Methodenartikel

Een gemodificeerd Yeast-One Hybrid System voor Heteromere Proteïne Complex-DNA Interactie Studies

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56080

⸱

24 juli 2017

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Southern California, 2Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego

In dit artikel

Samenvatting

De gemodificeerde gist-een-hybride analyse die hier wordt beschreven is een uitbreiding van de klassieke gist-hybride (Y1H) -assay om de heteromeer eiwitcomplex-DNA-interactie te onderzoeken en valideren in een heterologe systeem voor elke functionele genomica-studie.

Samenvatting

In de loop der jaren is de gist-hybride test een belangrijke techniek voor de identificatie en validatie van fysieke interacties tussen eiwitten zoals transcriptiefactoren (TF's) en hun DNA-doelwit. De hier geplaatste methode maakt gebruik van het onderliggende concept van de Y1H, maar wordt verder gemodificeerd om eiwitcomplexen te binden en te valideren die binden aan hun doel DNA. Derhalve wordt het aangeduid als de gemodificeerde gist-een-hybride (Y1.5H) -assay. Deze analyse is kosteneffectief en kan gemakkelijk uitgevoerd worden in een reguliere laboratoriuminstelling. Alhoewel het gebruik van een heterologe systeem, zou de beschreven methode een waardevol instrument kunnen zijn om het heteromeer eiwitcomplex te binden aan hun DNA-doelwit (en) voor functionele genomica in elk systeem van studie, met name plantgenetica, te testen en te valideren.

Inleiding

In het algemeen, om eiwit-DNA-interacties te begrijpen, is de Y1H-analyse het voorkeurssysteem dat succesvol is gebruikt in een laboratoriuminstelling 1 . De basis Y1H analyse omvat twee componenten: a) een reporterconstruct met DNA van belang die succesvol is gekloneerd stroomopwaarts van een gen dat codeert voor een reporter eiwit; En b) een expressieconstruct dat een fusie-eiwit tussen de TF van belang en een gist transcriptie activatie domein (AD) zal genereren. Het DNA van belang wordt vaak aangeduid als 'aas', terwijl het fusie-eiwit bekend staat als 'prooi'. In de afgelopen jaren zijn meerdere versies van de Y1H-test ontwikkeld om aan specifieke behoeften te voldoen met hun eigen voordelen 2 . De bestaande Y1H-analyse kan succesvol worden geïmplementeerd om de interactie van één eiwit tegelijkertijd te identificeren en te valideren met zijn DNA-aas, maar ontbreekt aan de mogelijkheid om heterodimere of multimere eiwit-DNA-interacties te identificeren.

"> De hier beschreven methode is een gewijzigde versie van de bestaande Y1H waardoor onderzoekers gelijktijdig meerdere eiwitten kunnen binden die binden aan hun doel DNA-sequentie (en). Het doel van deze analyse is om het eiwit van belang uit te drukken met een activatie domein (pDEST22: TF) en de activatie van de kandidaat-DNA-regio's die gefuseerd zijn aan een verslaggever in de aanwezigheid en / of afwezigheid van de interactieve eiwitpartner (pDEST32ΔDBD-TF) in het gistsysteem beoordelen. Deze analyse zal ons toelaten om te bepalen of de interactie tussen deze twee Eiwitten zijn nodig voor het activeren van het doel. Dit is een GATEWAY-kloningsysteem en is daarom uitvoerbaar in een reguliere laboratoriumomgeving. Dit protocol is gebaseerd op directe transformatie, die het gemak van de co-transformatie van verschillende TF's in een gistsysteem mogelijk maakt . Zo is het een voordelige strategie om de eiwitcomplexen te binden die binden aan hun mogelijke DNA-doelen voor in vitro moleculaire en functionele validatie fOf elk systeem. Huidige technieken zoals Tandem affiniteitszuivering (TAP) methoden zijn kostbaar en arbeidsintensief, maar laten opsporen van proteïen heterrocomplexen op grote schaal 3 , 4 , 5 . Deze gemodificeerde gist-hybride kan met succes op een kleine schaal worden uitgevoerd ( Figuur 1 ) en is ook kosteneffectief. De Y1.5H-analyse kan onderzoekers over de gehele gemeenschap vergemakkelijken om hun hypothese te testen en te valideren om de rol van multimere eiwitcomplex te binden aan een gemeenschappelijk DNA-doelwit met behulp van een heterologe systeem. Op grond van de bevindingen kan de hypothese in vivo in het voorkeursonderzoek worden gevalideerd. Onlangs hebben we deze benadering gebruikt om de rol van een TF en zijn wijze van actie te bepalen om bloei in Arabidopsis 6 te regelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Construeren en Reporter Plasmide Bereiding

  1. PCR amplificeert de promotorregio's / "fragmenten" (bij voorkeur ~ 250-500 bp) van het doel DNA dat geanalyseerd moet worden voor verdere kloning in de invoervector onder toepassing van E. coli (TOP10).
  2. Bij sequentiebepaling, subcloneer de positieve kloon in een compatibele pGLacZi expressievector 7 zoals eerder beschreven 8 , 9 , 10 , 11 .
  3. Transformeer de giststam voor promotorintegratie (YM4271) door homologe recombinatie van pGLacZi om gistreporterstam te genereren zoals eerder beschreven 12 , 13 . De transformatie- en bevestigingsstappen van de giststamme met het DNA-gebied, samen met het recept van de media, worden hier niet beschreven, aangezien de stappen vergelijkbaar zijn met het klassieke Y1H protocolAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Het pEXP-AD502 controle plasmide kan worden gebruikt voor normalisatie doeleinden, terwijl kwantificering van β-galactosidase activiteit zoals eerder beschreven 8 .
  4. Klone het TF of eiwit van belang en vervolgens de interactieve eiwit partner in pDEST22 en pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA Binding Domain) expressievectoren klooneren. De getransformeerde gistpromotorfragmenten en de TF-klonen worden vervolgens verder in het protocol gebruikt.

2. Aangepast Y1.5H Protocol

  1. Begin op dag 1 (middag) met 5 ml kweek in SD-Ura uit een Petri-schotel of glycerolvoorraad en incubeer overnacht in een 30 ° C shaker.
    OPMERKING: Deze cultuur kan worden gestart met een vers gestreepte plaat of direct uit een 25% of 30% glycerolvoorraad van de gistKloon met het DNA fragment.
  2. Op dag 2 (middag), 10 ml YPDA media met 500 μl van de nachtcultuur inocellen en incuberen gedurende een 30 ° C shaker.
  3. Dag 3 (vroeg in de ochtend en hele middag): Bereid competente cellen (vroeg in de ochtend).
    1. Inoculate 100 mL YPDA media met de 2 mL van de overnight cultuur en incubeer in een 30 ° C shaker. Vergroot deze frisse cultuur tot de OD 600 0,4-0,8 (3-5 uur) bereikt.
      OPMERKING: Controleer de OD 600 van de nachtcultuur en zorg ervoor dat het startpunt OD 600 voor deze stap 0,1 - 0,2 is. Gebruik van over- of ondergroeide cultuur kan het experiment verlengen.
    2. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 1000 xg en 21 ° C. Gooi de supernatant weg.
    3. Reconstituteer pellets in 10 ml steriel water met behulp van een vortex of pipettering omhoog en omlaag.
    4. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 1000 xg en 21 ° C. Gooi de supernatant weg.
    5. gereconstitueerdeTe pellets in 2 ml Tris-Ethyleendiaminetetraazijnzuur (TE) / Lithiumacetaat (LiAc) met behulp van een vortex of pipettering omhoog en omlaag.
      OPMERKING: Zie het recept voor TE / LiAc in tabel 1 .
    6. Centrifuge gedurende 5 minuten 1000 xg en 21 ° C. Gooi de supernatant weg.
    7. Pellets opnieuw opschorten in 4 ml TE / LiAc + 400 μL Zalmsperma DNA (10 mg / ml) Pipetten omhoog en omlaag en ga door naar de volgende stap.
  4. Co-transformatie: Warmte schok de cellen (laat in de middag)
    1. Verdeel 20 μL cellen per putje in een 96-putjes mengplaat (U-bodem).
    2. Voeg 150 ng (~ 1,5 μl) elk van het pDEST22: TF-plasmide, pDEST32ΔDBD: TF-plasmide en pEXP-AD502 plus pDEST32ΔDBD: TF (normalisatiecontrole) toe aan de putjes.
      OPMERKING: Optimale resultaten worden verwacht met ~ 150 ng elk van pDEST22: TF en pDEST32ΔDBD: TF plasmide voor succesvolle co-transformatie. Kan variëren met construct en plasmide expressies, dusMoet bij elk experiment worden geoptimaliseerd. Een andere controle pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD kan ook bij de beoordelaar van de gebruiker worden opgenomen.
    3. Voeg 100 μL TE / LiAc / polyethyleenglycol (PEG) per putje toe ( meng driemaal ).
      OPMERKING: Zie het recept voor TE / LiAc / PEG in tabel 1 .
    4. Bedek de plaat met een ademende afdichting en incubeer gedurende 20 - 30 minuten (kan langer) bij 30 ° C (geen roering nodig).
    5. Warmte schok gedurende 20 minuten ( precies ) bij 42 ° C.
  5. Plaat de cellen.
    1. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 1000 xg en 21 ° C. Verwijder supernatant met behulp van een multikanaalspipet. Voeg 110 μl TE toe en meng.
    2. Centrifuge gedurende 5 minuten bij 1000 xg en 21 ° C. Verwijder 100 μl van de supernatant met behulp van een multikanaalspipet. Zet de pellet opnieuw op met de puncher.
    3. Overdracht cellen op SD-Trp-Leu agarplaten. Incubeer platenBij 30 ° C tot volgende stap.
  6. Dag 5 (middag): Breng de cellen over op nieuwe borden met behulp van een puncher / microplate replicator.
    1. Vul een steriele 96-putjes mengplaat (U-bodem) met 50 μL TE met een multikanaalspipet. Pre-nat de puncher in TE.
      OPMERKING: De puncher of de microplate replicator moet vóór deze stap en vervolgens later in het protocol worden gesteriliseerd. De gebruikelijke manier van steriliseren van puncher, zoals het in ethanol dompelen (100%, geen molecuulbiologiegraad) en vervolgens aan de vlam branden, kan worden toegepast. Wacht 1 minuut om de stootpennen af ​​te koelen.
      Let op: bij het uitvoeren van de sterilisatie op de bank; Zorg ervoor dat de bank met ethanol is gereinigd en vrij is van brandbaar materiaal. Draag persoonlijke beschermende uitrusting (PPE).
    2. Punch kolonies en opnieuw op te schorten in TE-gevulde plaat.
      OPMERKING: Als er een gladde groei op de plaat is, kunnen kolonies direct worden gestamptNaar de TE-gevulde plaat, of als alternatief moet een enkele kolonie (in geval van meerdere kolonies) worden gekozen met behulp van een gesteriliseerde tandenstoker naar de TE-gevulde plaat en vervolgens kan de puncher voor de volgende stap worden gebruikt.
    3. Breng ze over op nieuwe SD-Trp-Leu agarplaten voor optimale oppervlakteafdekking. Incubeer platen bij 30 ° C tot de volgende stap.
  7. Dag 7 (middag): Begin cultuur om β-galactosidase activiteit te meten.
    1. Vul een steriele 96-putjes mengplaat (U-bodem) met 50 μl SD-Trp-Leu media met een multikanaalspipet.
    2. Vul een steriel 96-diep put met 180 μL SD-Trp-Leu media met behulp van een multikanaalspipet.
    3. Pre-nat de puncher in de media en overdracht kolonies van plaat naar de 50 μL media.
    4. Breng 20 μl gist naar de 180 μl SD-Trp-Leu media en sluit het blok met een ademende afdichting. IncuberenGedurende 36 uur bij 30 ° C shaker.
  8. Dag 9 (ochtend): Begin de cultuur voor enzymatische meting.
    1. Vervolg 100 μl van de cultuur naar 500 μl YPDA media in een gesteriliseerd 96 diep putje.
    2. Bedek de gesteriliseerde diepe putplaat met een ademende afdichting en incubeer gedurende 3 - 5 uur bij 30 ° C onder roeren bij 200 rpm (tot OD 600 0.3-0.6).
    3. Re-suspend cultuur en overdracht 125 μL met behulp van een multikanaalspipet op een spectrofotometerplaat (meet OD 600 ).
      OPMERKING: Let op: Laat de laatste druppel niet los om bellen te vermijden, als de OD 600 lager is dan 0,3 - 0,6, incubeer de resterende cellen gedurende 1 tot 2 uur meer op basis van de aflezing. De 125 μL-kweek die bij deze stap wordt gebruikt, kan naar keuze van de gebruiker worden weggegooid of overgebracht naar het oorspronkelijke deep well-blok.
    4. Centrifugeer de resterende cellen in het diepe putje gedurende 10 minuten bij 3000 xg en 21 ° C. Verwijder supernatanT door inverteren.
    5. Voeg 200 μL Z-buffer en vortex toe.
      OPMERKING: Zie het recept voor Z-buffer in tabel 1 .
    6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3000 xg en 21 ° C. Verwijder supernatant door inverteren.
    7. Voeg 20 μL Z-buffer en vortex toe.
    8. Bedek de plaat met afdichtingsfolie die de ontdooiingscycli kan weerstaan. Voer 4 cycli van bevriezen / ontdooien met vloeibare stikstof in een dampkap en vervolgens 42 ºC in een waterbad (2 minuten elk).
    9. Voeg 200 μL Z-buffer / bèta-mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-nitrofenyl-β-galactoside (ONPG) toe (12 ml, 21 μL, 8,4 mg respectievelijk 20 ml oplossing, bereid altijd fris ).
      OPMERKING: ONPG zal enige tijd duren om goed op te lossen, zodat u de oplossing een uur voor het bereiken van deze stap kunt voorbereiden. ONPG dient als substraat voor het meten van β-galactosidase activiteit.
    10. Incubeer tot 17 - 24 uur bij 30 ° C (inchecken tussen, als kleur vroeger ontwikkelt per prGa door naar de volgende stap).
  9. Dag 10 (ochtend): Stop de reactie en meet.
    1. Voeg 110 ul 1 M Na 2 CO 3 om de reactie te stoppen en opnametijd.
    2. Vortex en centrifuge gedurende 10 minuten bij 3000 xg en 21 ° C.
    3. Neem 125 μL supernatant met behulp van multikanaals en meet OD 420 .
      OPMERKING: Let op, doe de laatste druppel niet uit om bellen te vermijden.
    4. Bereken β-gal activiteit: 1000 x OD 420 / (tijd (min) x volume (mL) x OD 600 in een spreadsheet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De algemene plaatopzetprocedure voor de co-transformatie van DNA-gebieden in de gistcellen met eiwit van belang ( Figuur 2 ). De plaatopstelling kan worden gewijzigd volgens de behoefte van het experiment en het aantal geteste DNA-gebieden / fragmenten. Na dag 5 van het protocol moet een goed gegroeide en positieve plaat zichtbaar zijn zoals in figuur 3 . In onze studie werd het promotorgebied van 2600 bp stroomopwaarts vanaf he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De bestaande Y1H standaardprocedure is geschikt voor het identificeren van een enkelvoudige eiwitbietbinding aan het DNA-aas. Met diverse technische wijzigingen is het bestaande systeem aangewend voor het definiëren van transcriptie regulerende netwerken. TF's zijn echter bekend als een onderdeel van complexen die twee of meer TF's of eiwitten omvatten, waarbij slechts enkele van de TF in staat zijn om aan het DNA te binden. Proteïnen of TF's die alleen de eiwitbindende domeinen bezitten en het vermogen hebb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

We bedanken SS Wang, M. Amar en A. Galla voor het kritisch lezen van het manuscript. Onderzoek dat in deze publicatie is gerapporteerd, werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health onder onderscheidingsnummers RO1GM067837 en RO1GM056006 (naar SAK). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pDEST22 vectorInvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBDInvitrogenPQ1000102Pro-Quest Two hybrid system kit; deze vector is gemodificeerd. Het is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning KitInvitrogenK240020
YM4271 StrainClontechK1603-1MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502InvitrogenPQ1000101Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mixInvitrogen11791020
YPDA mediaClontech630410
SD-AgarClontech630412
SD minimal mediaClontech630411
Uracil DO SupplementClontech630416
Tryptophan Do SupplementClontech630413
Tris BaseFisher ScientificBP152-1
EDTAFisher ScientificS311-500
LiAcSigma-AldrichL4158
Saplmon Sperm (10mg/ml)Invitrogen15632011
96 well round bottom PlateGreiner bio-one650101
PEG3350Sigma-Aldrich1546547
96-deep well blockUSA Scientific1896-2000
Sealable FoilUSA Scientific2923-0110
ArasealExcel ScientificB-100
2-mercaptoethanolFisher Scientific034461-100
ONPGSigma-Aldrich73660
Na2CO3Sigma-Aldrich223484
Na2HPO4 Sigma-AldrichS3264
NaH2PO4 Sigma-AldrichS3139
KCLFisher ScientificBP366-500
MgSO4 Sigma-Aldrich83266
HCLFisher ScientificSA54-4
DrybathThermo Fischer
VoretxThermo Fischer
CentrifgueEppendorfCentrifuge 5810R
Plate ReaderMolecular DeviceSPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
IncubatorThermo FisherModel No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker IncubatorNew Brunswick
Water BathThermo FisherIsoTemp 205
Puncher
50 ml FalocnBD Falcon
BeakerNalgene
FlaskNalgene
Petriplates (150mm)Greiner bio-one

Referenties

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
  11. Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
  12. Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Binding van transcriptiefactorengisttransformatieb ta galactosidase assaySD medium dropoutco transformatieprotocolvries dooi cyclifunctionele genomica

Gerelateerde artikelen