Methodenartikel

Screening van bioactieve nanodeeltjes in phagocytische immuuncellen voor inhibitors van Toll-achtige Receptor Signalering

DOI:

10.3791/56075

⸱

26 juli 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TLR-signalering speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van vele menselijke ontstekingsziekten, en het regelen van TLR-reacties door bioactieve nanopartikels wordt geacht in veel ontstekingsomstandigheden gunstig te zijn. THP-1-cel-gebaseerde reportercellen bieden een veelzijdig en robuust screeningsplatform voor het identificeren van nieuwe remmers van TLR-signalering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farmacologische regulering van Toll-like receptor (TLR) reacties houdt veel belofte in de behandeling van veel ontstekingsziekten. Er zijn echter tot nu toe beperkte verbindingen beschikbaar om TLR-signalering te verzachten en er zijn geen klinisch goedgekeurde TLR-remmers (behalve het anti-malariale geneesmiddel hydroxychloorquine) in klinisch gebruik geweest. In het licht van snelle vooruitgang in nanotechnologie kan manipulatie van immuunresponsiviteit met behulp van nano-apparaten een nieuwe strategie voor de behandeling van deze ziekten bieden. Hierin presenteren we een high-through screening methode voor het snel identificeren van nieuwe bioactieve nanodeeltjes die TLR-signalering in fagocytische immuuncellen remmen. Dit screening platform is gebouwd op THP-1 cel-gebaseerde reporter cellen met colorimetrische en luciferase assays. De reportercellen worden gemanipuleerd uit de humane THP-1 monocytische cellijn door stabiele integratie van twee induceerbare reporterconstructen. Men spreekt een uitgescheiden embryonaal alkalisch fosfatase (SEAP) gen uitOnder de controle van een promoter die door de transcriptiefactoren NF-KB en AP-1 induceerbaar is en de ander een gesecretiseerd luciferase-reportergen uitdrukt onder de controle van promoters die door interferon regulerende factoren (IRF's) kunnen worden geïducueerd. Op de TLR-stimulatie activeren de reportercellen Transcriptiefactoren en produceren vervolgens SEAP en / of luciferase, die gedetecteerd kan worden met behulp van hun overeenkomstige substraatreagentia. Met behulp van een bibliotheek van hybriden van peptide-gouden nanopartikel (GNP), die in onze vorige studies werd vastgesteld, identificeerden we één peptide-GNP-hybride die de twee armen van TLR4-signalencascade effectief kon remmen, veroorzaakt door zijn prototypische ligand, lipopolysaccharide (LPS). De bevindingen werden gevalideerd door standaard biochemische technieken waaronder immunoblotting. Uit verdere analyse bleek dat deze loodhybride een breed remmend spectrum had, dat optrad op meerdere TLR-trajecten, waaronder TLR2, 3, 4 en 5. Deze experimentele benadering zorgt voor een snelle beoordeling van deRa nanodeeltjes (of andere therapeutische verbindingen) kan specifieke TLR-signalering moduleren in fagocytische immuuncellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toll-achtige receptoren (TLR's) zijn een van de belangrijkste elementen in het aangeboren immuunsysteem, die bijdragen aan de eerste lijn van verdediging tegen infecties. TLR's zijn verantwoordelijk voor het detecteren van invasieve pathogenen door een repertoire van pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (of PAMPs) te herkennen en defensie reacties te verhogen via een cascade van signaaltransductie 1 , 2 . Er zijn 10 menselijke TLR's geïdentificeerd; Behalve TLR10 waarvoor het ligand (en) onduidelijk blijven, kan elke TLR een aparte, geconserveerde groep PAMPs herkennen. TLR2 en TLR4, die hoofdzakelijk op het celoppervlak bevinden, kunnen bijvoorbeeld lipoproteïnen en glycolipiden detecteren van respectievelijk Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën; Terwijl TLR3, TLR7 / 8 en TLR9, voornamelijk aanwezig in de endosomale compartimenten, RNA- en DNA-producten kunnen detecteren van virussen en bacteriën 3 . Wanneer stimuleert door PAMP's, leiden TLR's essentiële immuunresponsen door pro-inf vrij te gevenLammatory mediators, recruiterende en activerende effector immuuncellen, en coördinatie van daaropvolgende adaptieve immuunevenementen 4 .

De TLR signaleertransductie kan eenvoudig worden ingedeeld in twee hoofdwegen 5 , 6 . Eén is afhankelijk van de adapter-eiwit-myeloïde differentiatie factor 88 (MyD88) - de MyD88-afhankelijke route. Alle TLR's, behalve TLR3, gebruiken deze route om de nucleaire factor kappa-lichtketenversterker van geactiveerde B-cellen (NF-KB) en mitogeengeassocieerde proteïnekinasen (MAPKs) te activeren, wat leidt tot de expressie van pro-inflammatoire mediators zoals TNF- A, IL-6 en IL-8. De tweede route gebruikt TIR-domeinbevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF) - de TRIF-afhankelijke of MyD88-onafhankelijke route - om interferon (IFN) regulerende factoren (IRF's) en NF-KB te activeren, wat resulteert in de productie van Type I IFN's. Intacte TLR-signaleringIs van cruciaal belang voor onze dagelijkse bescherming tegen microbiële en virale infecties; Gebreken in TLR signaleringswegen kunnen leiden tot immunodeficiëntie en zijn vaak schadelijk voor de menselijke gezondheid. 7

TLR-signalering is echter een 'dubbelzijdig zwaard' en overdreven, onbeheerde TLR-activering is schadelijk. Overactieve TLR-responsen dragen bij aan de pathogenese bij veel acute en chronische ontstekingsziekten van de mens 8 , 9 . Bijvoorbeeld, sepsis, die wordt gekenmerkt door systemische ontsteking en multi-orgaanbeschadiging, komt voornamelijk door acute, overweldigende immuunresponsen tegen infecties, waarbij TLR2 en TLR4 een cruciale rol spelen in de sepsis pathofysiologie 10 , 11 , 12 . TLR5 heeft bovendien bijgedragen tot de chronische longontsteking van patiënten met cystische fibrose 13, 14 . Bovendien is gedisreguleerde endosomale TLR-signalering (bijvoorbeeld TLR7 en TLR9) sterk geassocieerd met de ontwikkeling en progressie van verschillende auto-immuunziekten, waaronder systemische lupus erythematosus (SLE) en reumatoïde artritis (RA) 15 , 16 . Deze convergerende bewijslijnen identificeren TLR-signalering als een potentieel therapeutisch doel voor veel ontstekingsziekten 17 .

Hoewel de farmacologische regulering van TLR-reacties waarschijnlijk gunstig is bij veel ontstekingsomstandigheden, zijn er helaas momenteel zeer weinig verbindingen die klinisch beschikbaar zijn om TLR-signalering 9 , 17 , 18 te remmen. Dit komt mede door de complexiteit en redundantie van de TLR-trajecten die betrokken zijn bij de immuunhomeostase en ziektepatologie. Daarom, op zoek naar roman, potenT therapeutische middelen om meerdere TLR signaleringswegen te targeten, kan een fundamentele kloof overbruggen en de uitdaging overwinnen om TLR-remmers in de kliniek te ontwikkelen.

In het licht van de snelle vooruitgang in nanoscience en nanotechnologie ontstaan ​​nanodevices als de volgende generatie TLR modulatoren door hun unieke eigenschappen 19 , 20 , 23 . De nanoschaalgrootte zorgt ervoor dat deze nano-therapeutica een betere bioverdeling en duurzame circulatie 24 , 25 , 26 hebben . Ze kunnen verder worden gefunctionaliseerd om te voldoen aan de gewenste farmacodynamische en farmacokinetische profielen 27 , 28 , 29 . Meer spannend, de bioactiviteit van deze nieuwe nanodevices vloeit voort uit hun intrinsieke eigenschappen, die kunnen worden aangepast aanSpecifieke medische toepassingen, in plaats van gewoon te handelen als een leveringsmiddel voor een therapeutisch middel. Bijvoorbeeld werd een HDL-achtige nanopartikel met hoge dichtheid ontworpen om TLR4-signalering te remmen door het TLR4-ligand LPS 23 te verwijderen . Daarnaast hebben we een peptide-gouden nanodeeltjeshybridsysteem ontwikkeld, waar de versierde peptiden de oppervlakte-eigenschappen van de goudnanodeeltjes kunnen veranderen en hen in staat stellen verschillende bioactiviteiten 30 , 31 , 32 , 33 te hebben . Dit maakt ze een speciale klasse drug (of "nano-drug") als de nano-therapeutica van de volgende generatie.

In dit protocol presenteren we een aanpak om een ​​nieuwe klasse van peptide-gouden nanopartikel (peptide-GNP) hybriden te identificeren die veelvoudige TLR signaleringsbanen in phagocytische immuuncellen 32 kunnen remmen , 33 . De aanpak is gebaseerd op commercieel verkrijgbare THP-1 reportercellijnen. De reportercellen bestaan ​​uit twee stabiele, induceerbare reporterconstructen: één draagt ​​een gescheiden embryonaal alkalisch fosfatase (SEAP) gen onder de controle van een promoter die door de transcriptiefactoren NF-KB en activator eiwit 1 (AP-1) induceerbaar is; De andere bevat een gescheiden luciferase reporter gen onder de controle van promoters die door interferon regulerende factoren (IRF's) inducerbaar zijn. Bij TLR-stimulatie leidt de signaaltransductie naar de activatie van NF-KB / AP-1 en / of IRF's, die de reportergenen aan geheime SEAP en / of luciferase aanzet; Dergelijke gebeurtenissen kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd met behulp van hun bijbehorende substraatreagentia met een spectrofotometer of luminometer. Met behulp van deze aanpak om onze eerder gevestigde bibliotheek van peptide-GNP-hybriden te screenen, identificeerden we leidende kandidaten die de TLR4-signaleringswegen sterk kunnen remmen. De remmende werking van het loodpeptide-BNP-hybriden werden dan gevalideerd met behulp van een andere biochemische benadering van immunoblotting, en geëvalueerd op andere TLR-pathways. Deze aanpak zorgt voor snelle en effectieve screening van nieuwe agenten die TLR-signaleringswegen richten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van celcultuurmedia en reagentia

  1. Bereid het volledige celcultuurmedium R10 op door de supplementen van 10% foetaal runder serum (FBS), 2 mM L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat in het RPMI-1640 medium toe te voegen.
    1. Bereid het selectiecultuurmedium R10-Z door het antibiotica Zeocin (200 μg / ml) op te voegen aan R10 voor het handhaven van de expressie van SEAP onder controle van NF-KB / AP-1-activering. Om te selecteren voor cellen die zowel SEAP als luciferase reportergen uitdrukken, voegt u beide Zeocine (100 μg / ml) en blasticidin (10 μg / mL) toe aan R10 (als R10-ZB).
  2. Bereid de SEAP substraatoplossing door één zakje substraatpoeder (bv . QUANTI-Blue) op te lossen in 100 ml ultrauw, endotoxinevrij water in een schone 125 ml glazen fles.
    1. Wrijf de oplossing voorzichtig en incubeer het gedurende 1 uur bij 37 ° C om de volledige oplossing van de substraten te verzekeren.
    2. Filter de oplossing met behulp van een 0,2 μm membraan om de steriliteit ervan te waarborgen (optioneel) en op te slaan bij 4 ° C tot 2 weken voor gebruik.
  3. Bereid de luciferase substraatoplossing door één zakje van het substraatpoeder ( bijv . QUANTI-Luc) op te lossen in 25 ml ultrauw, endotoxinevrij water in een steriele 50 ml centrifugebuis.
    1. Nadat u het poeder volledig heeft opgelost, gebruik de oplossing onmiddellijk. Alternatief, sla de oplossing op bij 4 ° C (tot een week) of bij -20 ° C (tot een maand) voor gebruik.
      VOORZICHTIG: Beide substraatoplossingen zijn lichtgevoelig en vermijden dat de blootstelling aan de zon mogelijk is. Meerdere vriezen-ontdooi cycli van de oplossing kunnen instabiliteit van het substraat veroorzaken en de houdbaarheid ervan verkorten.
  4. Bereid de voorraadoplossing van phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) op in moleculaire kwaliteit dimethylsulfoxide (DMSO) om een ​​concentratie van 500 μg / ml te hebben. Maak aliquots van de voorraadoplossing (10 μl in een 500 μl buis) en opslaan bij -20 ° C.
  5. Bereid LPS (E-coli K12) voorraadoplossing in steriel, endotoxinevrij water op met een concentratie van 5 mg / ml, en maak aliquots voor langdurige opslag bij -20 ° C. Bereid een werkende LPS-oplossing op door de voorraad LPS te verdunnen in fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) bij een concentratie van 100 μg / ml en op te slaan bij -20 ° C voor gebruik.
    VOORZICHTIG: Het reagensbereiding voor cultuurgebruikt dient in een biosafety-kast te worden uitgevoerd en alle containers dienen voor gebruik te worden gesteriliseerd. Herhaalde vries-ontdooicyclussen van PMA en LPS oplossingen moeten vermeden worden.

2. Cultuur van THP-1 reporter cel afgeleide macrofagen

  1. Gebruik twee THP-1 reporter cellijnen: THP-1-XBlue en THP-1-Dual cellen. De eerste heeft een SEAP reporter gen gecontroleerd door NF-KB / AP-1, en de laatste heeft een dual reporter gen systeem, hetzelfde SEAP reporter gen en een IRF gecontroleerd luciferase gen. DeIr-kweekprocedures zijn identiek behalve de selectiecultuurmedia.
    1. Doei een werkcelcel (~ 5 x 10 6 cellen) in 10 ml R10-medium, draai de cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in 10 ml R10-medium en verplaats ze in een T75-kweekfles. Vervang het kweekmedium elke 2-3 dagen tot cellen een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml bereiken.
    2. Wanneer de celgroei zijn capaciteit bereikt, kunnen de cellen doorgaan om de celdichtheid te verkleinen tot in het bereik van 2-5 x 10 5 cellen / ml, zodat de cellen kunnen blijven groeien.
    3. Begin na ten minste 1 passage de cellen te cultiveren in het selectiecultuurmedium: R10-Z voor THP-1-XBlue en R10-ZB voor THP-1-Dual. Na het cultiveren van de cellen met selectiecultuurmedium voor ten minste 1 doorgang zijn cellen klaar voor het experiment.
      VOORZICHTIG: Cell overgrowing kan leiden tot significante cel dood; De cellevendabiliteit moet> 98% handhaven. Hou een record van het passagenummer als de celIk kan anders na veel passages (> 20 passages) anders gedragen.
      OPMERKING: Celcultuurflessen kunnen meerdere keren hergebruikt worden om kosten te besparen; Deze praktijk kan echter het risico op algemene verontreiniging en kruisbesmetting onder verschillende flessen verhogen (indien tegelijkertijd verschillende cellen worden behandeld). Tijdens media-uitwisseling en celdoorgang wordt de centrifugatie gedurende 5 minuten ingesteld op 300 xg.
  2. Om verslaggevercelassay uit te voeren, zaaien cellen in een 96-putjes platbodige celcultuurplaat en onderscheiden ze in macrofagen. De procedures worden beschreven in het volgende.
    1. Breng de cellen van de fles over naar een centrifugebuis, draai de cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten, en resusteer ze in het R10-medium bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. Voeg aliquots van de PMA-oplossing in de cel suspensies met een uiteindelijke concentratie van 50 ng / ml.
    2. Plaats 100 μl van de cel suspensies in elke put van de 96-weLl plaat met behulp van een multi-channel pipet. Incubeer de plaat bij 37 ° C (in een celkweek incubator) gedurende 24 uur.
    3. Na incubatie, verwijder het kweekmedium zorgvuldig door gebruik te maken van een vacuüm aspirator (of met een multikanaalpipet) en doe de cellen zachtjes met PBS (100 μL / putje) twee keer; Voeg 100 μl vers R10 medium in elke put toe. Rust de cellen gedurende 2 dagen in een incubator voordat u de reporter test uitvoert.
      VOORZICHTIG: De ruststap is zeer belangrijk om de cellen na de PMA-stimulatie te kunnen kalmeren naar hun normale stille status. Dit kan de achtergrondsignalen van de reportergenen onder ongestimuleerde omstandigheden aanzienlijk verminderen.
      OPMERKING: Na 24 stimulatie met PMA worden cellen gedifferentieerd naar macrofagenachtig fenotype, met een kenmerk van celadhesie onderaan de put en een morfologische eigenschap van pseudopodie.

3. Screening voor potentiële TLR4-nano-remmers met behulp van de Reporter Cellen

OPMERKING: Aangezien TLR4-signaling zowel MyD88-afhankelijke en TRIF-afhankelijke routes gebruikt, wordt het geselecteerd als het primaire doel om een ​​breed scala aan TLR-signaalwegen te omvatten. THP-1-XBlue-reportercellen worden gebruikt om de NF-κB / AP-1 activatie hoofdzakelijk te onderzoeken, terwijl THP-1-Dual-cellen voor IRF-activering van de TRIF-afhankelijke signaaltransductie zijn.

  1. Identificeer de optimale LPS dosis door een dosis-responscurve voor het screenen te genereren.
    1. Verdun de werkende LPS oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,01 - 100 ng / mL in R10 medium (maak verdunning in log10-schaal). Leg het bordontwerp op en maak een verdunning in een 96-putjes ronde bodem kweekplaat. Zorg ervoor dat elke put minstens 110 μL oplossing na verdunning heeft.
    2. Verwijder het kweekmedium voorzichtig uit de celzaadplaat (uit 2.2.3) onder gebruikmaking van een vacuüm aspirator.
    3. Breng het LPS-bevattende R10-medium op dat in de verdunningsplaat (3.1.1) is bereidNto de cultuurplaat volgens de indeling van de monsters. Incubeer de plaat bij 37 ° C (in een celkweek incubator) gedurende 24 uur.
    4. Om 24 uur zorgvuldig overbrengen van de supernatanten (80 μL / putje) in een nieuwe 96-putjes ronde bodemplaat. Doe de colorimetrische en / of luciferase luminescentie-analyse op deze oplossingen onmiddellijk of sla ze bij 4 ° C (enkele uren) of -20 ° C (dagen) voor de analysevorming.
      OPMERKING: Het ontwerp van plaatuitleg moet eenvoudig en duidelijk zijn voor experimenten en data-analyse. Voor elke conditie dienen 2-4 replicaten te worden overwogen. Altijd een negatieve controlegroep (LPS null) bevatten. Het is aan te raden om THP-1-XBlue-cellen te gebruiken voor NF-κB / AP-1 activering, aangezien de Dual-cellen een relatief hoge achtergrond hebben van NF-κB / AP-1 activatie nadat ze in macrofagen zijn gedifferentieerd. Het is echter wel mogelijk om de Dual-cellen te gebruiken voor het rapporteren van zowel NF-KB / AP-1 als IRF-activering.
  2. Ontwikkel de kleurImetrische analyse voor de NF-KB / AP-1 activatie en de luciferase luminescentie analyse voor IRF activatie.
    1. Om de NF-κB / AP-1 activatie te beoordelen, overzetten 20 μL supernatant van elk monster in een nieuwe 96-putjes platbodemkweekplaat; En voeg 180 μL voorverwarmde SEAP substraatoplossing toe in elke put. Incubeer de plaat gedurende 1 - 2 uur bij 37 ° C om de kleurontwikkeling mogelijk te maken (roze tot donkerblauw). Verzamel de absorptie bij 655 nm op een plaatlezer.
      VOORZICHTIG: De incubatietijd kan worden gevarieerd op basis van de kleurontwikkeling (30 minuten tot incubatie per nacht). Het is aan te bevelen om te wachten tot de optische dichtheid (OD) van de donkerste kleur boven 1 bereikt, terwijl de verzadiging van de kleurontwikkeling vermeden wordt (OD> 3).
    2. Voor de analyse van IRF-activering, overbrengen 10 μL supernatant van elk monster in een 96-brede heldere witte bodemplaat. Voeg de luciferase oplossing (50 μL) toe en haal de luminescentie w onmiddellijk opEll door goed.
      OPMERKING: Het is sterk aanbevolen om een ​​luminescentieplatenlezer te gebruiken met een automatische injectiefunctie om ervoor te zorgen dat de consistentie in de luminescentie lezing van goed tot goed en van plaat tot bord zorgt. Als de substraatoplossingen handmatig worden geïnjecteerd, zorg dan voor een consistente incubatietijd en leesopstelling voor elke put.
  3. Voer de screeningsassay uit op verschillende peptide-GNP-hybriden met 10 ng / mL LPS-stimulatie (gebaseerd op 3.1). Volg dezelfde procedure in 3.2 voor de ontwikkeling van de verslaggever.
    1. Concentreer de peptide-BNP-hybriden tot 200 nM in R10-medium met behulp van de centrifugatiemethode. Centrifugeer 20 volumes van de hybride oplossing (10 nM) bij 18.000 xg gedurende 30 minuten en verwijder de supernatanten zorgvuldig. Haal de hybriden (onderaan de buis) in een buis, doe ze twee keer met PBS, en herbinnen de hybriden in een volume van het R10-medium.
    2. Meng gelijke volumes van de geconcentreerde hybriden en deLPS (20 ng / ml) die R10 medium bevat om een ​​uiteindelijke concentratie van de hybriden en LPS te hebben om respectievelijk 100 nM en 10 ng / ml te zijn.
    3. Verwijder het kweekmedium uit de gekweekte plaat (2.2.3) en voeg 100 μl van de gemengde oplossing toe in elke putje (3 replicaten voor elke toestand); Inclusief een negatieve controle (alleen medium) en een LPS-controle (10 ng / mL LPS zonder hybriden).
    4. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C, overbrengen het medium van elke put in een buis en centrifugeer de buizen bij 18.000 xg, 4 ° C gedurende 30 minuten. Verzamel de supernatanten (50-80 μL / buis) in een 96-putjes ronde bodemplaat en voer de reporterassay uit zoals beschreven in 3.2.
      VOORZICHTIG: Wanneer de supernatanten verwijderd worden na centrifugering, roer de hybriden niet onder aan de buis.
      OPMERKING: De centrifugatie in stap 3.3.4 is zeer belangrijk om de niet geïnternaliseerde nanopartikelhybriden uit het kweekmedium te verwijderen en kan de interferentie van de hybriden vermijden met de coLorimetrische / luminescentie-aflezingen. Dit komt doordat de gouden nanodeeltjes brede golflengten van licht kunnen absorberen, afhankelijk van hun grootte en agglomeratie.

4. Validatie van het inhibitieve effect van de potentiële kandidaten

OPMERKING: Voor het bevestigen van het remmende effect van de potentiële kandidaten uit het screenen worden twee benaderingen gebruikt. De ene is om de dosis responsen van de stimulanten (LPS) te onderzoeken bij een vaste hybride concentratie (of andersom); De andere is direct te kijken naar de remming op de NF-KB / AP-1 en IRF3 signalen via immunoblotting.

  1. Voer bij aanpak één de reporterassay uit met 100 nM van de loodhybriden en twee LPS-concentraties bij 1 ng / mL en 10 ng / mL volgens dezelfde procedures beschreven in 3.3. Inclusief een inactieve hybride (op basis van de screeningsresultaten) als een hybride controle voor vergelijking.
  2. Volg de standaard e voor de immunoblotting-aanpakXperimente procedures.
    1. Kweek THP-1 cellen in R10 medium, zaad de cellen in een 12-putjes kweekplaat (2 x 10 6 cellen / putje) en differentiëren ze in macrofagen door behandeling van de cellen met 50 ng / ml PMA gedurende 24 uur gevolgd door bewaren voor 2 dagen.
    2. Na celdifferentiatie stimuleren cellen met 10 ng / mL LPS met / zonder hybriden (100 nM) over de tijd (tot 4 uur). Op verschillende tijdspunten (0, 5, 15, 30, 60, 120 en 240 min) bereiden de cellysaten voor immunoblotting op. Inclusief een inactieve hybride als een controle.
    3. Probe de signalen van IκBa, gefosforyleerde p65 en gefosforyleerde IRF3 om het remmende effect van de loodhybriden op de activering van NF-KB en IRF3 te onderzoeken. Probeer de β-actine en de totale IRF3 signalen als interne controles.
      OPMERKING: De signaaltransductie gebeurt vaak veel sneller (binnen enkele uren) dan de expressie van de reporter enzymen SEAP en luciferase (24 uur). Het is sterk aanbevolen om ook perfor te houdenMa levensvatbaarheidsassay van de geteste hybriden om 24 uur als een andere validatie methode.

5. Evalueren van de specifieke specificiteit van de TLR

OPMERKING: Om de TLR-specificiteit van de lead-peptide-GNP-hybride te onderzoeken, worden andere TLR-signaleringsbanen getest, waaronder TLR2, TLR3 en TLR5. TLR7, 8 en 9 zijn uitgesloten omdat de THP-1 afgeleide macrofagen niet goed reageren op de stimulatie van deze TLR's door het gebrek aan expressie van TLR7, 8 en 9 in macrofagen 34 .

  1. Test verschillende concentraties (1 ng / ml tot 25 μg / ml) van de liganden die specifiek zijn voor TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poly I: C) en TLR5 (flagelline) op beide macrofagen van de reportercellen, om de optimale concentratie na hetzelfde te verkrijgen Procedure in 3.1 en 3.2.
  2. Behandel de cellen met de mengsels van de loodhybride (100 nM) en elk TLR-ligand bij de concentratie verkregen uit 5.1 om de remmende specificiteit van de lood h te evaluerenYbrid volgens de experimentele procedure beschreven in 3.3. Inclusief de inactieve hybride als controle voor vergelijking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De algemene experimentele aanpak is geïllustreerd in figuur 1 . De twee THP-1 reportercellijnen, THP-1-XBlue en THP-1-Dual, worden gebruikt om de TLR-responsen snel te screenen door respectievelijk de activatie van respectievelijk NF-KB / AP-1 en IRFs te onderzoeken. De activatie van NF-KB / AP-1 kan gedetecteerd worden door de SEAP-kleurimetrische analyse, terwijl IRF-activering wordt gecontroleerd door luciferase luminescentie. De monocytische THP-1 cellen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien TLR's betrokken zijn bij de pathogenese van veel ontstekingsziekten, zijn ze ontwikkeld als therapeutische doelen voor de modulatie van immuunresponsen en ontstekingsomstandigheden. Echter, de klinische ontwikkeling van de therapieën om TLR signaleringswegen te remmen heeft tot op heden beperkt succes gehad. Het antimalariale geneesmiddel hydroxychloroquine dat TLR7 en TLR9 remt is in klinisch gebruik 35 , 36 . Evenzo zijn slechts een beperkt aanta...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zouden graag de steun willen erkennen van het programma voor professor van speciale benoeming (oostelijke scholar) bij de Shanghai Institutions of Higher Learning (HY), het startfonds van Shanghai First People's Hospital (HY), Gaofeng Clinical Medicine Grant-ondersteuning van Shanghai Jiaotong University School of Medicine (HY), en de financiering van de Crohn's and Colitis Foundation of Canada (CCFC) (SET en HY).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
THP-1-XBlue reporter cellInvivoGenthpx-sphoud celcultuurpassage onder de 20
THP-1-Dual repoter cellInvivoGenthpd-nfishoud celcultuurpassage onder de 20
RPMI-1640 (geen L-glutamine)GE Health CareSH30096.02Opwarmen tot 37 °C voor gebruik; voeg supplementen toe om een compleet medium R10 te maken
Foetaal bovien serum (gekwalificeerd)Thermo Fisher Scientific12484028Hitte geïnactiveerd; 10% in RPMI-1640
L-glutamineThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM in het complete medium R10
NatriumpyruvaatThermo Fisher Scientific11360-0701 mM in het complete medium R10
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1X, zonder calcium, magnesiumGE Health CareSH30028.02Gebruiken voor celwassen en reagensvoorbereiding
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1SEAP substraat
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Luciferase substraat
ZeocineInvivoGenant-zn-1Selectie antibiotica voor reporter cellen
BlasticidineInvivoGenanti-bl-1Selectie antibiotica voor reporter cellen
Dimethyl sulfoxide (DMSO) voor moleculaire biologieSigmal-AldrichD8418-100MLGebruiken voor reagensvoorbereiding
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) voor moleculaire biologieSigmal-AldrichP1585-1MGGebruiken voor celdifferentiatie
Lipopolysacharide (LPS) van E. coli K12InvivoGentlrl-eklpsTLR4 ligand
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsTLR2/1 ligand
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-picTLR3 ligand
Flagelline van S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapuurInvivoGentlrl-epstflaTLR5 ligand
SpectraMax Plus 384 microplaatlezerMolecular DevicesN/AKleurmeting
Infinite M200 Pro multimode microplaatlezer met injectorenTecanN/ALuminiscentie lezen
Microfuge 22R centrifugeBeckman CoulterN/ATemperatuur gecontroleerde microcentrifuge (tot 18.000 g)
Allegra X-15R centrifugeBeckman CoulterN/ATemperatuur gecontroleerde algemene centrifuge (voor celcultuur gebruik)
Costar assay plate, 96-well wit met heldere platte bodem, behandeld voor weefselcultuurCorning Costar3903Gebruiken voor luminescentie assay

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Beutler, B. A. TLRs and innate immunity. Blood. 113 (7), 1399-1407 (2009).
  3. Gay, N. J., Symmons, M. F., Gangloff, M., Bryant, C. E. Assembly and localization of Toll-like receptor signalling complexes. Nat Rev Immunol. 14 (8), 546-558 (2014).
  4. Palm, N. W., Medzhitov, R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. Immunol Rev. 227 (1), 221-233 (2009).
  5. Kawasaki, T., Kawai, T. Toll-like receptor signaling pathways. Front Immunol. 5, 461(2014).
  6. Uematsu, S., Akira, S. Toll-like receptors and Type I interferons. J Biol Chem. 282 (21), 15319-15323 (2007).
  7. Maglione, P. J., Simchoni, N., Cunningham-Rundles, C. Toll-like receptor signaling in primary immune deficiencies. Ann N Y Acad Sci. 1356, 1-21 (2015).
  8. Drexler, S. K., Foxwell, B. M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 506-518 (2010).
  9. O'Neill, L. A., Bryant, C. E., Doyle, S. L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. Pharmacol Rev. 61 (2), 177-197 (2009).
  10. Harter, L., Mica, L., Stocker, R., Trentz, O., Keel, M. Increased expression of toll-like receptor-2 and -4 on leukocytes from patients with sepsis. Shock. 22 (5), 403-409 (2004).
  11. Roger, T., et al. Protection from lethal gram-negative bacterial sepsis by targeting Toll-like receptor 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (7), 2348-2352 (2009).
  12. Tsujimoto, H., et al. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis. Shock. 29 (3), 315-321 (2008).
  13. Blohmke, C. J., et al. TLR5 as an anti-inflammatory target and modifier gene in cystic fibrosis. J Immunol. 185 (12), 7731-7738 (2010).
  14. Hartl, D., et al. Innate immunity in cystic fibrosis lung disease. J Cyst Fibros. 11 (5), 363-382 (2012).
  15. Celhar, T., Fairhurst, A. M. Toll-like receptors in systemic lupus erythematosus: potential for personalized treatment. Front Pharmacol. 5, 265(2014).
  16. Chen, J. Q., Szodoray, P., Zeher, M. Toll-Like Receptor Pathways in Autoimmune Diseases. Clin Rev Allergy Immunol. 50 (1), 1-17 (2016).
  17. Hennessy, E. J., Parker, A. E., O'Neill, L. A. Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (4), 293-307 (2010).
  18. Hedayat, M., Netea, M. G., Rezaei, N. Targeting of Toll-like receptors: a decade of progress in combating infectious diseases. Lancet Infect Dis. 11 (9), 702-712 (2011).
  19. Huang, L., et al. Engineering DNA nanoparticles as immunomodulatory reagents that activate regulatory T cells. J Immunol. 188 (10), 4913-4920 (2012).
  20. Lemos, H., et al. Activation of the STING adaptor attenuates experimental autoimmune encephalitis. J Immunol. 192 (12), 5571-5578 (2014).
  21. Hess, K. L., Andorko, J. I., Tostanoski, L. H., Jewell, C. M. Polyplexes assembled from self-peptides and regulatory nucleic acids blunt toll-like receptor signaling to combat autoimmunity. Biomaterials. 118, 51-62 (2017).
  22. Tostanoski, L. H., et al. Design of Polyelectrolyte Multilayers to Promote Immunological Tolerance. ACS Nano. , (2016).
  23. Foit, L., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4. Biomaterials. 100, 67-75 (2016).
  24. He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
  25. Hirn, S., et al. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).
  26. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).
  27. Arvizo, R. R., et al. Modulating pharmacokinetics, tumor uptake and biodistribution by engineered nanoparticles. PLoS One. 6 (9), e24374(2011).
  28. Ernsting, M. J., Murakami, M., Roy, A., Li, S. D. Factors controlling the pharmacokinetics, biodistribution and intratumoral penetration of nanoparticles. J Control Release. 172 (3), 782-794 (2013).
  29. Lin, P. J., Tam, Y. K. Enhancing the pharmacokinetic/pharmacodynamic properties of therapeutic nucleotides using lipid nanoparticle systems. Future Med Chem. 7 (13), 1751-1769 (2015).
  30. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  31. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  32. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  33. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  34. Ospelt, C., Gay, S. TLRs and chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).
  35. Kuznik, A., et al. Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines. J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).
  36. Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis. Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).
  37. Mullarkey, M., et al. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).
  38. Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).
  39. Rossignol, D. P., et al. Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).
  40. Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers. Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).
  41. Tidswell, M., et al. Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).
  42. Opal, S. M., et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial. JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).
  43. Fung, S. Y., et al. Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis. ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Screening van nanodeeltjesTHP 1 reportercellenSEAP luciferase assaypeptide goud nanodeeltje hybrideNF kappaB AP1 activatieIRF luciferase assayimmunoblotting validatietherapie bij inflammatoire ziekten

Gerelateerde artikelen