Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten

Summary

Combinatie van Ivacaftor en ivacaftor-lumacaftor zijn twee nieuwe CF-drugs. Er is echter nog steeds een gebrek aan overeenstemming inzake hun PK/PD en farmacologie. We presenteren een geoptimaliseerde HPLC-MS-techniek voor de gelijktijdige analyse van ivacaftor en de belangrijkste metabolieten daarvan, en lumacaftor.

Abstract

Gebreken in de cystic fibrosis trans-membraan huidgeleiding regulator (CFTR) zijn de oorzaak van cystic fibrosis (CF), een ziekte met levensbedreigende pulmonale manifestaties. Ivacaftor (IVA) en ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combinatie zijn twee nieuwe doorbraak CF drugs die rechtstreeks het moduleren van de activiteit en de handel van het defecte CFTR-eiwit. Er is echter nog steeds een gebrek aan inzicht in de farmacodynamische/farmacokinetische parameters en de farmacologie van ivacaftor en lumacaftor. De HPLC-MS-techniek voor de gelijktijdige analyse van de concentraties van ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylaat en lumacaftor in biologische vloeistoffen in patiënten die standaard ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor combinatie therapie eerder is ontwikkeld door onze fractie en gedeeltelijk gevalideerd aan de FDA-normen. Echter, zodat de analyse van de hoge-doorvoer van een groter aantal monsters van de patiënt, heeft onze fractie geoptimaliseerd de gerapporteerde methode door het gebruik van een kleinere omgekeerde-phase chromatografie kolom van een porie-grootte (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) en een kleurovergang oplosmiddel systeem ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: gehouden op 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B spoelen; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: gehouden op 40% B) in plaats van een isocratic elutie. Het doel van deze studie was om sneller op de HPLC-MS analyses per monster dramatisch van ~ 15 min te slechts 6 minuten per monster, die essentieel is voor de analyse van een grote hoeveelheid patiënt monsters. Deze raadzaam methode zullen van groot nut voor studies in het blootstelling-respons relaties van deze doorbraak CF drugs.

Introduction

Cystic fibrosis (CF) is een gemeenschappelijke genetische ziekte waarbij de exocrine slijm klieren van de longen, lever, alvleesklier en darmen veroorzaken progressieve multi orgaanfalen, zoals een afname in longfunctie en alvleesklier insufficiëntie^{1, 2,3}. Ivacaftor (IVA) is de eerste Food and Drug Administration (FDA-US) en het Europees geneesmiddelen Agentschap (EMA) goedgekeurd cystic fibrosis trans-membraan huidgeleiding regulator (CFTR) potentiator drug, met blijkt klinische werkzaamheid produceren een aanzienlijke verbetering van de longfunctie over placebo in een kleine ondergroep van CF patiënten rekening houdend met de G551D-CFTR [glycine (G) in positie 551 wordt vervangen door asparaginezuur (D)] missense Mutatie (~ 4-5% van de bevolking van CF)^4,5. Dit oraal toegediend drug verhoogt het CFTR-kanaal openen, dus het chloride-ion stroom te verhogen en reageren op de primaire afwijking die tot de klinische uitingen van CF^{4,6 leidt}. Helaas, IVA monotherapie is niet effectief bij patiënten met de gemeenschappelijkere homozygoot F508del mutatie [in frame schrapping van het CFTR-gen dat in het verlies van fenylalanine (F) op positie 508 resulteert] wat resulteert in misfolded CFTR, die wordt gezien bij ~ 50% van de CF bevolking^7,8.

Onlangs, de FDA goedkeuring heeft verleend voor het combineren van IVA met het CFTR-corrector drug lumacaftor. De slimme strategie van het combineren van een CFTR-corrector (lumacaftor, LUMA) die redt F508del-CFTR aan het celoppervlak met een modulator (IVA) die potentiates CFTR kanaal activiteit, wordt het venster van de behandeling effectief vergroot tot allermeest naar de CF bevolking⁵ . Vragen blijven over of deze drugs zal voldoen aan hun belofte als een aantal tegenstrijdige verslagen die cast twijfel op hun klinische werkzaamheid^{9,10 opgedoken}. Bovendien verbeteringen in de longfunctie slechts bescheiden (2.6-4% voor de combinatie van de ivacaftor-lumacaftor) waren in vergelijking met de successen die zijn behaald met IVA monotherapie bij patiënten met een G551D Mutatie (10.6-12,5%)⁸. Potentiële antagonistische drug-drug-interacties tussen IVA en LUMA die potentieel de klinische werkzaamheid van ivacaftor-lumacaftor combinatie beperken, is afkomstig van de farmacokinetische eigenschappen ervan minder dan ideale^7,11. IVA uitgebreid menselijk organisme worden gemetaboliseerd door cytochroom P450 enzymen (CYP), voornamelijk voor een actieve metaboliet hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) en een inactieve vorm IVA-carboxylaat (IVA-M6, M6)^7,12. De CYP3A4 inductor LUMA, aan de andere kant, niet uitgebreid menselijk organisme worden gemetaboliseerd en wordt grotendeels onveranderd in de ontlasting¹¹uitgescheiden. Zoals CYP3A4 inductoren cytochroom metabolisme induceren, kunnen ivacaftor (CYP3A4 substraat) concentraties worden verminderd. Bovendien zowel IVA en LUMA zijn zeer hydrofobe moleculen en zijn ~ 99% gebonden aan plasma-eiwitten, die aanzienlijk beperkt de vrije (actieve) drug concentratie^1,13.

Collectief, kunnen deze factoren komen samen om te beperken van de klinische werkzaamheid van ivacaftor-lumacaftor combinatie. Het is niet bekend of optimale plasmaconcentraties worden bereikt onder de huidige doseringsschema voor ivacaftor-lumacaftor combinatie of als de therapeutische drempel⁸wordt gehandhaafd. Momenteel, is er een schaarste aan informatie met betrekking tot de farmacokinetische parameters, zoals de piek en steady-state plasmaconcentraties van ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor. Gezien het bekende metabolisme van ivacaftor en lumacaftor, is toezicht op blootstelling-respons relaties het vereiste om de optimale dosering regimes voor ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor-therapie. Onze fractie heeft onlangs de eerste HPLC/LC-MS methode voor het toezicht op blootstelling-respons relaties van IVA en LUMA¹⁴. Tot nu toe geen alternatieve technieken voor het meten van de concentraties van ivacaftor, zijn metabolieten en lumacaftor gemeld. De analyse van de hoge-doorvoer van een grotere patiënt collectief toestaan en analyse tijd drastisch te verminderen, onze fractie de gerapporteerde methode door middel van een kleinere omgekeerde-phase chromatografie kolom van een porie-grootte en een kleurovergang oplosmiddel systeem is geoptimaliseerd dat vermindert kosten en lopende tijden.

Protocol

goedkeuring voor ethiek was verkregen van Monash University menselijke onderzoek ethische Commissie (MUHREC).

1. toepassing van de bepaling: patiënt Sample collectie

1. Neem de tijd wanneer de patiënt hun standaard dosis van 150 mg ivacaftor of ivacaftor 125 mg /lumacaftor neemt 200 mg.
2. Opmerking onderaan de nauwkeurige tijd wanneer de patiënt bloedmonster wordt verzameld.
   Opmerking: We raden 4-5 monsters verzamelen in een loop van de tijd 24 h. Als de collectie van slechts één steekproef mogelijk is, het aangegeven tijdstip is 2,5-4 h post ivacaftor of ivacaftor-lumacaftor combinatie dosering als C _max concentraties bij steady-state zal haalbaar na > 5 dagen van opeenvolgende behandeling.
3. 4-5 mL bloed in de handel verkrijgbare onbehandelde blauwe buizen verzamelen.
4. Na het verzamelen van de volbloed, laat het bloed stollen door het verlaten van het ongestoord bij kamertemperatuur.
   Let op: Dit duurt meestal 15-30 min.
5. Verwijder de klonter door centrifugatie bij 1000 en 2000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge. Het resulterende supernatant aanwijzen als plasma.
6. Na centrifugeren, onmiddellijk overdracht de bovendrijvende substantie (plasma) in een schoon polypropyleen buis met behulp van een precisiepipet Pasteur. Label het plasma tube met de patiënt ID (bijvoorbeeld patiënt 1), de door de overheid gereguleerde drug (b.v., ivacaftor-lumacaftor combinatie), en tijd van de patiënt steekproef werd verzameld (bijvoorbeeld 2,5 h na dosering).
7. Monsters van behouden bij 2-8 ° C tijdens de behandeling. Zodra afhandeling is voltooid, slaan monsters op – 20 ° C.
8. Indien nodig, monsters met een goedgekeurde courier aan het analyseren Instituut schip.
   Opmerking: Monsters worden verzonden op droog ijs tot aankomst en dient te worden bewaard bij – 80° C tot analyse.

2. Voorbereiding en verwerking van gemaakte monsters en normen

Opmerking: Plasma van gezonde donoren naïef op ivacaftor/lumacaftor therapie was verkregen van de Australische Rode Kruis. Om de integriteit te garanderen, moeten alle monsters/normen tijdens de inzameling en verwerking bij 2-8 ° C worden gehouden. Zodra afhandeling is voltooid, slaan monsters op – 20 ° C.

1. Weeg IVA, IVA-carboxylaat, hydroxymethyl-IVA en LUMA die als referentie voor de interne standaarden dienen zal.
2. Bereiden twee onafhankelijke stamoplossingen van elke analyt (IVA, M1, M6 en LUMA) in LC-MS rang methanol op 100 µg/mL en 10 µg Fe/mL.
   Opmerking: Verbindingen vervalt na 10 dagen op de benchtop.
3. Vers bereiden LC-MS kalibratie standaarden vóór elke analytische run door verdunning van de kalibratie-normen voorraadoplossingen in menselijk plasma te bereiken na concentraties: 0.01, 0,025 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 en 10,0 µg/mL. Deze monsters worden aangeduid als normen.
4. Te precipiteren eiwitten, bereiden van 0,1% mierenzuur (FA) in acetonitril (ACN, LC-MS rang) en laat in de koelkast totdat nodig.

3. Voorbehandeling van monsters van de gemaakte en normen

1. toestaan beide monsters van de patiënt en lege plasma naar equilibreer tot kamertemperatuur.
2. Vortex te mengen van elk monster plasma voor 15 s per monster.
3. Pipetteer een hoeveelheid van 100 µL van beide leeg plasma voor normen of patiënt monsters voor analyse in een buis van polypropyleen microcentrifuge 1.5-mL.
4. De interne standaard IVA in elk van de standaard buizen toevoegen (bijvoorbeeld 0,01, 0,025 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 en 10,0 µg/mL ter dekking van de potentiële concentratiebereik), sluit het deksel en vortex voor 2-3 s. notitie dat interne standaard is alleen toegevoegd aan het leeg plasma en geen interne standaard wordt toegevoegd aan de patiënt monsters.
5. Herhaal stap 3.4. voor de andere interne standaarden M1 en M6 LUMA.
6. Spin down elke buis kort om ervoor te zorgen dat er geen druppels op het deksel.
7. Voeg toe 200 µL van het mengsel van 0,1% FA in ACN in elke buis te precipiteren plasma-eiwitten.
8. Vortex het mengsel krachtig gedurende ongeveer 15 s.
9. Buizen te staan gedurende 10 minuten in de koelkast laten.
10. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, indien mogelijk.
11. Filtreer een aliquot 200 µL van het supernatans dat door een 13 mm spuit filter in een flesje van de HPLC 1,5 mL.
12. Breng 100 µL van de bovendrijvende substantie in de LC-MS flacon voor de HPLC-MS-analyse.

4. HPLC-MS analyse

Opmerking: The HPLC-MS-analyse werd uitgevoerd op een systeem van de LC-MS in combinatie met de triple vierpolige massaspectrometer (tabel 1).

1. Draaien op het systeem van de LC-MS, plaatst u de lade, met de monsters in de auto-sampler.
2. De kolom koppelen aan een voorkolom en sluit aan op het systeem van de LC-MS.
3. Hechten beide flessen van mobiele fasen (fles van A: 100% ACN; fles B: 0,1% mierenzuur in water) en het systeem van de LC-MS equilibreer.
4. De volgende parameters in het LC-MS protocol opnemen.
   1. De mobiele fase stroom verdeeld alvorens de massaspectrometer in een verhouding van 2:1 (afval: MS inlaat).
   2. Voeren een kleurovergang elutie op een debiet van 0,5 mL/min met behulp van een mobiele fase, bestaande uit 100% ACN en 0,1% mierenzuur in water (startpunt op 40:60, v/v). Merk op dat het percentage van het volume van de mobiele fase in de gehele analyse verandert.
   3. Werken de massaspectrometer in een positieve electrospray ionisatie modus.
   4. Zorg ervoor dat de LC-MS-instellingen als volgt: ion spray spanning 4.5 kV, botsing energie 295.9 V, nebulizing gas: stikstof op 3 L/min, botsing gas: argon; drogen gas flow 20 L/min, lens spanning Q3:-22 V, desolvation temperatuur 250 ° C met een warmte-blok temperatuur van 400 ° C.
   5. Injecteren 10 µL volume per monster.
   6. Analyse analyten met behulp van meerdere reactie controle (MRM). Controleren van de ion overgangen van m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 en m/z 452.40 → 453 voor IVA, IVA-M1, IVA-M6 en LUMA, respectievelijk.
      Nota: De nieuwe geoptimaliseerde methode moet nog volledig worden gevalideerd volgens FDA normen.

5. Kalibratiekrommen

1. Construct de LC-MS kalibratiekrommen vóór elke analyse uitvoeren met behulp van de relatie tussen de ratio's van piek, gebied van elk van de vier analyten aan interne standaard en de kalibratie standaard nominale concentraties van ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 of LUMA) vanuit het instellingen programma van LC-MS.
   Opmerking: De exacte stappen voor de bouw van de kalibratiekromme is afhankelijk van het model van LC-MS apparatuur wordt gebruikt. Deze informatie is mogelijk in de handleiding van de apparatuur beschikbaar.
2. Lineaire kleinste kwadraten regressie-analyse uitvoeren door weging van 1/C ² volgens de reciproke van concentraties.

Results

We hebben onlangs gemeld een gedeeltelijk aan FDA-normen, op een triple-vierpolige LC-MS en een HPLC detector systeem, gevalideerde methode met behulp van een C8 kolom (5 µm, 3.9 x 50 mm ID) met de mobiele fase, bestaande uit 100% ACN en 0,1% mierenzuur in water (40:60 v/v) op een debiet van 1 mL/min. Een lineaire correlatie van de pieken werd waargenomen over een concentratiebereik van 0,01 tot 10 µg Fe/mL in menselijk plasma voor alle metabolieten, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 en lumacaftor¹⁴. Hier...

Discussion

Zoals eerder gemeld heeft onze fractie voor het eerst ontwikkeld en gevalideerd een HPLC en LC-MS methode voor snelle detectie en kwantificering van ivacaftor en de belangrijkste metabolieten daarvan hydroxymethyl-IVA M1 (actief) en IVA-carboxylaat M6 (inactief); en lumacaftor in het plasma en sputum van CF patiënten¹⁴. De bepaling eerder gerapporteerd door onze fractie werd met succes gebruikt voor het kwantificeren van de concentratie van LUMA, IVA, IVA-M1 en IVA-M6 in het plasma en sputum van C...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVA (Cat#S114)	SelleckChem (USA).
LUMA (Cat#S1565)	SelleckChem (USA).
IVA-carboxylaat (Cat# 510242247CS)	Clearsynth (Canada).
hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS)	Clearsynth (Canada).
Methanol (MeOH, LC-MS kwaliteit),	Sigma-Aldrich
acetonitril (ACN, LC-MS kwaliteit)	Sigma-Aldrich
mierenzuur (FA)	Sigma-Aldrich
triple-quadruple Shimadzu 8030 LC-MS
Phenomenex Kinetex (2,6 µm C8 100 Å; 50 × 2,1mm)
(KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0,5 m Dieptefilter x 0,004inID).
1,5 mL polypropyleen microcentrifugebuisje (VWR).
Eppendorf Centrifuge 5430
13-mm spuitfilter (0,45 µm nylon, GRACE, USA)
[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa].