Gebruik van capsules voor negatief vlekken van virale monsters in biocontainment

Summary

Dit protocol bevat instructies voor negatieve kleuring virusmonsters die gemakkelijk in BSL-2, -3 of -4 laboratoria kunnen worden gebruikt. Het omvat het gebruik van een innovatieve verwerkingscapule die het transmissie-elektronenmicroscopie rooster beschermt en de gebruiker makkelijker in de meer turbulente omgevingen in biocontainer vergemakkelijkt.

Abstract

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gebruikt om de ultrastructuur van virussen en andere microbiële pathogenen met nanometeroplossing in acht te nemen. De meeste biologische materialen bevatten geen dichte elementen die elektronen kunnen verstrooien om een ​​beeld te creëren; Daarom is een negatieve vlek die dikke zware metalen zouten rond het monster plaatst nodig. Om virussen in suspensie onder de TEM te visualiseren, moeten ze toegepast worden op kleine roosters die bedekt zijn met een doorzichtig oppervlak dat alleen nanometer dik is. Vanwege hun kleine grootte en breekbaarheid zijn deze roosters moeilijk te hanteren en gemakkelijk verplaatst door luchtstromen. Het dunne oppervlak is gemakkelijk beschadigd, waardoor het monster moeilijk of onmogelijk is om de afbeelding te maken. Infectieuze virussen moeten in een biosafety-kabinet (BSC) worden behandeld, en sommige hebben een biocontainende laboratoriumomgeving nodig. Staining virussen in biosafety niveaus (BSL) -3 en -4 is bijzonder uitdagend omdat deze omgevingen meer turbulent zijn en technici nodig zijn tO Persoonlijke beschermende uitrusting dragen (PPE), wat de handigheid vermindert.

In deze studie hebben we een nieuw apparaat geëvalueerd om te helpen bij negatieve kleuringvirussen in biocontainment. Het apparaat is een capsule die werkt als een gespecialiseerde pipettip. Zodra grids in de capsule zijn geladen, aspireert de gebruiker simpelweg reagentia in de capsule om het virus en vlekken aan het ingekapselde rooster af te leveren, waardoor gebruikersbehandeling van roosters wordt verwijderd. Hoewel deze techniek speciaal is ontworpen voor gebruik in BSL-3 of -4 biocontainment, kan het monsterbereiding in elke laboratoriumomgeving vergemakkelijken door makkelijk negatief kleuring van het virus mogelijk te maken. Dezezelfde methode kan ook toegepast worden om negatieve gekleurde TEM-monsters van nanodeeltjes, macromoleculen en dergelijke exemplaren op te stellen.

Introduction

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een effectief instrument om de morfologie en ultrastructuur van biologische monsters te zien die te klein zijn om te zien in een traditionele lichtmicroscoop ^{1 , 2 , 3 , 4} . TEMs schiet elektronen door een zeer dun specimen dat een hogere resolutie beeld produceert, omdat elektronen een veel kortere golflengte hebben dan licht. Regio's van de steekproef die elektronen buigen of blokkeren, verschijnen donker, terwijl gebieden die elektronenlucent zijn, wit verschijnen.

Gebrek aan elektronen dichte materie maakt virussen moeilijk om te zien onder een TEM omdat ze elektronen niet kunnen verstrooien. Negatieve kleuring is de meest voorkomende methode voor het maken van contrast en het bekijken van virussen met een TEM. De eerste negatieve kleurprocedure werd in 1959 door Brenner en Horne voorgesteld, gebaseerd op een experiment waar Hall (1955) en Huxley (1957) observerenBij het verschijnen van biologische structuren in omgekeerd contrast wanneer ze gedompeld worden in een elektrondichte stof ⁵ . Het proces van negatieve kleuring is in de afgelopen halve eeuw vrijwel ongewijzigd. Negatieve kleuring houdt kort in het toepassen van een zware metalen zoutoplossing op een monster op een TEM-raster in een poging om het virus te omringen met dicht materiaal zonder het virus te infiltreren ⁶ . Dit creëert een donkere grens en onthult de vorm ^{5 van} het deeltje. In deze studie worden twee reagentia gebruikt voor negatieve kleuring, uranylacetaat (UA) en kaliumfosphotungsticzuur (PTA). Beide deze vlekken worden vaak gebruikt om kleine biologische monsters te negeren, zoals virussen, eiwitcomplexen en nanodeeltjes ^{7 , 8 , 9} .

De conventionele negatieve kleuringstechniek is de handmatige druppel negatieve kleuringstechniekNique ⁷ . Deze methode vereist nauwkeurige behandeling van kleine, breekbare TEM-rasteren met pincet om kleine hoeveelheden virusmonster, vlek en spoelwater toe te passen. Het typische voorbereidingsprotocol omvat het aanbrengen van een druppel monsterophanging op het oppervlak van een filmomhulde TEM-rooster ( Figuur 1A ). Na het aanbrengen van het monster op het filmoppervlak wordt het rooster afgespoeld om niet-bijhanden virus te verwijderen en gedurende enkele seconden tot een minuut met ofwel UA of PTA gekleurd, afhankelijk van het type monster. Overmatige vloeistof is slecht weg van het raster door een stuk filterpapier aan de rand van het raster aan te raken.

De handmatige druppelmethode vereist dat elk raster individueel gemaakt wordt. Als het niet zorgvuldig wordt behandeld, kunnen de gecoate TEM-roosters gemakkelijk worden gebogen, gebogen of besmet. Het verwerken van meerdere monsters kan leiden tot problemen bij het bijhouden van de roosters en het verzekeren van consistente kleuring voor elk monster. Deze handleiding kleuring procedure is veel meer dEfficiënt wanneer uitgevoerd in biosafety-niveau (BSL) -3 en -4 biocontainerlaboratoria, vanwege de benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) die nodig zijn voor deze omgevingen. PPE is omslachtig en de biocontainermilieu is veel turbulent in vergelijking met een regulier laboratorium. Personeel in BSL-3 biocontainerlaboratoria moet 2 paren handschoenen dragen en in een biosafety-kast (BSC) werken. Deze dubbele laag handschoenen vermindert de gevoelige gevoeligheid en beperkt de fijne motorbeweging. De luchtstroom van het BSC dat de gebruiker beschermt en de verontreiniging van het monster voorkomt, kan ervoor zorgen dat de monsters en vlekken te snel drogen, waardoor de vlekkwaliteit wordt beïnvloed. De sterke turbulente luchtstroom in het BSC kan ook snel een raster dat niet goed beveiligd is, wegblazen. In BSL-4 biocontainende laboratoria zijn er extra veiligheidseisen. Personeel moet een positief drukpak dragen, waardoor de fysieke beweging verder wordt beperkt en het vermogen om duidelijk te zien en te manipulerenUlate grids. De technicus die in BSL-4 werkt, draagt ​​ook minimaal 2 paar handschoenen, waarbij het buitenste paar een dikke handschoen is die de handvaardigheid en tactiele sensatie aanzienlijk vermindert. Tenslotte zijn de pinnen die gebruikt worden om TEM-rasters aan te pakken scherp, waardoor de technicus een risico oplevert vanwege hun vermogen om handschoenen te punken. Met capsules die roosters bevatten, zijn er geen tanggen nodig, waardoor een veilig, pincetvrij alternatief voor het manipuleren van roosters in biocontainering is. Tenslotte bieden de capsules ook een effectieve manier om rasters op te slaan tijdens de verwerking, de ontsmetting van osmiumdampen en tijdens de opslag; Waardoor de roosters georganiseerd en veilig zijn tegen schade.

In dit rapport introduceren we een nieuwe methode voor negatieve kleuring TEM-rasteren in biocontainerlaboratoria die mPrep / g capsules, een capsule-based apparaat voor roosterbehandeling en kleuring ^{10 , 11 , 12 gebruiken} . De capsule komt erbijModelleert twee TEM-rasters, minimaliseert directe handhaving en vermindert het potentieel voor roosterschade. De capsule hecht direct op een enkel- of multikanaalspipet op dezelfde manier als een pipettip, waardoor de toepassing van verschillende vloeistoffen op rasters in de binnenkant mogelijk is. Dit maakt het gelijktijdig mogelijk om meerdere monsters met dubbele rasters te maken ( figuur 1B ). Naar negatieve vlekken met capsules wordt het virusmonster in de capsule gesuspendeerd en 10 minuten gehouden om de virussen op de gridoppervlakken te adsorberen. De roosters met geadsorbeerd virus worden vervolgens gewassen met gedeïoniseerd (dl) water en gedurende enkele seconden tot 1 minuten met enten UA of PTA gekleurd. Dit proces maakt gebruik van dezelfde protocol stappen en reagentia als de handmatige druppel methode; Het verschil is dat alle werkzaamheden binnen de capsule optreden zonder fysieke hantering van de roosters. ( Figuren 1C , 1D ).

Het doel van deze studie was om capsules te evalueren alsEen nieuwe methode voor negatieve kleuring van virusmonsters in biocontaineromgevingen. In deze studie werd ook gekeken naar de kwaliteit van TEM-beelden die zijn geproduceerd uit twee verschillende virusinactivatieprocedures: 1) snelle inactivering, 1% osmiumtetroxide-damp en 2) een 24 uur inactivatie met 2% glutaraldehyde. Beide deze werden uitgevoerd met behulp van de capsules. Tenslotte hebben we twee vaak gebruikte negatieve vlekken, UA en PTA geëvalueerd voor gebruik in de capsule. ¹³

Protocol

1. Experimentvoorbereiding in een BSL-2 omgeving voorafgaand aan het werken met de virusmonsters

1. Bereid of koop Formvar- en koolstofcoated TEM-koperroosters, meestal 200-400 mesh.
2. Plaats de gecoate TEM-roosters in capsules.
   1. Gebruik een vergrootglas om dit proces makkelijk te maken. Een of twee roosters kunnen in elke capsule worden ingebracht. Voorgeladen capsules kunnen worden gekocht om deze stap te elimineren, indien gewenst.
3. Vervang de capsules met ingebouwde TEM-bekledingsroosters, samen met andere benodigdheden en reagentia, naar biocontainers waar de virussen negatief worden gekleurd.

2. De Capsule Methode voor Negatief Staining in Biocontainment Met Waterig Glutaraldehyde En 1% Osmium Tetroxide Damp Inactivering

1. In het biocontainer BSC aspireren 40 μl virus suspensie in de capsule die aan een pipet is bevestigd.
   OPMERKING: De pipet blijft vast aan de aansluitingE capsule tot het proces is voltooid. Viruspreparatie is volgens onze vorige publicatie ¹⁴ .
2. Plaats de pipet aan de zijkant gedurende 10 minuten met horizontale grids. Dit is een even verspreiding van virusdeeltjes op de gecoate grids te bevorderen.
3. Inactiveer het virus binnen de capsule binnen het biocontainer BSC.
   1. Pak de pipet op en druk de plunjer om de virusoplossing in een afvalcontainer af te geven.
   2. Aspireren 40 μL 2% glutaraldehyde fixatief in de capsules.
      Let op: Glutaraldehyde is een gevaarlijke chemische stof en vereist een passende bescherming. Glutaraldehyde kan voor korte perioden in een normaal BSC worden gebruikt, maar uitgebreid open reagens vereist werk in een BSC of chemische dampkap.
   3. Plaats de pipet voor 20 minuten aan de zijkant. Dit zorgt ervoor dat monsters goed vast zijn.
   4. Verwijder de fixatie en haal 40 μL dl water in de capsules naar wVerwijder de fixatie weg. Herhaal deze wasstap voor in totaal 3 spoelcycli.
4. Aspireren 40 μL van 1% uranylacetaat (UA) of 1% kaliumfosphotungsticzuur (PTA) in de capsules en laat 30 s zitten.
   OPMERKING: De staining time kan variëren van 10 s tot 1 min op basis van het virusmonster.
   Let op: UA is een alfa-emitter, en een cumulatief toxine. Hanteer het met passende bescherming.
5. Verwijder de capsule uit de pipet en maak de netjes droog door een stuk filterpapier aan de rand van de roosters te raken, terwijl de roosters binnen de capsule blijven.
6. Osmium Tetroxide Damp Inactivatie Procedure.
   1. Plaats de capsule met het deksel open in een 50 ml centrifugebuis met filterpapier die in een 1% osmiumtetroxideoplossing is gedrenkt.
      Let op: Osmiumtetroxide is extreem giftig met lage dampdruk. Het moet gebruikt worden in een BSC of chemische dampkap. Hanteer het met passende bescherming. Bericht waarschuwingInformatie in het werkgebied.
   2. Verzegel de 50 ml centrifugebuis gedurende 1 uur om volledige permeatie van de osmiumtetroxide-damp toe te laten. Vervolgens ontdoen en verplaats de buis vervolgens de biocontainer naar de BSL-2 EM-faciliteit.
7. Verwijder EM roosters uit de capsule.
   1. Verwijder de capsule van de centrifugebuis in de BSL-2 EM-installatie en plaats deze op een pipet.
   2. Aspireer 40 μl dl water in de capsule en doseer het water drie maal in een afvalcontainer.
   3. Verwijder de capsule uit de pipet en doe de roosters uit met behulp van filterpapier om de rand van de roosters aan te raken.
   4. Na het drogen van de lucht, sla de roosters op voor de volgende TEM-beeldvorming.

3. De Capsule Methode voor Inactivering in Biocontainment Met 2% Glutaraldehyde, gevolgd door Negatief Staining in een BSL-2 Laboratorium

1. Virus inactivatie procedure.
   1. In de biocontainer BSC meng de virus suspensieput met hetzelfde volume 4% glutaraldehyde om een ​​uiteindelijke concentratie van 2% glutaraldehyde te bereiken.
      Let op: Glutaraldehyde is een gevaarlijke chemische stof en vereist een passende bescherming. Glutaraldehyde kan voor korte perioden in een normaal BSC worden gebruikt, maar uitgebreid open reagens vereist werk in een BSC of chemische dampkap.
   2. Inactiveer virussen met fixatief gedurende minimaal 24 uur voor verpakking, ontsmetting en overdracht naar de BSL-2 EM faciliteit.
2. In de BSL-2 EM-faciliteit, aspireren het virus en het fixatieve mengsel in de capsule, die twee TEM-roosters bevat die aan een pipet zijn bevestigd.
3. Plaats de pipet horizontaal gedurende 10 minuten met de grids horizontaal georiënteerd.
   OPMERKING: dit bevordert een gelijkmatige verdeling van virusdeeltjes op de TEM-rasteren.
4. Pak de pipet op en druk de plunjer in om het virus naar een afvalcontainer te laten verdrijven. Aspireren 40 μl dlWater in de capsules en verdrijf het in de afvalcontainer voor 3 spoelcycli.
5. Aspireren 40 μL van 1% UA of 1% PTA in de capsules gedurende 30 s.
   OPMERKING: De kleurtijd varieerde van 10 s tot 1 min op basis van het virusmonster.
   Let op: UA is een alfa-emitter, en een cumulatief toxine. Hanteer het met passende bescherming.
6. Verwijder de capsule uit de pipet en maak de netjes droog door de rand van de roosters aan een stuk filterpapier te raken. Lucht de roosters op en droog ze voor de volgende TEM-beeldvorming.

Results

De capsule methode produceert goede kwaliteit negatieve kleuring voor TEM beeldvorming:

Ten eerste evalueren we de kwaliteit van beelden die gegenereerd worden door gebruik te maken van zowel de handmatige druppelmethode als de capsulemethoden voor negatief kleuring van Zaire ebolavirus. Ebolavirussen zijn lid van de familie Filoviridae , samen met Marburg-virus. Ebolavirus is typisch 80 tot 100 nm in diameter en kan mee...

Discussion

Negatieve kleuring is een waardevolle TEM-techniek voor het evalueren en sorteren van virussen, eiwitcomplexen en nanodeeltjes. Druppelbereiding van deze monsters door het handmatig verplaatsen van grids van reagens tot negatieve vlekken is het klassieke protocol voor meer dan een halve eeuw. Het is een simpel proces, maar vereist expertise opgedaan door opleiding voor succesvolle afronding. Uitstekende negatieve kleuring wordt nog steeds beschouwd als een state-of-the-art vaardigheidsset en zeer gewenst in veel TEM lab...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM