Eenvoudige verwijdering van achtergrond fluorescentie in formaline-vaste menselijk hersenweefsel voor immunofluorescentie microscopie

Samenvatting

Achtergrond autofluorescence van biologische monsters bemoeilijkt vaak fluorescentie gebaseerde beeldvormingstechnieken, vooral in de leeftijd postmitotic weefsels. Dit protocol beschrijft hoe de autofluorescence van deze monsters effectief kan worden verwijderd met behulp van een commercieel beschikbare licht emitterende diode licht het monster vóór immunokleuring photobleach bron.

Samenvatting

Immunofluorescentie is een gemeenschappelijke methode gebruikt om te visualiseren subcellular compartimenten en om te bepalen van de lokalisatie van specifieke proteïnen binnen een weefsel monster. Een grote belemmering voor de overname van afbeeldingen van hoge kwaliteit immunofluorescentie is endogene autofluorescence van het weefsel veroorzaakt door veroudering pigmenten zoals lipofuscin of door gemeenschappelijke monster preparatietechnieken zoals fixatie van de aldehyde. Dit protocol beschrijft hoe achtergrond fluorescentie kan sterk worden verminderd door photobleaching gebruik van witte fosfor lichtemitterende diode (LED) arrays voorafgaand aan de behandeling met fluorescerende sondes. De breedspectrum uitstoot van witte fosfor LEDs zorgen voor het bleken van fluorophores in een heel scala van emissie pieken. De photobleaching apparatuur kan worden geconstrueerd van off-the-shelf onderdelen tegen zeer lage kosten en biedt een toegankelijk alternatief voor commercieel beschikbare chemische quenchers. Een photobleaching voorbehandeling van het weefsel gevolgd door conventionele immunofluorescentie kleuring produceert beelden gratis achtergrond autofluorescence. In vergelijking tot stand gebracht van chemische quenchers die verminderd sonde evenals achtergrond signalen, photobleaching behandeling had geen effect op de sonde fluorescentie intensiteit terwijl het effectief verminderd achtergrond en lipofuscin fluorescentie. Hoewel photobleaching meer tijd voor voorbehandeling vereist, kunnen hogere intensiteit LED-arrays worden gebruikt om photobleaching tijd te verminderen. Deze eenvoudige methode kan mogelijk worden toegepast op een verscheidenheid van weefsels, met name postmitotic weefsels die zich ophopen van lipofuscin zoals de hersenen en cardiale of skelet spieren.

Inleiding

Microscopie van de fluorescentie met antilichamen gericht op specifieke proteïnen is routinematig gebruikt om te visualiseren van eiwitten van belang in celkweek en weefsels. Een belangrijke complicatie voor de verwerving van duidelijke en definitieve afbeeldingen in immunofluorescentie is autofluorescence, die kan worden veroorzaakt endogeen in zoogdieren weefsel door de leeftijd pigment lipofuscin en eiwitten zoals elastine en collageen^{1, 2}. Andere bronnen van autofluorescence kunnen worden ingevoerd door monster voorbereiding stappen zoals aldehyde fixatie³. Lipofuscin korrels, voornamelijk samengesteld uit oxidatively gemodificeerd eiwit en de residuen van de afbraak van de lipide, accumuleren in lange-levende cellen met toenemende leeftijd². Dit veroorzaakt problemen in imaging postmitotic weefsels zoals de hersenen en cardiale of skelet spieren, zoals de fluorescentie emissiespectrum van lipofuscin is breed en variabele, vaak samenvalt met de golflengte van de emissie van gemeenschappelijke fluorophores gebruikt voor labelen van⁴. Deze factoren maken beeldvorming van menselijk hersenweefsel van gevallen van late-onset neurodegeneratieve ziekten zoals Frontotemporale lobar degeneratie (FTLD) bijzonder uitdagend.

Verklein autofluorescence en hebben we een techniek waarbij we de dia gemonteerde weefselsecties bestralen met een wit licht emitterende diode (LED) array gebruikmakend van een huishoudelijke desk lamp⁵bedacht. Deze eenvoudige techniek biedt een alternatief voor technieken die gebruik maken van chemische quenchers zoals CuSO₄ in ammoniumacetaat, of in de handel verkrijgbare blussen kleurstoffen zoals Soedan zwart B en eriochroomzwart T⁶. Het heeft ook aanzienlijke kostenbesparende over multispectrale LED lamp photobleaching technieken en vermijdt complicaties en artefacten die zijn gegenereerd op basis van digitale autofluorescence verwijdermethoden zoals spectrale un-mix^7,8. Witte fosfor LEDs hebben een breed emissiespectrum, hoge helderheid en lage productiekosten, waardoor ze ideaal zijn als een off-the-shelf component voor photobleaching een verscheidenheid van chromophores^5,9.

In dit protocol, we aantonen dat de bouw van een photobleaching-apparaat met behulp van toegankelijke componenten en photobleaching gelden voor een geval van FTLD weefsel bevattende tau-positieve insluitsels (FTLD-T) met behulp van een antilichaam specifiek voor gefosforyleerd tau. We tonen het effect van photobleaching op imaging fluorescently gelabelde antilichamen met twee veelgebruikte chromophores: Alexa 488 en Texas rood. Het effect van photobleaching ten opzichte van de onbehandelde secties of degenen met een commerciële chemische quencher behandeld worden gekwantificeerd en vergeleken. Deze voorbehandeling photobleaching kan worden opgenomen in elk standaard immunofluorescentie kleuring protocol te verwijderen van de autofluorescence in een biologische steekproef.

Protocol

Opmerking: het werk gepresenteerd werd uitgevoerd in overeenstemming met erkende internationale normen, met inbegrip van de internationale conferentie voor harmonisatie (ICH), de Raad voor internationale organisaties van medische wetenschappen (CIOMS) , en de beginselen van de verklaring van Helsinki. Gebruik van menselijk weefsel was met de goedkeuring van University Health Network onderzoek Ethics Board. De menselijke hersenen monsters werden verzameld als onderdeel van de maritieme weefselbank van de hersenen. Op het moment van collectie, geïnformeerde toestemming is verkregen van alle patiënten.

1. bouw van photobleaching apparatuur en oplossingen

1. voorbereiden stamoplossingen.
   1. Bereiden 1 L 1 x voorraad Tris-gebufferde zoutoplossing (1 x TBS) oplossing (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) door ontbinding 8.77 g NaCl en 6.06 g van Tris baseren in 800 mL ddH ₂ O en breng de pH op 7.4 met behulp van HCl. Breng het volume aan 1 L en autoclaaf. < / Li >
   2. 10% (200 x stock) natriumazide bereiden door ontbinding van 1 g van natriumazide in 10 mL ddH ₂ O (10%, 200 x voorraad).
2. Voor 1-3 standaard formaat dia's, een enkele 100 x 100 mm transparant, vierkante petrischaal te gebruiken als een dia-kamer. Toevoegen voor een enkele dia kamer, 0,25 mL 200 x natrium azide voorraad aan 50 mL 1 x TBS om een 0,05% azide-TBS oplossing te maken. 2-3 dia chambers verticaal om te verwerken van extra dia's stapelen. Een extra 50 mL azide-TBS oplossing voorbereiden op elke kamer.
3. Maken een steiger te verheffen van de dia kamer (s) zodanig dat een lamp hoofd past onder.
   1. Voor een 100 mm x 100 mm dia kamer, gesneden openingen in de bodem en zijkanten van een 100 x 100 mm x 30 mm plastic voedsel verpakking en omkeren van de container. Zorgen de openingen kant zijn groot genoeg om te passen van een LED-lichtbron en ervoor zorgen dat de onderste opening groot genoeg zodat het licht uit de lichtbron bereikt de monsterkamer zonder belemmering.
   2. Toepassing elektrische tape op de steiger te verhogen van de greep tussen de steiger en het monster kamer/benchtop. Gebruik van alternatieve materialen voor de bouw van de steiger zolang het veilig de dia kamer verheft zonder het belemmeren van het licht van het bereiken van het monster.
4. Diffusoren of ondoorzichtige plastic verwijderen uit de desk lamp die kan belemmeren het LED-licht direct bereiken het monster (indien mogelijk) en oriënteren van de LED-array naar boven. Plaats de steiger en glijbaan kamer (s) boven de LED-array. Gebruik van een lamp met een flexibele hals voor gemakkelijke manipulatie.
5. Construct een reflecterende koepel dekken voor het apparaat door de voering van de binnenkant van een doos groot genoeg ter dekking van de dia kamer en steiger met aluminiumfolie. Gebruik een 1 mL pipet tip doos voor een enkele kamer of een 150 x 150 mm x 150 mm kartonnen doos voor meerdere, verticaal gestapeld chambers.

2. Voorbehandeling van het photobleaching van weefselsecties

Opmerking: weefsel sectie voorbereiding kan variëren afhankelijk van de bron van de weefsels en de fixatie en de gebruikte methoden te embedding. Hier, hersenweefsel (orbitofrontale gyri) van een geval van FTLD-T werd bevestigd in formaline, doorlopen een verloop van sacharose, ingebed in de OCT en teruggebracht tot 10 µm dik secties met behulp van een cryostaat dagenlang ~ 2.

1. In een 4 ºC koude kamer, koude kabinet of koelkast, oriënteren de lamp onder de steiger en plaats de monsterkamer op het schavot. Giet 50 mL azide-TBS oplossing in de monsterkamer.
2. Submerge weefselsecties gemonteerd op standaard glas Microscoop dia's in de zaal van de dia met azide-TBS met behulp van schone pincet. Voor meerdere dia's, zorg er ook voor dat de dia's in de zaal op een enkellaags.
3. Betrekking hebben op het apparaat met de reflecterende koepel, inschakelen van de LED-lamp en incubeer gedurende 48 uur bij 4 ° c.

3. Immunofluorescentie

1. vlek van het weefsel voor gefosforyleerd tau met behulp van de DAPI counterstain en Alexa 488- en Texas Red-geconjugeerde secundaire antilichamen, eerst voorbereiden oplossingen voor antigeen ophalen, permeabilization, blokkeren en primaire antilichaam-bindende.
   1. Bereiden 500 mL antigeen ophalen buffer (citroenzuur van 10 mM, 2 mM ethyleendiamminetetra zuur, 0,05% Tween-20; pH 6.2) door het oplossen van 0,92 g citroenzuur en 0,37 g ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in 500 mL ddH ₂ O. aanpassen de pH naar 6.2 met NaOH en Voeg 0,25 mL Tween 20.
   2. 500 mL van 0,025% bereiden Triton X-100 in TBS oplossing (TBS-Triton) door toevoeging van 0,125 mL van Triton X-100 tot 500 mL 1 x eetlepels
   3. Voorbereiden een 1% bovien serumalbumine (BSA) oplossing in TBS (BSA-TBS buffer) door het oplossen van 0.1 g BSA 10 ml eetlepels
   4. Bereid een blokkerende oplossing door toevoeging van 0,2 mL van normale geit serum tot 1.8 mL van de 1% BSA/eetlepels
   5. Voor elke dia 150 µL van primair antilichaam oplossing (1:100 verdunning) te bereiden door pipetting 1.5 µL van anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) antilichaam in 148.5 µL van 1% BSA-TBS buffer en laat op ice.
2. Voor het uitvoeren van antigeen ophalen, onderdompelen photobleached dia's verticaal in een dia verzamelaar met 25 mL antigeen ophalen buffer. Beveilig de verzamelaar met tape en/of tekenreeksen zodanig dat de verzamelaar niet in het waterbad valt. Verwarm de verzamelaar in een waterbad bij 90 ° c gedurende 30 minuten en laat de verzamelaar afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten voordat u de dia's verwijdert. Ken niet verwijderen de dia's onmiddellijk als het leiden de secties tot zal te drogen.
3. Overbrengen van de dia's van de verzamelaar van antigeen ophalen in een kleuring pot gevuld met 30 mL TBS-Triton en wassen van de secties gedurende 5 minuten op een roteerschudapparaat met zacht schudden. Herhaal het wassen een keer met vers TBS-Triton. Pit weg overtollige buffer met een stofvrije tissue en schetsen van het weefsel met een hydrofobe pen. Wees voorzichtig niet te laten uitdrogen dia's.
   1. Voor elke dia blokkeren van het weefsel door pipetting 200 µL van het blokkeren van de oplossing op het weefsel en de dia in een bevochtigde zaal plaats. Construeer de kamer door het plaatsen van een dia-rek in een pipet tip doos met een natte papieren handdoek. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur op een vlakke ondergrond. Zorgen dat de blokkerende oplossing volledig heeft betrekking op het weefsel.
4. De blokkerende oplossing verwijderen door aspiratie en Pipetteer 100-150 µL van primair antilichaam oplossing op het weefsel. Zorgen voor voldoende hoeveelheid antistoffen aanwezig is en dat de sectie op een vlakke ondergrond om te voorkomen dat bundeling van antilichaam oplossing aan de ene kant is. Incubeer bij 4 ° c 's nachts in een bevochtigde kamer.
5. Het secundair antilichaam mengsel en de DAPI nucleaire counterstain voorbereiden.
   1. Voor elke dia 150 µL van secundair antilichaam mengsel (1:100 verdunningen) door toevoeging van 1,5 µL van geit-antimuis Alexa 488 en 1,5 µL van geit-antimuis Texas rood tot 147 µL van BSA-TBS voor te bereiden en laat op ice.
   2. Voorbereiden 0,1 µg/mL DAPI counterstain door seriële verdunning. Meng de stockoplossing en verdunnen 1 µL van voorraad 5 mg/mL DAPI in 999 van TBS 1 mL 5 µg/mL oplossing maken. Verdun voor elke dia 3 µL van 5 µg/mL oplossing met 147 µL van TBS om een eindconcentratie van 0,1 µg/mL.
      Let op: DAPI is een bekende mutagene stof en moet met zorg worden behandeld.
6. Verwijderen van het primaire antilichaam door aspiratie. Het onderdompelen van de dia's in een glazen pot met 30 mL TBS-Triton en wassen voor 5 min met zacht mengen op een roteerschudapparaat kleuring. Herhaal de stap wassen met verse TBS-Triton. Pit weg overtollige TBS-Triton en Pipetteer 100 tot 150 µL van secundair antilichaam mengsel aan elke dia.
   1. Zorg ervoor het weefsel wordt volledig gedekt door het antilichaam-mengsel. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in de bevochtigde zaal in het donker.
7. Verwijderen van het secundair antilichaam mengsel door aspiratie en breng de dia in een glazen pot met 30 mL TBS (geen Triton) kleuring. Wassen voor 5 min met zacht mengen op een roteerschudapparaat. Herhaal de stap wassen met verse eetlepels 100 tot 150 µL van 0,1 µg/mL DAPI counterstain toepassen op elke dia en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
8. De dia's overbrengen in een glazen pot met TBS kleuring en 3 keer wassen met zacht mengen voor 5 minuten elk, met behulp van verse TBS voor elke wasbeurt. Wick weg overtollige buffer.
9. Van toepassing 3 druppels van waterige montage middellange tot het weefsel. Met behulp van Tang, zachtjes lager een dekglaasje schoon glas aan op het weefsel, beginnen met een van de randen en langzaam het verlagen van de andere rand te overvullen van luchtbellen vermijden. Wees voorzichtig niet te verjagen van de dekglaasje aan als imaging onmiddellijk. Anders, laat het medium van de montage te drogen voordat u ze opslaat bij 4 ° c in het donker.

4. Fluorescentie microscopie

1. beurt de fluorescentie-lamp, de Microscoop en de computer en het toestaan van de lamp tot warm gedurende 15 min. plaats het gekleurd weefsel dia's in de fluorescentie Microscoop fase. Het beeld helder veld gebruiken om te zoeken van het weefsel bij 10 x vergroting.
2. Pas een druppel ddH ₂ O voor het dekglaasje aan oppervlak en gebruik een objectief van 20 x water onderdompeling (NB = 1.0). Selecteer de 4-regelig gemiddelde vliegtuig scan instellen. Stel de grootte van de pinhole aan 1 luchtige eenheid die een optische segment van ~ 3 micron geeft. Selecteer de laser excitatie en emissie golflengten voor elke fluorophore in afzonderlijke tracks voor beste signaal.
   Opmerking: Alexa 488: λ _ex = 488 nm (argon laser) λ _em = 493-570 nm; Texas rood: λ _ex = 561 nm (DPSS 561 nm laser), λ _em = 601-635 nm; DAPI: λ _ex = 405 nm (laser Diode 405), λ _em = 410-507 nm.
   1. Pas de kracht van de laser en krijgen van instellingen voor het optimaliseren van de signaalsterkte voor elke track. De samengestelde afbeelding verzamelen en opslaan. Gebruik van dezelfde laser instellingen te vergelijken van de intensiteit van de fluorescentie in een andere dia.
3. Voor visualisering van de intensiteit van de fluorescentie in elk kanaal, installeren de RGB-profiel tools macro voor ImageJ ¹⁰. Sla de macro op de webpagina als een tekstbestand (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Selecteer in het menu ImageJ Plugins - > macro - > installeren; Selecteer het tekstbestand dat de RGB-profielen hulpprogramma te installeren.
   1. Open van de confocal afbeeldingsbestand in ImageJ en omzetten in de samengestelde afbeeldingen van de 3 stapeltjes RGB-door het uitvoeren van de volgende: beeld - > Color - > kanaal Tool. Selecteer " composiet " uit het dropdownmenu en controleer alle drie kanalen. Selecteer beeld - > Type - > RGB kleur.
   2. Selecteer het pictogram hulpprogramma's van RGB-profiel en een lijn aanzuigen en de sectie in de afbeelding om te worden geprofileerd. De intensiteit-gegevens opslaan als een spreadsheet voor het plotten.

Resultaten

De stap van de voorbehandeling photobleaching kan worden toegevoegd aan een standaard immunofluorescentie protocol onmiddellijk voorafgaand aan de herwinning van het antigeen en immunokleuring (figuur 1A). Vergadering van het photobleaching apparaat kan ook worden uitgevoerd met behulp van diverse, goedkoop, overal verkrijgbare componenten (figuur 1B). Het emissiespectrum van witte fosfor LEDs bestrijkt een breed scala van golfle...

Discussie

De photobleaching voorbehandeling van weefsels die worden beschreven in dit manuscript zorgt voor effectieve eliminatie van autofluorescence overal verkrijgbare componenten gebruiken. Het protocol beschrijft immunofluorescentie beeldvorming van gefosforyleerd tau aggregaten in formaline-vaste menselijk hersenweefsel met behulp van secundaire antilichamen zijn geconjugeerd met Alexa 488 en Texas rood, met DAPI als een nucleaire counterstain. Om de methode toepassen op andere weefsels, is het raadzaam voor het uitvoeren va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Chlororide	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	Alle componenten van de fotobleker kunnen worden vervangen op basis van beschikbaarheid
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	Alle componenten van de fotobleker kunnen worden vervangen op basis van beschikbaarheid
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software begeleidt de confocale microscoop
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007