High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Summary

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

Abstract

De codering van biologische informatie die toegankelijk is voor toekomstige generaties wordt over het algemeen bereikt via veranderingen in de opeenvolging van DNA. Ingezien langlevende overname gecodeerd in eiwit conformatie (eerder dan reeks) lang als paradigma-shifting maar zeldzaam. De beste gekarakteriseerd voorbeelden van dergelijke epigenetische elementen zijn prionen, die een zelfassemblerende gedrag dat de erfelijke manifestatie van nieuwe fenotypen rijden kan bezitten. Vele archetypische prionen weergeven een opvallende N/Q-rijke reeks bias en monteren in een amyloïde schoot. Deze ongebruikelijke kenmerken hebben laten weten dat de meeste screening inspanningen te identificeren van nieuwe prion-eiwitten. Ten minste drie bekende prionen (met inbegrip van de stichtende prion, PrP^Sc) doen echter niet deze biochemische kenmerken haven. Daarom ontwikkelden we een alternatieve methode om de sonde van de werkingssfeer van de op basis van eiwitten overname op basis van een eigenschap van massa-actie: de voorbijgaande overexpressie van prion-eiwitten verhoogt de frequentie waarop zij een zelf-templating bevleesdheid verwerven. Dit document beschrijft een methode voor het analyseren van de capaciteit van de gist ORFeome te verduidelijken met overname op basis van eiwitten. Met behulp van deze strategie, eerder vonden we dat > 1% van gist eiwitten kon brandstof de opkomst van biologische eigenschappen die waren langlevende, stabiel, en vaker dan genetische mutatie is ontstaan. Deze aanpak kan worden gebruikt in hoge-doorvoer over de gehele ORFeomes of als een gerichte screening paradigma voor specifieke genetische netwerken of milieu prikkels. Net zoals voorwaartse genetische schermen talrijke ontwikkelings- en signalering trajecten definiëren, bieden deze technieken een methodologie voor het onderzoek naar de invloed van overname op basis van eiwitten in biologische processen.

Introduction

Biologische systemen ervaren vaak voorbijgaande fluctuaties in eiwit overvloed. Het is onduidelijk of deze hebben een blijvende invloed bij het vormgeven van het fenotype van een organisme of van de toekomstige generaties. De bekendste voorbeelden van deze biologie betrekken een zeldzame klasse van eiwitten, prionen, die het ontstaan van erfelijke eigenschappen genoom ongewijzigd rijden. In plaats daarvan zenden deze proteinaceous en infectious deeltjes fenotypen via zichzelf onderhoudende wijzigingen aan eiwit conformatie^1,2. Dit soort erfenis werd ontdekt als de oorzaak van de ongewone erfenis patronen van een verwoestende neurodegeneratieve ziekte. Echter, studies in organismen variërend van schimmels aan zoogdieren^{3,4,5,6,7,8,9,10} aangezien is gebleken dat het prion-achtige elementen adaptieve waarde kunnen verlenen. Prionen hebben echter werd bekeken als een fascinerende maar zeldzame biologische eigenaardigheid.

Deze heersende wijsheid is gedeeltelijk gehouden omdat de karakterisering van proteïne gebaseerde overname lang met een klein aantal voorbeelden is beperkt. Recente systematische screening inspanningen hebben deze foto aanzienlijk verruimd door het identificeren van verschillende nieuwe bona fide prionen¹¹ en bijna twee dozijn eiwit domeinen¹² met het vermogen om brandstof prion-achtige conformationele conversie. Echter, omdat deze benaderingen over het algemeen op sterke aminozuur reeks vooroordelen gericht hebben, delen de prionen die zijn ontdekt de biochemische eigenschappen van de stichtende gist prionen [PSI⁺]^13,14, [URE3]¹⁵en^1611,[RNQ⁺]. Deze omvatten: 1) modulaire domeinen die rijk zijn aan lang polymere stukken van asparagine (N) en glutamine (Q), 2) vergadering in een amyloïde [PRION⁺] conformatie^17,18,19, en 3) volledige afhankelijkheid van disaggregase Hsp104 functie voor trouwe vermeerdering van moeder op dochter^13,20,21. Inderdaad, vele bona fide prionen, waaronder [GAR⁺], [Het-s], en zelfs de oorspronkelijke prion (PrP^Sc), onder dergelijke strenge criteria zouden worden gemist. Misschien nog belangrijker, zou ze kunnen vangen elke nieuwe mechanismen van overname op basis van eiwitten²². De echte biologische breedte van dergelijke verschijnselen kunnen dus veel vaker in de natuur dan eerder aangenomen.

Om te onderzoeken van deze vraag, een high-throughput, Proteoom-brede strategie werkte. Een kenmerk van alle prionen, met inbegrip van PrP^Sc, [GAR⁺], en [Het-s], is dat de voorbijgaande overexpressie van de causale eiwitten sterk verhoogt het tarief van prion overname^{15,23,24,25,26}. We profiteerde van deze functie te systematisch vragen, over de gehele gist ORFeome, als stabiel op basis van eiwitten, epigenetische Staten kon worden gestart door Transient inducerende de overexpressie van individuele eiwitten. Het is bekend dat eiwit overexpressie fenotypen²⁷kunt wijzigen. Prion-eiwitten zijn echter ongebruikelijk omdat hun tijdelijke overproductie produceert een verandering in fenotype thats erfelijke voor vele honderden generaties na de initiële overexpressie. Eerder hebben we voordeel van deze functie, alsook de ongewone erfenis patronen van op basis van eiwitten genetische elementen te identificeren van tientallen eiwitten die kunnen heritably bedrading opnieuw fenotypische landschappen zonder te veranderen van het genoom²⁸. Hoewel sommige geïdentificeerd waren eiwitten voorheen bekend als prionen, de meeste waren niet onderstrepen van de kracht van deze aanpak te ontdekken van nieuwe vormen van overname op basis van eiwitten.

Protocol

1. Initiële overexpressie

1. Transformeer de gistcellen (in dit geval, BY4741 MAT a haploïden) die eerder zijn gekweekt in YPD-vloeistof (10 g gistextract, 20 g pepton en 20 g glucose per 1 L) met de gewenste kandidaatconstructen uit de FLEXGene ORFeome bibliotheek (gist ORF's onder controle van een galactose-induceerbare promotor in de URA3-gemarkeerde centromereplasmide back-bone, pBY011²⁹).
   OPMERKING: Alle groeistappen worden uitgevoerd bij 30 °C en bij atmosferische CO₂-niveaus (407,05 ppm), tenzij anders vermeld.
2. Gebruik autoclaved tandenstokers om vier aparte kolonies van deze transformaties te plukken om als biologische replica's te dienen. Laat ze 48-72 uur groeien in 150 µL van SRaffinose-URA (0,74 g van CSM-URA, 6,7 g van gist-stikstofbasis zonder aminozuren, en 20 g raffinose per 1 L) in 96-wells platen. Inoculeer kolonies van de eerste ORF in put A1 van alle platen, kolonies van de tweede ORF in A2 van alle platen, etc.
   OPMERKING: Om het grootste dynamische bereik voor fenotypische detectie te bereiken, wordt een 2-voudige verdunningsreeks rond de LD50-concentratie van een bepaalde stressor aanbevolen. Dit kan vooraf worden gedaan om de optimale concentratie te bepalen waarbij zowel verbeterde als verminderde groei kan worden waargenomen.
3. Bereid tegelijkertijd aparte 384-wells platen met 45 µL van SGal-URA met de stressors van belang (bijv., mangaanchloride bij 20 mM) per put. Inoculeer deze plaat op dezelfde manier als in stap 1.3.
   OPMERKING: Om het grootste dynamische bereik voor fenotypische detectie te bereiken, wordt een 2-voudige verdunningsreeks rond de LD50-concentratie van een bepaalde stressor aanbevolen. Dit kan vooraf worden gedaan om de optimale concentratie te bepalen waarbij zowel verbeterde als verminderde groei kan worden waargenomen.
4. Als een laatste parallelle controle, inoculeer een derde 384-wells plaat op dezelfde manier, met dezelfde stressor in medium dat geen plasmide-expressie zal induceren. Zorg ervoor dat de plaat 45 µL van SD-URA (0,74 g van CSM-URA, 6,7 g van gist-stikstofbasis zonder aminozuren, en 20 g glucose per 1 L) per put bevat en is geïnoculeerd zoals in stappen 1.3 en 1.4.
5. Plaats de platen met cellen onmiddellijk op een microplate stacker en stel het protocol in voor een continue lus van 72 uur, meting van de OD₆₀₀ met een microplate lezer uitgerust met stackers bij kamertemperatuur en atmosferische CO₂ (407,05 ppm).
   Opmerking: De frequentie van de groeimeting zal afhangen van het aantal platen (uiteindelijk bepaald door het aantal genen en condities dat de onderzoeker wil onderzoeken) dat in de run wordt gebruikt. Hoe meer platen worden gebruikt, hoe langer het duurt voordat de plate reader een lus voltooit en dus hoe langer de tijd tussen metingen (meettijd per plaat is ~45 s, afhankelijk van de gebruikte instrumentatie).
6. Na de groeimetingen, gebruik dezelfde liquid handling robot om 1 µL per put van de SGal-URA-geïnduceerde culturen (d.w.z. diegenen die eiwit-overexpressie hebben ervaren) over te brengen naar nieuwe 384-wells platen met 45 µL van SD-URA per put (medium dat geen eiwitexpressie van het plasmide toestaat).
   1. Gevoer in parallel analoge inoculaties van een tweede set van 384-wells platen met 45 µL van SD-URA per put van de culturen die zijn gekweekt in SD-URA in aanwezigheid van de stressors (d.w.z. diegenen van stap 1.5).
   2. Laat de platen 48 uur groeien bij 30 °C tot verzadiging in een bevochtigde kamer (d.w.z. een afsluitbare plastic bak met een vochtige papieren handdoek erin).
7. Neem de platen van de vorige stap en reïnoculeer 1 µL per put in 384-wells platen met 45 µL van SD-URA. Voer vervolgens een afzonderlijke reïnoculatie uit van 1 µL per put van dezelfde bronplaat in een afzonderlijke 384-wells plaat met 45 µL van SD-URA met de stressor.
   OPMERKING: Dit zal bepalen of de gevoeligheids-/resistentiefenotypen voor een stressor aanhouden nadat de eiwit-overexpressie is gestopt.
8. Plaats de platen met cellen onmiddellijk op een microplate stacker en stel het protocol in voor een continue lus van 48 uur meting van de OD₆₀₀ met een microplate lezer bij kamertemperatuur en atmosferische CO₂ (407,05 ppm).
9. Exporteer de tijd versus OD₆₀₀ metingen als een XY-tabel met behulp van de plate reader software. Groepeer kolommen van de OD₆₀₀ voor elke biologische replicaat samen en bereken het gemiddelde. Maak een XY-plot van tijd versus OD₆₀₀ om groeicurven te genereren.
   1. Vergelijk de groeisnelheden van culturen die waren onderworpen aan een eerdere overexpressie (d.w.z. die oorspronkelijk geïnduceerd waren in galactose-houdend medium voordat ze opnieuw werden geïnoculeerd in SD-URA) versus culturen die dat niet waren (d.w.z. die in glucose waren gepropageerd), zoals eerder beschreven³⁰.
10. Voor culturen die significante groiveschillen vertonen in reactie op een bepaalde stressor, afhankelijk van voorouderlijke eiwit-overexpressie, neem 1 µL van elke biologische replicaat, verdun het in 10 mL water en plateer vervolgens 50 µL op platen met 5-

Results

Overexpressie van eiwitten staat erom bekend cellulaire fenomenen dramatisch te veranderen²⁷. Inderdaad, met een initiële screeningsaanpak werden honderden nieuwe fenomenen reproduceerbaar teruggevonden uit de overexpressie van klonen uit de gist ORFeome met slechts tien stressoren. De hierboven beschreven assays maken echter een beoordeling mogelijk of cellen enige langdurige stabiele fenomenen behouden na deze overexpressie. Een eiwit dat in staat is om een derge...

Discussion

De eerste gist prionen werden geïdentificeerd door hun ongewone fenotypes en verbijsterende patronen van overerving. De kenmerken van deze prionen werden vervolgens gebruikt om te bouwen van algoritmen en computerhulpmiddelen aan het scherm voor extra prion-eiwitten. De hier beschreven methode in tegenstelling, is experimenteel en voorbijgaande overexpressie maken een duurzame verandering-een stabiele staat-gecodeerd in eiwit conformatie afhankelijk. Echter, als de efficiëntie van het "zaaien" prion vergadering door over...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guanidine hydrochloride	Sigma	Cat#G3272-25G	Chemisch
Mangaanchloride	Sigma	Cat#M8054-100G	Chemisch
Ethidiumbromide	Sigma	E1510	Chemisch
5-Fluoroorotinezuur	Sigma	Cat#F5013-50MG	Chemisch
BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0)	Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998	N/A	Giststam
BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0)	Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998	N/A	Giststam
Hsp70 (K69M)	Jarosz et al., 2014b	N/A	Plasmid
FLEXGene bibliotheek	Hu et al., 2007	N/A	Plasmid bibliotheek
Dextrose (glucose)	Fisher Scientific	D16-3	Media component
Raffinose	Sigma	R0250-25G	Media component
Galactose	Fisher Scientific	BP656-500	Media component
CSM	Sunrise Science	1001-100	Media component
CSM-URA	Sunrise Science	1004-100	Media component
CSM-LYS	Sunrise Science	1032-100	Media component
CSM-MET	Sunrise Science	1019-100	Media component
CSM-LYS-MET	Sunrise Science	1035-100	Media component
Gistextract	Fisher Scientific	BP1422-2	Media component
Pepton	Research Products International	P20240-5000	Media component
Bacto-pepton	BD	211677	Media component
Glycerol	EMD Millipore	GX0185-2	Media component
Giststikstofbasis zonder aminozuren	BD	291920	Media component
Agar	IBI Scientific	IB49172	Media component
Adeninesulfaat	Sigma	A3159-25G	Media component
Kaliumacetaat	Sigma	P1190-500G	Media component
Uracil	Sigma	U0750-100G	Media component
Histidine	Sigma	H8000-100G	Media component
Leucine	Sigma	L8000-25G	Media component
Lysine	Sigma	L5501-25G	Media component
RNase I	Thermo Fisher Scientific	EN0601	Enzyme
Biotinyleerde DNase	Thermo Fisher Scientific	AM1906	Enzyme
zymolyase 100T (gist lytisch enzym)	Sunrise Science	N0766555	Enzyme
Microplate reader	BioTek	Synergy H1	Apparatuur
Microplate stacker	BioTek	BioStack3	Apparatuur
Plate filler	BiotTek	EL406	Apparatuur
Vloeistofmanipulerende robot	Beckman Coulter	Biomek FX	Apparatuur