Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren

Summary

Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.

Abstract

Verschillende morphologies en complexe anatomische relaties worden weergegeven in cellen. Hoe de cellen communiceren met hun buren? Verschillen de interacties tussen celtypes of zelfs binnen een bepaald type? Wat voor soort ruimtelijk regels volgt ze? De antwoorden op deze fundamentele vragen in vivo hebben tot nu toe belemmerd door een gebrek aan hulpmiddelen voor het labelen van hoge resolutie eencellige. Hier vindt u een gedetailleerd protocol te richten op enkele cellen met een MultiColor FlpOut (MCFO) techniek. Deze methode is gebaseerd op drie anders tagged verslaggevers (HA, vlag en V5) onder UAS controle die stille worden gehouden door een transcriptionele terminator geflankeerd door twee FRT sites (FRT-stop-FRT). Een warmte-puls induceert de uitdrukking van een warmte schok-geïnduceerde Flp recombinase, die willekeurig de FRT-stop-FRT cassettes in afzonderlijke cellen verwijdert: expressie treedt alleen op in cellen die ook uitdrukking geven aan een GAL4 stuurprogramma. Dit leidt tot een matrix van verschillend gekleurde cellen van een bepaald celtype waarmee de visualisatie van individuele cel morphologies met hoge resolutie. Als voorbeeld, kan de MCFO-techniek worden gecombineerd met specifieke gliale GAL4-stuurprogramma's te visualiseren van de morphologies van de verschillende gliale subtypen van in de volwassen Drosophila hersenen.

Introduction

Glia, de bevolking van de non-neuronale cellen van het zenuwstelsel (NS), lang werden verondersteld een statische kader te bieden voor neuronen en daarom niet in detail zijn bestudeerd. Echter bij de mens, glia vormen de overgrote meerderheid van de cellen in de NS (~ 90%) en vallen in verschillende categorieën, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten, microglia en cellen van Schwann. Glia vormen in Drosophila, ongeveer 10% van de cellen in de NS. Intrigerend, zijn hun morphologies en functies opvallend vergelijkbaar met die gevonden in gewervelde dieren^1,2. Hun morphologies omvatten de bloed - hersen barrière (BBB) vormen epitheel, ensheathing en Astrocyt-achtige cellen.

De Drosophila centrale zenuwstelsel (CNS) bestaat uit de volgende belangrijkste structuren: cortex-regio's waarin de neuronale cel organen; neuropils die synaptic verbindingen haven; kleine en grote axon traktaten die verbinding maken met de verschillende neuropiles; perifere zenuwen die zintuiglijke organen en spieren met het CNS (Figuur 1 verbinden). Glia zijn gevonden die zijn gekoppeld aan alle van deze anatomische structuren: Cortex glia (CG) in de corticale gebieden, Astrocyt-achtige glia (ALG) en ensheathing glia (EG) in de neuropile regio's, ensheathing glia houden ook verband met centrale axon vezelbundels en perifere zenuwen (EGN), en ten slotte twee blad-achtige glia, perineurial glia (PG) en subperineurial (SPG), die vormen samen een aaneengesloten laag dat betrekking heeft op de hele NS (Figuur 2).

Eerdere studies hebben aangetoond dat glia spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van de NS; Zij bewaken van neuronale cel nummers door te reageren op insuline-achtige peptiden systemisch te circuleren, neuronen, zoals de Astrocyt-neuron lactaat shuttle, trofische ondersteunen en elimineren van stervende neuronen door fagocytose^{3,4 , 5 , 6}. in de volwassen NS, glia behouden van de BBB, neurotransmitters innemen en handhaven van Ionische homeostase, fungeren als de grote immuuncellen in de NS, aangezien de macrofagen kunnen schenden de BBB en moduleren synaptic activiteit evenals dierlijk gedrag^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

Of gespecialiseerde functies worden uitgevoerd in de verschillende gliale subtypen blijft een belangrijk open vraag. Een systematische analyse van het genoom-brede van glia, vooral in de volwassen, heeft echter belemmerd door een gebrek aan passende genetische hulpmiddelen voor hun manipulatie. Hier, wordt een methode waarmee de karakterisering van het efficiënt en eenvoudig cel vormen om te studeren van complexe cel-cel interactie gepresenteerd. Deze techniek is vereffend karakteriseren de morfologie van de verschillende gliale subtypes in de volwassen hersenen Drosophila , maar, afhankelijk van de specifieke GAL4 stuurprogramma gebruikt, het zou kunnen worden aangepast om te bestuderen van neuronen^12,13 , elke vorm van vermenging cellen, en in principe elk weefsel in elke ontwikkelingsstadia.

Protocol

1. voorbereiden vliegen voor experimenten MultiColor FlpOut (MCFO)

Opmerking: de MCFO techniek verwijst naar een gewijzigde versie van de zogenaamde Flp-gemedieerde stop cassette excisie (FlpOut). Transgene MCFO vliegen dragen een warmte schok promotor (hsp)-Flp recombinase en verschillende verslaggevers onder UAS. Elke verslaggever bestaat uit een gemeenschappelijke ruggengraat van een myristoylated (myr) super map groen fluorescent proteïne (sfGFP), in welke 10 exemplaren van een tag epitope (bv., HA, vlag of V5) zijn ingevoegd. De resulterende niet-belichting fluorescerende eiwitten heten " spaghetti monster GFPs " (smGFPs) ¹⁴ en kan worden opgespoord met behulp van specifieke antilichamen tegen de verschillende epitoop afsluitcodes.

1. Kruis vliegt met de cassette MCFO en de hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) naar de desbetreffende gliale GAL4 stuurprogramma regels (zie tabel van materialen) .
   1. Zoals de hsp al actief bij 25 ° C is en weinig cellen kunnen ondergaan recombinatie leidt tot een aspecifieke labelen, opgericht kruisen bij 18 ° C om te voorkomen dat leakiness van het systeem. Wacht ongeveer 20 dagen bij 18 ° C tot het verkrijgen van de F1-generatie. Na de voorronde shock (zie stap 2), handhaven van vliegen bij 25 ° C ( Figuur 3).

2. Heat Shock

Opmerking: afhankelijk van de plaats van de invoegpositie, de efficiëntie van de hsp-Flp kan verschillen; daarom de optimale warmte schok tijd moet worden geoptimaliseerd. Voor dit protocol, een MCFO vliegen voorraad waarin de hsp-Flp is ingevoegd op het X-chromosoom is gebruikt (Zie Tabel of Materials).

1. Overdracht die nakomelingen van het Kruis in stap 1.1 (F1 generatie vliegen, 3-4 dagen oud) in nieuwe flesjes met voedsel en warmte, schokken hen bij 37 ° C in een waterbad.
   Opmerking: Jonge vliegen (1-2 dagen oud) zijn zeer gevoelig voor warmte schok. Wacht nog 1 of 2 dagen alvorens de warmte schok uit te voeren teneinde het sterftecijfer veroorzaakt door de behandeling. Gebruik enkele van de F1-generatie vliegt als een besturingselement, zonder warmte schok.
2. Tijdens de warmte schok, handhaven vliegen in normale flesjes met voedsel ter vermindering van het aantal stress-geïnduceerde sterfte. Zetten van de vrouwtjes en mannetjes in aparte flesjes.
3. Zorg ervoor om te dompelen van het hele flesje in het water om de schok van een homogene warmte. Een schok van 5-8 min gebruiken als een geschikt uitgangspunt voor sparse labeling van glia cellen met veel GAL4 stuurprogramma lijnen; de schok duur moet worden geoptimaliseerd voor elke bestuurder en experiment (korter of langer warmte schok keer eventueel).
4. Na de schok van de warmte, de flesjes horizontaal op de Bank voor een paar minuten te leggen zodat de vliegen om te herstellen van de schok van de hitte.
   Opmerking: Het is niet nodig om te veranderen van de flesjes.
5. De vliegen bij 25 ° C te handhaven en ontleden (zie stap 3 en 4) ze 2 of meer dagen na de schok van de warmte voor optimale verslaggever expressie.

3. Voorbereiding van de dissectie en oplossingen

1. de dag van de dissectie, bereid verse kleefpoeders oplossing in 200 µL PCR buizen door het mengen van 180 µL cultuurmedium van S2 cel met 20 µL van 20% paraformaldehyde (PFA) te verkrijgen van een 2% PFA-oplossing. Handhaven van de kleefpoeders oplossing op ijs, vóór en tijdens de dissectie.
   Let op: PFA is giftig en moeten met zorg worden behandeld.
   Opmerking: Meng 160 µL cultuurmedium van S2 cel met 40 µL van 20% paraformaldehyde (PFA) in een buis van 200 µL PCR te bereiden een 4% PFA-oplossing in plaats van een 2%-oplossingligttussen.
2. Gebruik van een PCR tube per genotype met een maximum van 8-10 hersenen per buis voor een optimaal resultaat van de kleuring.
3. Bereiden de volwassen hersenen wassen oplossing: 0,5% bovien serumalbumine, 0,5% Triton X-100 in PBS.
   Opmerking: Afhankelijk van de kleuring, een oplossing die 1% Triton X-100 kan nodig zijn. Een hogere concentratie van Triton X-100 verhoogt de penetratie van het antilichaam in het weefsel en het is nodig om de vlek-regio's die diep in het weefsel (bijvoorbeeld synaptic regio's in de volwassen hersenen Drosophila liggen).
4. Bereid de blokkerende oplossing: 0,5%, 3% normale geit serum en 3% normale ezel serum Triton X-100 in PBS.
5. De volwassen hersenen wassen oplossing en de blokkerende oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor een paar weken.
6. Diepe depressie wells glasplaat op ijs gezet en vul elk goed met de volgende oplossingen: één met 70% ethanol, een met PBS, en één met S2 cel kweekmedium.

4. Volwassen hersendissectie

1. plaatst u een 3 cm schotel op het podium van een stereomicroscoop ontleden en vul deze met koud S2 cel kweekmedium. Voeren van alle de ontledingen in dit medium om ervoor te zorgen dat het weefsel gezond tijdens de procedure van de dissectie blijft.
   Opmerking: Gebruik een ontleden schotel bekleed met enkele millimeters van zwarte siliconen waarmee een goede achtergrond contrast (in de beelden), en behoud van de verlostang tijdens de dissectie.
2. Anesthetize de vliegen met CO ₂ met gewenste genotype.
3. Met pincet, grijp de vlieg door de vleugels en wassen in koud 70% ethanol voor 30 s, vervolgens met koud PBS voor extra 30 s.
4. Overbrengen van de vlieg in de diepe depressie goed dat gevuld is met S2 cel kweekmedium.
5. Dezelfde procedure herhaal voor alle vliegen van de dezelfde genotype en deze handhaven in koude S2 cel kweekmedium tot dissectie, die de weefsel behouden zal.
   Opmerking: Alleen het aantal vliegen die kan worden ontleed in een periode van ongeveer 30 min. lange incubatie keren in S2 cel kweekmedium aan het weefsel schade kan Anesthetize.
6. Pak het vliegen met een tang en, onder een stereomicroscoop, dompelen de vlieg in S2 cel kweekmedium.
7. Losmaken het hoofd van de rest van het lichaam. Negeren van het lichaam en houd het hoofd ondergedompeld in S2 cel kweekmedium. Het is uiterst belangrijk te houden het hoofd met een Tang voor de gehele duur van de dissectie. Als het hoofd begint te zweven, het zal moeilijk zijn om zonder beschadiging van het weefsel worden opgehaald.
8. Beginnen de dissectie door te trekken uit een oog, terwijl het hoofd met ten minste één pincet te allen tijde. Zorg ervoor dat het uiteinde van de verlostang is net onder het netvlies te vermijden beschadiging van het weefsel onder. Trek het andere oog en beginnen met het verwijderen van de cuticle, totdat de hersenen verschijnt.
9. Verwijder alle tracheale weefsel en epidermis rond de hersenen totdat het weefsel schoon verschijnt. Zorg ervoor dat alle tracheale weefsel rond de hersenen voor een optimaal resultaat van de kleuring; verwijderen de weefsels zijn nu klaar om te worden vastgesteld en gekleurd.
10. Behouden alle de ontleed hersenen in koude S2 cel kweekmedium vóór de overbrenging van hen in de PFA-oplossing om de tijd van de fixatie stap.

5. Volwassen hersenen kleuring

< ol>

De geïsoleerde hersenen met een pipet P10 Pipetteer in de PFA oplossing bij kamertemperatuur (RT). Om te voorkomen dat weefselschade, gebruik nooit pincet voor het overbrengen van de hersenen na de dissectie. Voer alle stappen uit in 200 µL PCR buizen op een nutator.

Voor alle stappen, vóór het verwijderen van de oude oplossing met een pipet P200, toestaan dat de hersenen te vestigen op de onderkant van de buis. Probeer te verwijderen van de bovendrijvende vloeistof zonder het aspirating van het weefsel. Het weefsel beschermen tegen blootstelling aan licht.

Bevestigen de hersenen in 200 µL van 2% PFA in S2 cel kweekmedium gedurende 1 uur of 4% PFA gedurende 30 minuten. Houden van fixatie keer identieke monsters teneinde reproduceerbaarheid.

Na 3 (of meer) van 15 minuten in 200 µL van volwassen hersenen wassen van de oplossing, wast blokkeren de weefsels met 200 µL van het blokkeren van de oplossing voor 30 minuten. Langere incubatietijd tijden in het blokkeren van de oplossing zijn mogelijke.

De hersenen 's nachts bij 4 ° C met primaire antilichamen verdund in volwassen hersenen wassen oplossing in een totaal volume van 200 µL Incubate.
Opmerking: De incubatie tijden kunnen variëren afhankelijk van het type antilichaam gebruikt. Langer incubations kunnen nodig zijn.

1. Voor het labelen van de drie MCFO markers, Incubeer de hersenen met anti-HA (1:500), Dizzee RASCAL (DYKDDDDK epitoop) (1:100), en de primaire antilichamen anti-V5.
2. Primaire rechtstreeks-geconjugeerde antilichamen kunnen worden gebruikt in plaats van de normale combinatie van primaire + secundaire (bv., anti-V5:DyLight 549 (1:200)). In dit geval de direct-geconjugeerde antilichamen te behandelen als secundaire antilichamen.
   Opmerking: Voor elk genotype, houden sommige hersenen als besturingselementen om te controleren of het specifieke karakter van de kleuring. Overslaan van het primaire antilichaam-incubatie en ga direct naar de volgende stap.

Wassen van de weefsels 3 keer gedurende 1 uur in 200 µL van volwassen hersenen wassen oplossing (stap 3.3) en ze uit te broeden met secundaire fluorophore-geconjugeerde/primaire rechtstreeks-geconjugeerde antilichamen verdund in volwassen hersenen wassen oplossing 's nachts op 4 ° C of gedurende 4 uur op RT, in een totaal volume van 200 µL
Opmerking: voorbeelden van passende antilichamen: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1:200) en DyLight 647 (1:100)-geconjugeerde antilichamen.

Wassen de hersenen 3 keer gedurende 1 uur in 200 µL van volwassen hersenen wassen oplossing, gevolgd door een laatste wassen in 200 µL van PBS's nachts bij 4 ° C of gedurende 1-2 uur op RT; de laatste wassen stap in PBS verwijdert alle sporen van Triton X-100 en is noodzakelijk voor optimale kleuring resultaten. Monteren van de hersenen in montage medium met een anti-vervagen-agent op glas coverslips.

6. Montage van de hersenen voor Imaging

1. Trim een imaging spacer om de juiste grootte met behulp van schaar. Voor hoge resolutie microscopie, sandwich het specimen en imaging tussenstuk tussen twee glas coverslips.
   Opmerking: Imaging spacers zijn dunne (0,12 mm dik) zelfklevende spacers die schil en stok op glas coverslips of Microscoop dia's, zodat de montage van specimens zonder compressie.
2. Met pincet, de zelfklevende voering uit één oppervlak te verwijderen en toe te passen van de spacer, met de klevende kant naar beneden, op het oppervlak van een glas dekglaasje aan (22 mm x 60 mm). Breng 10 µL van montage medium een nieuwe glas dekglaasje aan.
3. Met een P10 Pipetteer overbrengen in de hersenen van de buis 200 µL het dekglaasje aan, naast de daling van montage medium. Samen met de weefsels, overdracht van sommige PBS teneinde de hersenen in oplossing.
4. Met een P10 Pipet, verplaatsen de hersenen van de PBS aan de daling van montage medium probeert om de hoeveelheid PBS te beperken. De modellen in de montage medium overdragen op het dekglaasje aan met de beeldvorming spacer. Genoeg montage media gebruiken ter dekking van het specimen.
5. De andere zelfklevende voering uit de bovenkant van het tussenstuk verwijderen en toevoegen van een glas dekglaasje aan op de top van de specimens. Met het puntje van een pincet, een zachte druk van toepassing over het zelfklevende gebied te verzegelen. Afbeelding van de gekoppelde weefsels onmiddellijk of op te slaan van de dia's op-20 ° C voor een latere anayse.

7. Afbeelding van overname

1. ophaal stapels confocal fluorescentie beelden met behulp van een confocal microscoop met een 40 X (NB = 1.2, water onderdompeling) doel of 63 X (NB = 1.4, olie-immersie) doelstelling (pixelgrootte = 1024 x 1024 in de xy-oppervlakte; Afstand tussen twee confocal secties = 0,5 µm). Aanpassen van de detector winst en offset in elk kanaal op zodanige wijze dat geen verzadigde pixels en nulwaarden pixel aanwezig in de beelden zijn; Dit voorkomt gegevensverlies en zorgt voor gebruik van het volledige dynamische bereik van de detector.
   Opmerking: Aangezien 3D-beeldbewerking tijdrovend is, de metingen kunnen worden geautomatiseerd door het scannen van meerdere monsters parallel op verschillende locaties. Om te voorkomen dat de verdamping met de doelstelling van het water onderdompeling, gebruik speciale olie onderdompeling medium met brekingsindex n = 1.33.
2. Verwerken van de confocal stacks voor maximale dichtheid projecties, wijzigingen in kanaal tint en de aanpassing van helderheid en contrast met standaardimage analysesoftware (Zie Tabel of Materials).

Results

Deze sectie ziet u voorbeelden van de resultaten die kunnen worden verkregen met behulp van de MCFO-techniek in de volwassen Drosophila hersenen. Figuur 3 ziet u een schematische voorstelling van de methode. Drie anders membraan-gelabeld verslaggevers (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG en myr-smGFP-V5) onder UAS controle worden stil gehouden door een transcriptionele terminator geflankeerd door twee FRT sites (FRT-stop-FRT). Een warmte-...

Discussion

Dit protocol beschrijft een gemakkelijke en efficiënte methode om te studeren van de morfologie van de verschillende soorten cellen binnen een weefsel van belang op hoge resolutie. Met de MCFO techniek, worden meerdere verslaggevers met verschillende epitoop tags gebruikt in combinatie voor multicolor stochastische labeling (Figuur 2). Vergelijkbaar met andere methoden zoals zwHANSje/Flybow^15,16,17,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water bath	Grant	GD100
PCR tubes	Sarstedt	72.737.002
Forceps	Dumont	11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glas dissectieplaat
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate	Corning	7223-34	Glas dissectieplaten
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	zelfgemaakt met houtskool
ExpressFive S2 cell culture medium	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normal goat serum	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal donkey serum	Jackson Laboratories	017-000-121
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Primair antilichaam, verdunning 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Primair antilichaam, verdunning 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Geconjugeerd antilichaam, verdunning 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Secundair antilichaam, verdunning 1:250
anti-rat DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Secundair antilichaam, verdunning 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Neem contact op met het bedrijf voor bestellen
Microscope cover glass 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm	Roth	H874
Stereo Microscope, Leica MZ6	Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Immersievloeistof voor fluorescentiemicroscopie, halogeenvrij
Immersol	Zeiss	W 2010	Immersievloeistof voor water-immersieobjectieven, halogeenvrij
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4-driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4-driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS-reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J)			Beeldanalysesoftware
Multi Time Macro	Zeiss		Software voor geautomatiseerd scannen