de controle en twee andere willekeurige kooien op dagen 0, 14 en 28.

6. 16S rRNA-genversterking en sequentiebepaling

  1. Bereid een bibliotheek van geamplificeerde 16S rRNA genen op. Versterk de V3-V4 regio van het bacteriële 16S rRNA gen 5 met behulp van voorwaartse en omgekeerde primers met geschikte overhang adapters:
    5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
    5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 '
  2. Controleer de versterkte banden met behulp van elektroforese met 1% agarosegel.
  3. Reinig de polymerase kettingreactie (PCR) producten met behulp van magnetische kralen voor ampliconzuivering.
  4. Ga door met de volgende stappen zoals aangegeven door de fabrikant volgens het gebruikte massieve sequencing platform> 6.

7. Data analyse en statistieken

  1. Kwaliteit filtering (meestal uitgevoerd bij sequencing faciliteiten).
    1. Filter de ruwe leest data en de-multiplex met behulp van de bij de apparatuur geleverde software.
    2. Behandel het gepaarde einde met behulp van de UPARSE-pijpleiding 13 die is geïmplementeerd in USEARCH 14 (versie 7.0.1090). Voeg de gepaarde eindjes samen en voeg een kwaliteitsfiltrering toe met een maximale verwachte fout (maxee) waarde van 1.0. Wis sequenties minder dan 150 nt. Dereplicate sequenties om singletonen te weggooien.
    3. Cluster de sequenties in operationele taxonomische eenheden (OTU's) op een 97% sequentie identiteit en gebruik UCHIME 15 om chimere sequenties te filteren.
  2. OTU plukken, taxonomische opdracht en fylogenetische reconstructie, en diversiteitsanalyses en visualisaties.
    1. Verwerk de OTU's met behulp van Quantitative Insights IntO Microbiële Ecologie (QIIME) 16 .
    2. Kies en koppel de representatieve OTU's tegen de Greenses core set database 17 met PyNAST 18 met een minimum identiteit van 75% (standaard).
    3. Taksonomie toewijzen aan de uitgelijnde sequenties met behulp van het programma Ribosomal Database Project (RDP) 19 met een vertrouwen van 0.8.
    4. Normaliseer de OTU-tabel op de volgorde van het monster met de laagste sequentiediepte.
    5. Bouw een filogenische boom uit uitgelijnde sequenties met behulp van Fast Tree 20 na de filtratie stap om zeer variabele gebieden en posities te verwijderen die alle gaten bevatten. Gebruik deze boom om alfa- en bèta-diversiteiten te berekenen en om berekeningsgraden en Shannon-indexen te berekenen.
    6. Om ongewenste UniFrac-afstandswaarden 21 te genereren en te visualiseren, gebruik de principe-coördinaatanalyse (PCoA).
      OPMERKING: Voor sTATISTISCHE analyse verschillende softwarepakketten kunnen gebruikt worden, bijvoorbeeld R22 of statistische technieken toegepast binnen QIIME 16.
    7. Voor de vergelijking van Shannon-indexen van diversiteit tussen de verschillende behandelingen, gebruik een ANCOVA, gezien tijd als een doorlopende afhankelijk variabele in R.
    8. Vergelijk de afstanden tussen behandelingen in PCoA in QIIME met behulp van een tussentijdse student's t-test en bereken de nonparametrische p-waarden met 1.000 Monte Carlo-permutaties met behulp van de Bonferroni-correctie.
    9. Analyseer voor correlaties tussen de relatieve overvloed aan specifieke OTU's en andere gemeten parameters, zoals serum niveaus van cholesterol, HDL, LDL, enz. , Met behulp van Pearson correlatie analyse. Gebruik hiervoor CoNet 23 met de daarop volgende visualisatie van correlatienetwerken met behulp van Cytoscape 3.1.1 24 .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De productie van bacteriocinen is beschouwd als een positieve probiotische eigenschap in LAB, aangezien men ervan uitgaat dat de groei van opportunistische bacteriën en pathogenen wordt voorkomen. Het doel van dit werk was om de capaciteit van bacteriocinen te laten zien om de darmmicrobiota populaties te moduleren in een muismodel. Hiervoor is een procedure ontwikkeld om het effect van de inname van bacteriocine-producerende stammen en hun isogene niet-producerende stammen te vergelijke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven procedure is gebruikt om te bepalen of veranderingen in de microbiota gebonden zijn aan gezondheid of leeftijd. Verschillende delen van het protocol zijn belangrijk, maar onder hen kunnen de ontlasting, het selecteren van het DNA-fragment dat wordt gedetecteerd en geanalyseerd, en het uitvoeren van de DNA-extractie en bioinformatische analyse zeker de meest kritische punten zijn. Bemonstering is cruciaal omdat muizen om ethische redenen niet moeten worden gestresseerd en omdat het bekend is dat het aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de EER Grant NILS Coordinated Mobility of Researchers (Referentie 017-ABEL-CM-2013) bedanken voor wetenschap en duurzaamheid. CB en GP-M. Werden ondersteund door de subsidie ​​AGL2015-70487-P van het Spaanse ministerie van Economie en Concurrentievermogen. OCOU en DBD werden ondersteund door een strategisch beurs programma voor voedselwetenschappelijk onderzoek van de Noorse Université of Life Sciences (NMBU) (project 1205051025). We willen ook Inmaculada Noguera bedanken voor haar hulp bij dierenverzorging en bemonstering en Jezus Dehesa voor zijn hulp om de beschikbaarheid van laboratoriummateriaal in de dierenfaciliteit te waarborgen. We waarderen ook professor Lars-Gustav Snipen voor zijn advies over statistieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Balb/c muizen (vrouwtje)HarlanMuizen moeten 6 - 8 weken oud zijn
Kunststof petrischaalThermo Scientific101VR20
Brain-Heart-Infusion bouillonConda1400.00
Europese Bacteriologische AgarPronadisa1800.00
Agarose D1 Low EEOPronadisa8010.00
1x TAE bufferThermo Scientific15558042
MRS bouillonDifco288130
PBS-tablettenSigmaP4417-100TAB
weegschaalMettler ToledoPB602-S
steriele pincettenLevantina de Laboratorios S.L.260-3710014
MicrocentrifugeEppendorf5424
CentrifugeHermleZ383K
natriumchlorideAppliChem Panreac121659.1211
Realpure SSS KitReal Life Science Solutions, Durviz, SpanjeRBME04 (300 ml)
IsopropanolAppliChem Panreac131090.1611
EthanolAppliChem Panreac131086.1214
Qubit fluorometerInvitrogen
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32851
AMPure XP beadsBeckman Coulter Genomics, USAA63881 (60 ml)
PerfeCta NGS library quantification kitQuanta BioSciences, Maryland, USA733-2300
MiSeq v3 reagent kitIllumina, San Diego, California, USAMS-102-3003
Primers voor 16S rRNA-genamplificatiePrimers bevatten V3-V4-regio van bacterieel 16S rRNA-gen en Illumina overhang adaptors: 5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ en 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’
Nextera XT Index kitFC-131-1002Indices en Illumina sequencing adaptors
Micropestel voor 1,5 mL buisjes, Eppendorf / Sigma, Ref.SigmaZ317314-1PAK
Glaskralen, 0,1 mm diameterBiospec Products11079-101
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up KitMacherey-Nagel740609.25
Omni Bead Ruptor 24Omni International Inc.19-040
mutanolysineSigmaM9901-10KU
lysozymRoche10837059001
proteinase KRoche3115887001
RNase ASigmaR4875

Referenties

  1. Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
  2. Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
  3. Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
  4. Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait? Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
  5. Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
  6. Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
  7. Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
  8. Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
  9. Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
  10. Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113(2012).
  11. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
  12. Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036(2016).
  13. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
  14. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  15. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
  16. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
  17. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  18. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
  19. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  20. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490(2010).
  21. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
  22. R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
  23. Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606(2012).
  24. Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  25. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1(2013).
  26. Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787(2013).
  27. Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
  28. Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
  29. Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
  30. Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
  31. Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
  32. Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Muismodel16S rDNA-sequencingextractie van fecaal DNAisogene stammenbacteriële culturenCFU-tellingbehandeling van drinkwaterverzamelen van fecale monsters
Een methode om bacterie-cineffecten op de Gut Microbiota van Muizen te beoordelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.