Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56101

⸱

3 oktober 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

In dit artikel

Samenvatting

Het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans is een uniek eencellige model voor de visuele in vivo analyse van biogenese van DOVO gepolariseerd. Dit protocol beschrijft een combinatie van standaard genetische/RNAi en imaging benaderingen, aanpasbaar voor de identificatie en karakterisering van moleculen eencellige tubulogenesis en apicale membraan en lumen biogenese regisseren.

Samenvatting

De vier C. elegans uitscheidingsmechanisme grachten zijn smalle buizen uitgebreid door de lengte van het dier uit een enkele cel, met bijna even veel uitgebreide intracellulaire endotubes die bouwen en stabiliseren de lumen met een membraan en submembraneous cytoskelet apicale karakter. De uitscheidingsmechanisme cel breidt haar lengte ongeveer 2.000 keer voor het genereren van deze kanalen, waardoor dit model unieke Voordebeoordeling in vivo van DOVO gepolariseerde biogenese, intracellulaire lumen genuitdrukking en eencellige tubulogenesis. Het hier gepresenteerde protocol laat zien hoe te combineren standaard labelen, winst - en verlies-van-functie genetische of RNA-interferentie (RNAi)-, en microscopische benaderingen gebruiken dit model om te ontleden visueel en functioneel het analyseren van deze processen op een moleculair niveau. Als een voorbeeld van een aanpak van labeling schetst het protocol de generatie transgene dieren met fluorescerende fusion eiwitten voor live analyse van tubulogenesis. Als een voorbeeld van een genetische benadering wijst zij op belangrijke punten van een visuele RNAi gebaseerde interactie scherm ontworpen om te wijzigen van een winst-of-function cystic kanaal fenotype. Zijn er de specifieke methoden beschreven hoe: label en visualiseren van de grachten met het uitspreken van fluorescente proteïnen; bouwen van een gerichte RNAi bibliotheek en strategize RNAi screening voor de moleculaire analyse van kanaal morfogenese; visueel beoordelen van wijzigingen van kanaal fenotypen; Score van hen door de ontrafeling van de fluorescentie microscopie; karakteriseren subcellular kanaal onderdelen met een hogere resolutie van de confocal microscopie; en kwantificeren van de visuele parameters. De aanpak is handig voor de onderzoeker die geïnteresseerd is in het voordeel halen van het uitscheidingsmechanisme C. elegans -kanaal voor de identificatie en karakterisering van genen die betrokken zijn bij de fylogenetisch geconserveerde processen van intracellulaire lumen en eencellige buis morfogenese.

Inleiding

Alle interne organen zijn samengesteld uit buizen, cruciaal zijn voor hun vele verschillende functies, zoals het vervoer, de uitwisseling van gassen, vloeistoffen en voedingsstoffen en de uitscheiding van metabolische afval. Hun gepolariseerde karakter, met duidelijke apicale en lumenal membranen, is aangepast aan deze specifieke functies, en gebreken in de biogenese van hun systemen voor endo- en plasmamembraan zijn een frequente oorzaak van ziekten bij de mens1,2. De meerderheid van de buizen van de therapieën en inwendige organen zijn meercellig en vormen een lumen intercellularly; echter, eencellige buizen, die het lumen intracellulair vormen, kunnen, bijvoorbeeld, zo veel als 30-50% van de menselijke capillair bedden2vertegenwoordigen. De gepolariseerde membranen van multi- en eencellige buizen zijn qua samenstelling, hoewel hun microdomains op basis van de specifieke functie van de buis (bijv., uitscheidingsmechanisme kanaal canaliculi versus intestinale microvilli in Caenorhabditis verschillen kunnen elegans; Zie bijbehorende papier op C. elegans intestinale tubulogenesis)3. Bewaring van de beginselen van biogenese van gepolariseerde en tubulogenesis worden toegepast onder metazoans, en een soortgelijk moleculaire machines dirigeert ze1,2,4.

Het uitscheidingsmechanisme systeem van C. elegans bestaat uit vijf cellen: de uitscheidingsmechanisme-cel (EG), koker cel (DC), porie cel (PC) en twee cellen van de klier. Ablatie van de EG, DC of PC zorgt ervoor dat vocht ophoping in de lichaamsholte en het sterven van de dieren op een vroege larvale stadium5. Intrigerend, deze drie eencellige buizen maken hun lumen op drie verschillende manieren: door cel uitholling (EG); cel inwikkeling in combinatie met autocellular junction vorming (PC); en door cel inwikkeling in combinatie met autofusion (DC); verschillende mechanismen van lumen morfogenese die alle fylogenetisch geconserveerde6,7. De EG, gelegen aan de linker laterale kant van de posterieure faryngaal lamp, stuurt twee zijdelingse extensies uit die de vier grachten uit te breiden anteriorly tak en posteriorly (aan de rechter en linker kant) naar het uiteinde van de van de worm neus en staart , respectievelijk (Figuur 1)5,6,8. De EG strekt zich uit van ongeveer 1 µm tot 2 x 1.000 µm, waardoor het de grootste cel van het dier. Op een subcellular niveau is het uitscheidingsmechanisme kanaal een eenvoudige buis, gegenereerd op basis van een basale membraan gericht op de pseudocoelom en tunnel door een lumenal membraan (endotube). Het kanaal lumenal membraan verbindt aan de buis lumenal membraan zijn alleen intercellulaire afslag; de grachten zijn anders junctionless langs hun lengte (Figuur 1). Het uitscheidingsmechanisme kanaal lumenal membraan en haar submembraneous cytoskelet zijn apicaal, gedefinieerd door hun moleculaire compositie die lijkt op de samenstelling van de apicale membraan en submembraneous cytoskelet van meercellige buizen, zoals de darm, en van andere epitheel (bijvoorbeeldplat). Cytoplasmatische organellen, met inbegrip van endosomal vesiculaire en andere (bijvoorbeeldGolgi) endomembranes zich langs de lengte van het kanaal bevinden. Daarnaast zijn meerdere canalicular blaasjes - verbonden met het lumenal membraan, en/of onderling verbonden of geïsoleerd - threaded via het kanaal cytoplasma7,8,9,10 . Deze dynamische plasma-membraan/canalicular verbinding verder van het kanaal membraan systeem breidt en draagt bij aan beide lumen genuitdrukking en osmoregulatie10. Het uitscheidingsmechanisme kanaal bestaat dus bijna volledig van endo- en plasma membranen, bieden een uitstekend model voor de analyse van gepolariseerde biogenese en de regulering van de endo-aan plasmamembraan interface. De dramatische uitbreiding van de apicale membraan tijdens kanaal morfogenese - in dit samenvallen met lumen extensie – eencellige-systeem maakt het ook mogelijk om te analyseren de architecturale problemen die ontstaan door de noodzaak te stabiliseren en centreren van een intracellulaire lumenal membraan . Dit protocol is gericht op de analyse van de kanaal buis van en lumen van structurele genuitdrukking en de dynamiek van de intracellulaire membraan vereist voor dit proces in plaats van op de signalen die direct van de bewegingen van de cel die het genereren van de EG positie in de uitscheidingsmechanisme systeem en de ingewikkelde verbindingen met andere cellulaire elementen (herzien in6) op te bouwen.

Een ander voordeel van de C. elegans eencellige kanaal systeem voor de analyse van gepolariseerde membraan en intracellulaire lumen biogenese is haar vermogen om te scheiden, door de ontwikkelings tijd, de generatie van verschillende onderdelen van de membranen en kruispunten. De EG is geboren op het moment van sluiting van de ventrale en regelt ventro-lateraal van de keelholte tijdens mid embryogenese5,6,8, waarin verlenging van de laterale kanaal en vertakking voordoet. Dit wordt gevolgd door anterior-posterior kanaal extensie tijdens late embryogenese, een proces dat in de L1-larvale stadium (Figuur 1 blijft). In een onlangs uitgekomen larve, de tip van achterste kanaal bereikt ongeveer het midden van de worm, samen met de worm8volledig uit te breiden tot de staart aan het einde van de etappe van L1, waarna het kanaal kieuwopeningenvorm. Actieve kanaal groei op een maximumsnelheid van meer dan die van de groei van het dier dus eindigt bij het eerste larvale stadium, echter, verdere groei gebeurt parallel met de groei van het hele dier tijdens de extra larvale stadia (L2-4). Deze instelling biedt de mogelijkheid om te analyseren verschillende stappen van DOVO gepolariseerde biogenese onafhankelijk van gepolariseerde celdeling of migratie. Bovendien, het maakt het mogelijk de scheiding van dit proces van de vergadering van kruispunten (die voorkomen in het embryo voordat lumen Inleiding); hun exacte behoefte in membraan polarisatie is nog steeds een open vraag op het gebied van de polariteit. Ten slotte, het unieke scheidt apicale van basale membraan expansie, het laatste proces voorafgaat aan de voormalige in de uitscheidingsmechanisme grachten10. De C. elegans uitscheidingsmechanisme kanaal model is dan ook een bijzonder informatief aanvulling op de intestinale model dat deelt een aantal van deze voordelen voor de analyse van gepolariseerde biogenese maar wordt het uitgevoerd in een meercellig instelling (Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis3).

Hoewel wild-type kanalen uiterst dunne buisjes in deze kleine worm zijn, kunnen hun lumen visualized direct door Nomarski optica in dit transparante dier. Mutant cystic kanaal morphologies kunnen in feite worden gekarakteriseerd in labelloze dieren met behulp van lage vergroting ontrafeling van microscopie, die te groot effect in voorwaartse genetische schermen is gebruikt om genen die betrokken zijn bij tubulogenesis11te identificeren. Verbeterde visualisatie van de morfologie van grachten en onderscheid van hun gepolariseerde membranen, cytoskeletal onderdelen, verschillende intracellulaire organellen en andere subcellular structuren, echter, vereist labeling en hoger macht TL ontleden en confocal microscopie. Hoewel de grachten fijne structuur een aantal moeilijkheden voor het benoemen en microscopie vormt, membranen en subcellular onderdelen via de specifieke moleculen die uniek zijn voor elk compartiment kunnen worden onderscheiden, en dieren kunnen worden veilig gemonteerd voor microscopie als bepaalde voorzorgsmaatregelen worden genomen om te voorkomen dat de invoering van artefacten (Zie Protocol en discussie). Etikettering kan worden gedaan door immunohistochemistry in vaste specimens, of door het genereren van transgene wormen uiting van fluorescerende fusion eiwitten onder de controle van hun eigen of uitscheidingsmechanisme kanaal-specifieke initiatiefnemers voor in vivo imaging. Dit protocol beschrijft de laatste labeling techniek (Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis voor antilichaam3kleuring).

De mogelijkheid om te combineren in vivo - of winst-van-verliesfunctie studies met in vivo imaging analyse op de eencellige niveau in de gehele ontwikkeling maakt het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans een bijzonder sterke model voor de moleculaire en cellulaire analyse van eencellige tubulogenesis. Forward of reverse genetische schermen kunnen worden uitgevoerd vanaf een wild-type of gelabelde transgene dieren te identificeren kanaal morfogenese fenotypen (bijvoorbeeld cysten) en hun onderliggende genetische defecten. Als alternatief, dergelijke schermen kunnen beginnen met een mutant fenotype (bijvoorbeeld, een cystic kanaal) en identificeren van suppressors of versterkers van dit fenotype ter identificatie van genen die functioneel interactie met de gen veroorzaakt het mutant fenotype. Het genetische gebrek dat veroorzaakt het mutant fenotype een verlies (bijvoorbeeld, via de schrapping van de gene) of een winst kan veroorzaken (bijvoorbeeld via een activerend mutatie of via de invoering van overtollige gene kopieën) van de onderzochte functie. Voorwaartse mutagenese of systematische RNAi schermen zijn zonder vooroordelen op genfunctie en toestaan dat de onbevooroordeelde identificatie van genen die betrokken zijn in de functie van belang. Gezien de beschikbaarheid van genoom-brede RNAi voederen van Bibliotheken, kan bijna elk gen worden gemakkelijk neergeslagen door RNAi in C. elegans, zodanig dat enkel gen van belang of een andere groep van genen (bijvoorbeeldin gerichte schermen) kan ook worden snel gesondeerd voor hun effect in de benadering van een omgekeerde genetica. Om aan te tonen een mogelijke combinatie van benaderingen, hier beschrijven we een gerichte RNAi interactie scherm, beginnend met een winst-of-function cystic uitscheidingsmechanisme kanaal mutant, aangeduid met de cytoplasmatische kanaal groen fluorescente proteïne (GFP). De mutant fenotype werd gegenereerd door overexpressie van erm-1, een zeer geconserveerde C. elegans ortholog uit de linker membraan-actine Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), die is betrokken bij lumen genuitdrukking en membraan organisatie in vele soorten12. C. elegans ERM-1 lokaliseert te lumenal membranen van inwendige organen, zoals de uitscheidingsmechanisme kanaal en de darm, en is vereist voor lumen vorming in beide13. ERM-1 overexpressie werft overtollige actine en blaasjes aan de gracht lumenal membraan, verhoging van de flux in de lumen en het genereren van een kort cystic kanaal en een gekruld lumenal membraan met verdikte actine ondervacht9. Het protocol wordt beschreven hoe u voor het genereren van transgene variëteiten met uitscheidingsmechanisme-kanaal-uitgedrukt label fusion eiwitten (of andere eiwitten); het uitvoeren van gerichte RNAi schermen beginnen met dergelijke stammen, te identificeren van de parameters van het fenotype van een kanaal; en hoe te visueel analyseren de resultaten van dergelijke schermen door fluorescentie ontleden en confocal microscopie, met inbegrip van eenvoudige manieren om te kwantificeren informatieve tubulogenesis fenotypen. Alternatief labeling technieken en de details van RNAi, aangepast aan de vaak dodelijke tubulogenesis genen, kan worden gevonden in het begeleidende document op intestinale tubulogenesis3. Alle methoden kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties voor het onderzoek van andere vragen over kanaal tubulogenesis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. het C. elegans Excretory kanaal labeling door fluorescerende Fusion eiwitten 14

Opmerking: Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis 3 voor het labelen door in situ antilichaam kleuring procedures aan te passen aan het uitscheidingsmechanisme kanaal. Zie tabel 1 voor voorbeelden van moleculen bewezen nuttig voor het visualiseren van C. elegans uitscheidingsmechanisme kanaal endo- en plasma membranen, tabel 2 voor voorbeelden van expressie rijden naar het uitscheidingsmechanisme kanaal, initiatiefnemers en Tabel 3 voor middelen voor meer uitgebreide collecties van markeringen en initiatiefnemers, met inbegrip van verwijzingen bespreken de selectie van verschillende fluorophores.

  1. Bouw van weefsel specifieke fluorescerende marker plasmiden door restrictie-enzym gebaseerd klonen 15
    Opmerking: Zie de discussie voor alternatieve technieken van de bouw fluorescerende fusie-eiwitten.
    1. Bepalen dat u de volgorde van de promotor (voor transcriptionele fusies) of van het hele gen van belang met haar promotor (voor translationeel fusies) in het WormBase 44.
      Opmerking: voor de initiatiefnemers, ongeveer 1 – 3 kilobase (kb) is voldoende voor de meeste C. elegans genen. Translationeel fusion eiwitten kunnen ook worden geconstrueerd door het plaatsen van een gen van belang onder een specifieke promotor van uitscheidingsmechanisme kanaal (Zie tabel 2).
    2. Ontwerpen voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor versterking van de promotor (voor transcriptionele fusies) en/of een volledige gen met promotor (voor translationeel fusies). Restrictie-enzym linkers toevoegen op de 5 ’ en 3 ’ einden van de inleidingen.
      Opmerking: Kies de enzymen van de beperking die aanwezig in de vector plasmide (bijvoorbeeld, pPD95.79) 16 zijn. Voor translationeel fusies, de 3 ’ linker moet zo zijn ontworpen dat na de spijsvertering van het beperkingsenzym en Afbinding met de vector, het invoegen codon frame continu met de codonen van de fluorophore, bijvoorbeeld, GFP zullen. Een wellicht 1 of 2 meer honken toevoegen aan de typische restrictie-enzym linkers 14; Wees voorzichtig niet te maken van een stop codon.
    3. Uitvoeren polymerase-kettingreactie (PCR) om aan te vullen van de promotor of full-length gen met behulp van levende wormen of wild-type genomic DNA of cDNA als sjabloon 15.
      Opmerking: Bij gebruik van wormen als sjabloon, lyse eerst wormen van lysis buffer (PCR-buffer plus proteïnase K) 17. Gemengde fase wormen kunnen worden gebruikt als sjabloon. Uitgehongerd wormen kunnen worden gebruikt om te voorkomen dat besmetting met bacteriële DNA.
    4. Uitvoeren agarose (1%) gel electroforese van PCR producten te identificeren van de juiste grootte van versterkte product.
      Opmerking: Als band maat juist is, gaat u verder met de volgende stap. Als meerdere banden worden gegenereerd, te verbeteren versterking voor de productie van één band. Als dit niet werkt, knip de juiste band uit de gel zuiveren van DNA door standaardmethoden 15 en ga vervolgens verder met de volgende stap.
    5. Uitvoeren beperking digest op het PCR product en de vector-plasmide dat de fluorophore (bijvoorbeeld, pPD95.79) in afzonderlijke buizen door standaardmethoden 15 bevat.
    6. Scheiden van de ANI van het verteerd door gelelektroforese en elueer het PCR product en vector DNA bands in afzonderlijke buizen.
    7. Zuiveren de ANI van gel segmenten door standaardmethoden 15. Meten van DNA concentratie door spectrofotometer.
    8. Afbinden van het PCR product en vector DNA door standaardmethoden en transformeren van de recombinante ANI in bevoegde cellen met standaardmethoden 15.
    9. Verspreid 10 μL, 50 μl en 100 μl van de getransformeerde cellen op drie afzonderlijke Luria Bouillon (LB) platen aangevuld met 50 μg/mL ampicilline.
      Opmerking: Verspreid verschillende hoeveelheden cellen op verschillende platen voor een spectrum van transformatie efficiencyverbeteringen. Bijvoorbeeld ook dichtbevolkte plating niet mogelijk is de isolatie van de kolonies als transformatie efficiënt is.
    10. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts. Volgende ochtend nemen de platen uit de incubator.
      Opmerking: Als de kolonies zeer klein zijn, Incubeer gedurende verscheidene meer uren.
    11. Voorbereiden plasmide ANI van één kolonies met standaardmethoden 15. Meng sjabloon DNA en inleidingen en afgeven voor het rangschikken (meestal uitgevoerd in een core servicecenter).
    12. Lezen van de sequenties en verifiëren van de integriteit van de constructie van de fusie.
      Opmerking: kritische: bevestigen de juiste codon frame tussen ingevoegde gen en fluorescerende marker gene voor vertaling fusies. Ideaal, het volgnummer van het hele gen om te bevestigen dat geen mutatie werd geïntroduceerd tijdens de PCR en Afbinding procedures.
    13. Genereren meer plasmide DNA (met behulp van stap 1.1.11) voor injectie voor stap 1.2.
  2. Generatie transgene dieren door microinjection van DNA voor germline transformatie 18
    Opmerking: Zie de discussie voor alternatieve technieken voor de invoering van transgenen. De geschetste procedures kunnen worden gebruikt voor het genereren van transgene dieren die een fusieproteïne fluorescentie of elke andere proteïne van belang dragen. Bijvoorbeeld, kan een exogene eiwit nieuw geïntroduceerde (bijvoorbeeld een heteroloog ortholog) of een endogene eiwit kan worden (bijvoorbeeld in de overeenkomstige germline mutant voor redding) weer binnengebracht of overexpressie voor het genereren van een fenotype (bijvoorbeeld injectie voor erm-1 werd gebruikt voor het genereren van de overexpressie cystic kanaal fenotype dat als de doelstelling voor wijziging fungeert door het RNAi interactie scherm hieronder beschreven).
    1. Mix construct DNA (1 – 50 ng/μl) met marker plasmide DNA (meestal 100 ng/μl), bijvoorbeeld de dominante marker rol-6 (su1006) (zie 1.2.3 voor markeringsopties).
      Opmerking: kritische: concentratie van ingespoten DNA empirisch moet worden bepaald om te voorkomen dat invoering van artefactual fenotypen (extensie gebreken, cysten, letaliteit) als uiting van genen in de uitscheidingsmechanisme grachten die bijzonder zijn gevoelig voor de expressie van transgenen. Men kan, bijvoorbeeld, maken verschillende mengsels van plasmiden in concentraties van 1 ng/μl, 10 ng/μl, 50 ng/l en 100 ng/μL met 100 ng/μL rol-6(su1006) voor het testen van een aantal uiteenlopende concentraties voor de generatie van een levensvatbare stam met de gewenste expressie of fenotype (hoge concentraties zijn waarschijnlijk niet-specifiek toxisch voor kanaal genuitdrukking en mogelijk dodelijke).
    2. Filtreer het DNA mengsel door een 0,22-μm (micrometer) porie grootte spin-x centrifuge buis filter.
      Opmerking: Niet verlaten het deksel van de buis open om te voorkomen dat stof die de naalden van microinjection blokkeren kan.
    3. Microinject recombinante plasmiden in de gonaden van wild-type of mutant wormen door standaardmethoden voor germline transformatie (zie referentie 18 voor details van de procedure).
      Opmerking: Standaard marker plasmiden zijn, bijvoorbeeld: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Dominante transgenen als rol-6(su1006) worden ingevoerd in wild type wormen, overwegende dat redden transgenen in hun respectieve mutanten worden binnengebracht. Marker plasmiden zijn mede ingespoten voor eenvoudig onderhoud van de transgene lijnen omdat extrachromosomal transgenen willekeurig verloren tijdens de celdeling (zie 1.2.8). Bij het injecteren van genen coderend voor fusies van fluorophore, kan men ook gebruiken de fluorophore, GFP, zelf als marker. rol-6 induceert wormen te rollen rond zelf die vaak voordelig zijn voor de evaluatie van de morfogenese fenotypen.
    4. Overdracht geïnjecteerd wormen op Escherichia coli ontpit Nematode groei Medium (NGM) platen (bijv., 5 wormen/plaat) (zie verwijzing 19 voor standaard C. elegans cultuur-en onderhoudsprocedures en Tabel van materialen).
    5. Incubeer de platen en laat ontwikkelen bij 20 ° C gedurende ongeveer 3 nakomelingen overleden
    6. Onderzoeken van de nakomelingen van de F1 onder de ontleden Microscoop voor Rol (rollend) wormen (of enige andere specifieke injectie marker, bijvoorbeeld GFP) en kies rollen to afzonderlijke platen.
    7. Selecteer platen met glooiende F2 dieren en aanwezigheid van fluorescentie onder een ontleden fluorescentie Microscoop bevestigen (meestal alle roller dieren zijn positieve GFP).
      Opmerking: F2 rollen geven de succesvolle generatie van een transgene lijn. Afzonderlijke regels afwijken, bijvoorbeeld met betrekking tot transgenic transmissiesnelheid. Daarom is het nuttig om te handhaven en het opslaan van meerdere regels.
    8. Behouden de transgene lijnen door nieuwe platen voor marker-positieve dieren verrijken.
      Opmerking: De ingespoten DNA is opgenomen in de kiemcellen als een extrachromosomal matrix. Transmissiesnelheden voor extrachromosomal arrays zijn variabel maar in het algemeen rond ~ 50%. Om te verliezen niet de spanning, het is daarom cruciaal om te lijnen handmatig te verrijken met dominante markers (bijv., lijnen niet beveiligd door negatieve selectie).
    9. Bevriezen transgene lijnen door bevriezing standaardtechnieken voor lange termijn opslag bij-80 ° C 19.
      Opmerking: Transgenen op extrachromosomal arrays kunnen ook worden geïntegreerd, in de kiemcellen door UV-bestraling in een extra stap moeten opleveren van homogene regels 18. Bijvoorbeeld, erm-1 werd geïntegreerd in de kiemcellen door UV-bestraling te verkrijgen van de stam ERM-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] waar elk dier draagt de transgenic, een vereiste voor het gebruik ervan in de gebaseerde RNAi interactie scherm hieronder beschreven. Deze soort werd bovendien het label door cytoplasmatische uitscheidingsmechanisme kanaal GFP via kruising bij een stam met een vha-1 p:: GFP transgenic (gegenereerd door dezelfde procedures, zoals hierboven beschreven; zie referentie 20 voor basic genetische procedures, zoals kruizen) en wordt aangeduid als ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP stam hieronder.

2. Bouw van een gerichte RNAi bibliotheek en het ontwerp van een scherm van RNAi interactie met het fenotype van een kanaal wijzigen

Opmerking: een gerichte RNAi gebaseerde genetische interactie scherm wordt beschreven die gebruikmaakt van een overexpressie cystic kanaal fenotype te Zoek interactie uitscheidingsmechanisme canal morfogenese genen. De ERM-1 [++] stam dient (zie stap 1.2.9) als voorbeeld 9. Deze aanpak vormt slechts één van vele mogelijke benaderingen voor de genetische analyse van uitscheidingsmechanisme kanaal lumen morfogenese (Zie Inleiding en discussie voor een andere genetische aanpak). Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis 3 en verwijzingen 17 , 21 , 22 voor achtergrondinformatie over RNAi, details van RNAi procedures, modulatie van RNAi sterkte (aangepast aan de vaak dodelijke tubulogenesis genen) en bespreking van de technische problemen op aangesloten RNAi Zie referentie 19 voor standaard worm cultuur en onderhoud en Inhoudsopgave materialen.

  • Zoekt ERM-1 (of andere gen van belang) interactie moleculen in databases en gepubliceerde artikelen
      .
      Opmerking: Potentiële ERM-1 interactors zou omvatten alle moleculen die werd experimenteel aangetoond dat functioneel, genetisch of fysiek ermee ERM eiwitten in alle soorten en/of waren voorspeld te doen door een in silico, hoge doorvoer of Systeembiologie aanpak (Zie tabel 3 voor voorbeelden van databases en middelen).
    1. Genereren van een lijst van alle genen en vinden van C. elegans homologen eventueel.
      Opmerking: Overwegen uitbreiding van de lijst van geïdentificeerde genen aan gene klassen, die rekening houden met de functie van het gen van belang en verruimt het net voor het identificeren van de interactors (bijvoorbeeld voor de membraan-actine linker ERM-1, selecteert u alle actins en actin-gerelateerde moleculen).
    2. Identificeren de overeenkomstige RNAi bacteriële voederen klonen in de handel verkrijgbare genoom-brede bacteriële RNAi bibliotheken voor alle genen (b.v. Ahringer genomic C. elegans RNAi voederen bibliotheek 21; Tabel van materialen)
    3. Genereren een spreadsheet voor alle genen en hun overeenkomstige RNAi plaat en goed nummer.
    4. Plukken en strijk ~ 50 RNAi klonen op LB/ampicilline/tetracycline platen (keuze van het antibioticum wordt bepaald door de bouw van de bibliotheek) per dag en blijven tot gerichte RNAi bibliotheek wordt gegenereerd.
      Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de bibliotheek en geprojecteerde werkstroom, weglaten genereren van een volledige bibliotheek en gaan direct met batchanalyse. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C, niet langer dan ongeveer 2 weken (indien nodig, opnieuw op nieuwe borden zijn strijk daarna). Omgekeerd, een grotere bevroren bibliotheken kunt genereren in repliceren 96-Wells of 384-well formaten voor lange termijn opslag bij -80 ° C.
    5. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts. Volgende ochtend, op 4 platen verwijderen van incubator en winkel ° C.
    6. Kies RNAi bacteriën uit een plaat door een steriel tandenstoker, meng bacteriën met 600 μL LB/ampicilline (50 ng/μl) Bouillon in 1,5 mL microtube, Incubeer de buizen bij 37 ° C, schudden voor 6 h.
      Opmerking: Beënten RNAi bacteriën in de Bouillon door het wrijven van de pick (tandenstoker of micropipet tip) langs de kant van de microtube.
    7. Zaad 70 μL gekweekte bacteriën in elk putje van 6-well RNAi platen in dubbele of drievoudige sets. Incubeer de platen van de RNAi bij 22 ° C's nachts.
      Opmerking: RNAi platen worden gegenereerd door standaardprocedures (Tabel van materialen en verwijzingen 3 , 17 , 21) en hier gebruikt in een 6-well weefsel cultuur plaat formaat voor een hogere doorvoersnelheid aanpak waarmee nog voor de microscopische beoordeling van kanaal morfogenese in levende dieren op de platen.
    8. Volgende ochtend, pick 3 L4 fase ERM-1 [++]; VHA-1 p:: GFP wormen op elk putje van de RNAi platen.
      1. Om te voorkomen dat besmetting met OP50 bacteriën (zie referentie 19) die met RNAi eerst interfereren de wormen op een bord NGM zonder bacteriën zaad en laat de dieren kruipen voor ongeveer 10 minuten. Gebruik alleen gezonde dieren niet-uitgehongerd.
    9. Incubeer de platen bij 22 ° C gedurende 3 d om dieren te produceren nakomelingen.
    10. Onderzocht kanaal fenotypes bij F1 nageslacht onder de ontleden fluorescentie Microscoop.

    3. In Vivo Beeldvorming van het kanaal Excretory C. elegans door fluorescentie ontrafeling microscopie en scoren van fenotypen Tubulogenesis

    1. voorbereiden een fenotype scoren blad (voorbeeld in tabel 4 en Figuur 5 ).
    2. Plaatst de agarplaat met wormen direct onder de fluorescentie dissecting Microscoop, open deksel van de plaat voor evaluatie, gebruiken lagere vergroting te concentreren.
      Opmerking: Dit protocol beschrijft het gebruik van een scope met 1.5 X en 10 X doelstellingen en een zoombereik van 3.5 tot en met 45 (Tabel of Materials).
    3. Evalueren van dieren door zich te concentreren op elk goed afzonderlijk, te beginnen met goed 1 en werk naar beneden van de plaat.
      Opmerking: Altijd beginnen met de evaluatie van besturingselementen. Bijvoorbeeld, een mock (lege vector) negatieve controle (HT115 RNAi bacteriën (zie referenties 17 , 21) zonder of met een niet-verwante gene invoegen) en passende positieve controles, bijvoorbeeld zulks zeef interactie, erm-1 RNAi (onderdrukt het ERM-1 [++] fenotype) en sma-1 / spectrin RNAi (verbetert de ERM-1 [++] canal fenotype).
    4. , Eerst algemene fenotypen zichtbaar onder fel licht (bijvoorbeeld: laat/lethal, Clr/wissen, Emb/embryonale dodelijk, Ste/steriele UNC-/ ongecoördineerde, Dpy/dumpy, etc.), het fenotype kwantificeren door het totale aantal dieren en nummer tellen opnemen van dieren met het fenotype, de nummers (Zie tabel 4).
      Opmerking: Voor knockdowns van genen die veroorzaken gebreken die invloed kunnen zijn op de beoordeling van kanaal fenotypen (b.v., Emb, Ste), het herhalen van het experiment met voorwaardelijke beschouwen, post embryonale RNAi (zie bijbehorende papier voor procedures 3 ).
    5. Tweede, onderzoekt uitscheidingsmechanisme kanaal fenotypen onder tl-licht, scoren kwantificeerbare fenotypen (bijvoorbeeld lengte van canal, breedte van de lumen, cysten), de nummers opnemen en fenotypen beschrijven op een Score sheet (Zie tabel 4, < sterke class = "xfig" > figuur 5).
      Opmerking: Hogere vergroting met zoombereik is nodig om meer subtiele kanaal fenotypen evalueren. Heen en weer bewegen tussen lage en hoge vergroting zorgvuldig evalueren het kanaal ’ s lengte- en breedte- en eventuele andere kanaal morfogenese fenotype. Rekenen voor kwantificering of semi-kwantificering van eenvoudige fenotypen, 100 dieren (bijvoorbeeld L4s in dit gerichte RNAi scherm; fenotypes: kanaal lengte van 1/4, 1/2, 3/4 en volledige uitbreiding van posterieure grachten en lumen diameter van posterieure grachten, klein cysten (< 1/3 van dierlijke breedte), grote cysten (> 1/3 van dierlijke breedte); Zie tabel 4).
    6. Ophaal beelden van de overheersende fenotypes van ten minste 3 verschillende dieren door een Microscoop gemonteerd digitale charge - coupled apparaat (CCD) camera en bijbehorende denkbaar software (Zie Tabel van materialen)
      1. te verwerven van beelden, eerst zet camera, aangesloten computer inschakelen, dubbelklik op het pictogram afbeelding capture software, richten een gebied van de plaat van de worm handmatig onder lage vergroting en open de sluiter van de camera.
      2. Klik op het “ live voorvertoning ” icoon van afbeelding capture software op het computerscherm te visualiseren de wormen op het computerscherm, passen de focus handmatig te duidelijk visualiseren de wormen op het scherm, klik op de “ magnetisch ” pictogram, vervolgens Klik op de “ opslaan ” pictogram.
        Opmerking: Dieren zullen zich sneller bewegen onder tl-licht, dus houd enerzijds op computermuis klaar terwijl het bewegen van de plaat in het interessegebied met de andere hand. Klik dan snel op de “ magnetisch ” pictogram te verwerven van de afbeelding. Het is meestal mogelijk te verwerven van een goed imago met verschillende pogingen.
      3. De verworven afbeeldingen opslaan met een juiste bestandsnaam (inclusief stam, RNAi kloon naam en datum).
        Opmerking: Sneller bewegende wild-type wormen met dunne en lange grachten zijn moeilijker om het imago dan mutanten. Mutanten met cystic grachten en/of andere fenotypen dreigen te langzaam, waardoor imaging. Marker plasmiden zoals Rol kunnen nuttig zijn voor imaging doordat dieren “ ter plaatse ” in plaats van verplaatsen toekomen en kan ook voorzien van een betere kijk op het fenotype het dier om zich heen rollen.

    4. Beeldvorming van het kanaal Excretory C. elegans op hoge resolutie door Laser Scanning Confocal Microscopie

    1. montage van levende dieren
      1. plaats een kleine hoeveelheid vet of vaseline op het puntje van een wattenstaafje of op het puntje van de index van de vinger, en verspreid het vet voor het genereren van een uiterst dunne cirkel met een diameter van ~ 6 – 8 mm in het midden van een schone glasplaatje.
      2. Plaats 6 μL 5% lidocaïne-oplossing (verdoving) in de cirkel door een micropipet.
        Opmerking: Een stamoplossing lidocaïne kan geschieden door lidocaïne poeder in water oplost. Verdun tot 5% met M9 buffer 19 (Tabel van materialen). Het is van cruciaal belang voor de analyse van het uitscheidingsmechanisme kanaal om te voorkomen dat de gemeenschappelijke immobilisatie oplossingen (zoals natriumazide) die cysten te scheuren veroorzaken en dat induceren kanaal fenotypen.
      3. Kies verschillende dieren uit een plaat van RNAi, en plaats ze in de lidocaïne-oplossing door de worm pick 19 in de oplossing onderdompelend.
        Opmerking: Kies bij voorkeur fase-specifieke dieren die zelfs-montage door uniforme dikte zal vergemakkelijken. Dieren kunnen voorgeselecteerd voor het geval op de ontleden fluorescentie Microscoop.
      4. Plaats een dekglaasje 22 x 22 mm aan op het glasplaatje; laat het zachtjes regelen op de cirkel vet.
        Opmerking: Elke fysieke druk niet van toepassing op het dekglaasje aan die kanaal morfologie, vooral in mutanten of RNAi behandeld wormen met kanaal en eventueel andere fenotypen kan beschadigen. Het is daarom belangrijk om te voorkomen dat een dik vet cirkel; ideaal zijn de dieren voorzichtig ingeklemd tussen glasplaatje en cover slip.
      5. Schrijf de naam van het monster op de matte zijde van het glasplaatje. Meteen de dia aan de confocal microscoop voor analyse van kanaal fenotype en te verwerven beelden.
        Opmerking: Vertragingen kunnen leiden tot schade van kanaal cysten of wijzigen in kanaal lumen morfologie.
    2. Verwerven confocal beelden
      1. plaats van de dia in het werkgebied van de steekproef van de confocal microscoop, richten de wormen bij lage vergroting (10 X).
      2. Weergave en selecteer dieren onder 60 X en/of 100 X doelstellingen, onderzoeken het uitscheidingsmechanisme kanaal ’ s mobiele en subcellular fenotypen, bijvoorbeeld, lumen vorm en diameter, grootte en vorm van cysten; of de subcellular onderdelen gelabeld voor analyse, bijvoorbeeld, apicale/lumenal membraan met basale membraan, cytoplasma, endosomal versus canalicular blaasjes, andere organellen (Zie discussie, Figuur 2 en Figuur 4).
        3. Ophaal beelden van het specifieke fenotype van belang
      3. .
        Opmerking: Dit protocol beschrijft het gebruik van een laser confocal microscoop (Tabel of Materials) scannen. U kunt oplossen door subcellular componenten in de dunne C. elegans zijn uitscheidingsmechanisme grachten, hogere vergroting doelstellingen (60 X 100 X) vereist. Een draaiende schijf confocal microscoop kan worden gebruikt voor het verwerven van time lapse beelden maar biedt minder confocality (Zie discussie).
        1. Te verwerven confocal beelden, zet de computer, tweevoudig tikken voort naar de confocal microscoop software en selecteer de laser door te klikken op het pictogram van een specifieke laser.
        2. Klik op de “ scan ” pictogram om te visualiseren de gerichte worm op het computerscherm, aanpassen laser intensiteit via de software en klik nogmaals op “ scan ” pictogram Scannen stopzetten, vervolgens klikt u op “ vangen ” vangen van een afbeelding, vervolgens klikt u op het pictogram “ opslaan ” pictogram.
        3. Afbeeldingen met de juiste bestandsnaam opslaan en RNAi kloon, stam naam en datum bevatten.
          Opmerking: Afbeeldingen kunnen worden verworven als single en meerdere secties (bijvoorbeeld 10 – 15 secties langs de z-as). Afdelen kunt 3D-visualisatie. Verwerven van projectie beelden en afzonderlijk opslaan indien nodig (afhankelijk van de Microscoop). Voor een optimale resolutie, laser-instellingen te gebruiken met lage winst, niet open pinhole teveel, en voeg toe verschillende gemiddeld per beeld (zie referenties 23 ,, 24, voor algemene discussies voor confocal imaging). Zorg voor het verwerven van beelden op een helderheid onder verzadigingsniveau mogelijk te maken voor wijziging door imaging software indien nodig (bij voorkeur gebruik ongewijzigd afbeeldingen).
        4. Verwerven beelden van dubbel - of vermenigvuldigen van gelabelde kanalen (bijvoorbeeld groen, rood en blauw) op dezelfde manier, door te klikken op meerdere pictogrammen van de laser, maar gebruiken sequentiële scannen te voorkomen bloeden-via tussen kanalen (kritische voor co lokalisatie studies).
          Opmerking: Men wellicht rekening houden met de tijd die nodig is voor het sequentiële scannen (die ook leidt tot een overeenkomstige toename in foto bleken) en scannerinstellingen wijzigen. Kan niet scannen dieren van de ene dia voor meer dan 30 min maximale aspecifieke effecten op de morfologie van het kanaal te vermijden. Nieuwe dia te koppelen als langere scannen vereist is.
        5. Krijgen bijbehorende differentiële interferentie optica (DIC) / Nomarski beelden, met name als kwantificeren kanaal lengte en lumen diameter ten opzichte van de worm ’ s lichaamslengte en diameter. Overlay van fluorescentie en Nomarski afbeeldingen door te klikken op “ overlay ” pictogram om aan te tonen van bezienswaardigheden ( Figuur 1 d en figuur 4A – D).
      4. Meten voor kwantificering, de intensiteit van de fluorescentie van een gelabelde component van belang door ImageJ software 25 ( figuur 5C).

    • Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    Dit protocol wordt beschreven hoe u de uitscheidingsmechanisme grachten van C. elegans visueel en moleculair analyseren eencellige tubulogenesis en intracellulaire lumen morfogenese in één cel. Tijdens hun uitbreiding uit de tijd van halverwege embryogenese naar volwassenheid blijven de vier uitscheidingsmechanisme grachten uitbreiden van hun basolaterale en apicaal/lumenal membranen samen met hun canalicular en endosomal endomembraansysteem, bieden een uniek model voor de in...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    C. elegans genetische veelzijdigheid, transparantie, eenvoudige lichaam plan en invariant cel lineage alle maken het een uitstekend model voor de analyse van de voedselproductie. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met standaard genetische manipulaties en beeldvorming studies om te profiteren van de 2 micron dun C. elegans uitscheidingsmechanisme grachten te studeren gepolariseerde membraan en intracellulaire lumen biogenese in de buis van een enkele cel.

    Labele...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Openbaarmakingen

    De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

    Dankbetuigingen

    Wij danken M. Buechner (Universiteit van Kansas Kansas, USA), K. Nehrke (medisch centrum van de Universiteit van Rochester, Rochester, New York, USA) en de Caenorhabditis genetica Center, gefinancierd door de National Institutes of Health, Office van onderzoeksinfrastructuur Programma's (P40 OD010440). Dit werk werd gesteund door subsidies NIH GM078653, MGH IS 224570 en 223809 van de stabilisatie-en associatieovereenkomst te V.G.

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Klonen
    Plasmid pPD95.75AddgeneCat. Nr. 37464
    PCR KitQiagenCat. Nr. 27106
    Ligation kitNew England BiolabsCat. Nr. E2611L
    DNA markerThermo ScientificCat. Nr. SM1331
    Agarose DNA gradeFisher ScientificCat. Nr. BP164-100
    Competent cellenNew England BiolabsCat. Nr. C2987H
    TrisFisher ScientificCat. Nr. BP154-1
    EDTASigmaCat. Nr. ED-1KG
    AzijnzuurFisher ScientificCat. Nr. A38S-500
    EthidiumbromideFisher ScientificCat. Nr. BP1302-10
    Apparatuur
    PCR-machine MJ ResearchCat. Nr. PTG-200 
    CentrifugeEppendorf Cat. Nr. 5415C
    WaterbadPrecision Scientific Cat. Nr. 666A3 
    Gel draaiend instrumentFisher ScientificCat. Nr. 09-528-165
    Gel draaiende voedingFisher ScientificCat. Nr. 45-000-465
    Moleculair Imager Gel Doc XR SysteemBio-RadCat. Nr. 1708195EDU
    Nanodrop SpectrofotometerThermo ScientificCat. Nr. ND1000
    C. elegans gerelateerd11zie referentie19 voor standaard C. elegans cultuur en onderhoud procedures.
    LB Medium en platen22zie referentie19 voor protocollen.
    Tryptone Acros OrganicsCat. nr. 611845000
    Gist ExtractBD BiosciencesCat. nr. 212750
    NaClSigmaCat. nr. S7653
    Bacto Agar BD BiosciencesCat. nr. 214040
    AmpicillineSigmaCat. nr. A0116
    TetracyclineFisher ScientificCat. nr. BP912
    M9 Medium22zie referentie19 voor protocollen.
    NaClSigmaCat. nr. S7653
    KH2PO4SigmaCat. nr. P0662
    Na2HPO4SigmaCat. nr. S7907
    MgSO4SigmaCat. nr. M2773
    NGM platen 22zie referentie19 voor protocollen.
    NaClSigmaCat. nr. S7653
    Peptone BD BiosciencesCat. nr. 211677
    Tryptone Acros OrganicsCat. nr. 611845000
    Bacto Agar BD BiosciencesCat. nr. 214040
    MgSO4SigmaCat. nr. M2773
    CaCl2SigmaCat. nr. C3881
    Cholesterol SigmaCat. nr. C8667
    K2HPO4 SigmaCat. nr. P3786
    KH2PO4SigmaCat. nr. P0662
    RNAi platen33zie referentie21 voor protocollen.
    NaClSigmaCat. nr. S7653
    Peptone BD BiosciencesCat. nr. 211677
    Tryptone Acros OrganicsCat. nr. 611845000
    Bacto Agar BD BiosciencesCat. nr. 214040
    MgSO4SigmaCat. nr. M2773
    CaCl2SigmaCat. nr. C3881
    Cholesterol SigmaCat. nr. C8667
    K2HPO4 SigmaCat. nr. P3786
    KH2PO4SigmaCat. nr. P0662
    IPTG US BiologicalCat. nr. I8500
    CarbenicillineFisher ScientificCat. nr. BP2648
    NaOHFisher ScientificCat. nr. SS266-1
    NatriumhypochlorietFisher ScientificCat. nr. 50371500
    Bacteriën
    OP50 bacteriënCGC
    HT115 bacteriënCGC
    Genoombreed RNAi bibliotheken
    Ahringer genoombreed RNAi voedingsbibliotheek (ref21,58,59)Source BioScience
    C. elegans ORF-RNAi voedingsbibliotheek (ref60)Source BioScience
    Beeldvorming gerelateerd
    LidocaineMP Biomedicals,LLGCat. nr. 193917

    Referenties

    1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
    2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
    3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
    4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
    5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
    6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Genetics. 203 (1), 35(2016).
    7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
    8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
    9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
    10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
    11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
    12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
    13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
    14. Boulin, T., et al. Reporter gene fusions, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. , April 5, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
    15. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrook, J., DW, R. ussell , Cold Spring Harbor Laboratory Press . (2006).
    16. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
    17. Ahringer, J. Reverse genetics, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. 6, April 6, 2006 http://www. wormbook.org (2006).
    18. Transformation and microinjection, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Evans, T. C. , April 6, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
    19. Maintenance of C. elegans, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Stiernagle, T. , February 11, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
    20. Genetic mapping and manipulation: Chapter 7-Making compound mutants, WormBook. The C. elegans Research Community, WormBook. Fay, D. , February 17, 2006 http://www.wormbook.org (2006).
    21. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
    22. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
    23. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer. (2006).
    24. Hibbs, A. R. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. US. (2004).
    25. Bankhead, P. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
    26. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
    27. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
    28. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
    29. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
    30. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
    31. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
    32. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
    33. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
    34. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
    35. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
    36. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
    37. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
    38. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449(2015).
    39. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
    40. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
    41. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
    42. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
    43. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
    44. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
    45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
    46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
    47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
    48. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
    49. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
    50. GeneMANIA. , http://genemania.org/ (2017).
    51. AceView. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ieb/research/acembly/ (2017).
    52. iHOP. , http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP / (2017).
    53. Saccharomyces Genome Database. , http://www.yeastgenome.org (2017).
    54. Flybase. , http://www.flybase.org (2017).
    55. Mouse Genome Database. , http://www.informatics.jax.org (2017).
    56. Human Genome Database. , http://www.gdb.org (2017).
    57. BLAST. , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017).
    58. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
    59. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
    60. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Tags

    Eencellige tubulogeneseGFP-fusielabelingconfocale microscopie-imagingfluorescentie-dissectiemicroscopiegenereren van transgene dierenfenotypische scoreanalyse
    Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming
    Neem contact met ons op
    Aanbevelen aan de bibliotheek

    Privacy

    Gebruiksvoorwaarden

    Beleidsoverzicht

    Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.