Methodenartikel

Een roman gebruik van driedimensionale hoogfrequente Ultrasonografie voor vroege zwangerschap karakterisering in de muis

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56207

⸱

24 oktober 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Devision of Repreoductive Endocrinology and Infertility, Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine, 2Mouse Phenotyping Core, Baylor College of Medicine, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Muizen worden veel gebruikt om te studeren zwangerschapsduur biologie. Beëindiging van de zwangerschap is echter vereist voor dergelijke studies die zich verzet tegen longitudinale onderzoek en vereist het gebruik van grote aantallen dieren. Daarom beschrijven we een niet-invasieve techniek van hoge-frequentie Ultrasonografie voor de vroegtijdige opsporing en het toezicht na implantatie gebeurtenissen in de zwangere muis.

Samenvatting

Hoge-frequentie Ultrasonografie (HFUS) is een gemeenschappelijke methode niet-gebeurt de ontwikkeling te volgen real-time van de menselijke foetus in utero. De muis is het routinematig gebruikt als een model in vivo embryo-implantatie en zwangerschap progressie te studeren. Helaas, dergelijke lymfkliertest studies vereisen de onderbreking van de zwangerschap om follow-up fenotypische analyse. Om aan te pakken dit probleem, we gebruikten driedimensionale (3-D) reconstructie van HFUS gegevens voor vroegtijdige opsporing en karakterisering van lymfkliertest embryo-implantatie sites en hun persoonlijke ontwikkelings progressie in uteroimaging. Combinatie van HFUS beeldbewerking met 3D-reconstructie en modellering, konden we nauwkeurig kwantificeren embryo-implantatie site nummer evenals developmental progressie in zwangere C57BL6J/129S muizen van 5,5 dagen post coïtus (d.p.c.) door naar 9.5 d.p.c. controleren met het gebruik van een transducer. Metingen opgenomen: nummer, de locatie en omvang van implantatie sites evenals Inter implantatie site afstand; embryo levensvatbaarheid werd beoordeeld door cardiale Activiteitencontrole. In de onmiddellijke na implantatie periode (5.5 tot 8,5 d.p.c.), 3D-reconstructie van de gravid baarmoeder in zowel mesh en solide overlay indeling ingeschakeld visuele representatie van de ontwikkelingslanden zwangerschappen binnen elke baarmoeder hoorn. Aangezien genetisch gemodificeerde muizen worden gebruikt blijven voor het karakteriseren van vrouwelijke reproductieve fenotypen afgeleid van baarmoeder dysfunctie, biedt deze methode een nieuwe benadering om te detecteren, kwantificeren en karakteriseren vroege implantatie gebeurtenissen in vivo. Deze roman gebruik van 3D-HFUS imaging bewijst de mogelijkheid met succes kunt ontdekken, visualiseren en karakteriseren van embryo-implantatie sites tijdens de vroege lymfkliertest zwangerschap in een niet-invasieve wijze. De technologie biedt een significante verbetering over huidige methodes, die afhankelijk zijn van de onderbreking van de zwangerschappen voor grove weefsels en histopathologische karakterisering. Hier gebruiken we een video en tekst formaat om te beschrijven van het succesvol uitvoeren van ultrasone klanken van de vroege lymfkliertest zwangerschap voor het genereren van betrouwbare en reproduceerbare gegevens met de wederopbouw van de uteriene vorm in mesh en solide 3D-beelden.

Inleiding

Terugkerende vroege zwangerschap verlies is een van de meest voorkomende complicaties na de bevruchting en invloed op ongeveer 1% van de koppels proberen te bedenken van1,2. De onderliggende mechanismen van vroege zwangerschap verlies zijn gevarieerd: van intrinsieke embryonale afwijkingen en moeders comorbidities met fouten in het baarmoederslijmvlies ontvankelijkheid1,3,4. Muismodellen hebben vanwege hun genetische werkwillig, wijd gebruikt voor onderzoek naar vroege embryo-implantatie en zwangerschap. Bovendien, de korte zwangerschapsduur tijd van de muis en de mogelijkheid voor het uitvoeren van grootschalig onderzoek hebben gezorgd voor de groeiende nut van de muis bij het aanpakken van de belangrijkste klinische vragen in menselijke reproductieve geneeskunde5. Dat gezegd hebbende, de overgrote meerderheid van lymfkliertest experimentele designs vereisen nog steeds talrijke dams worden euthanized op sequentiële zwangerschapsduur dagen te kwantificeren en te analyseren van implantatie locatie, aantal, de grootte en spatiëring patronen tijdens zwangerschap6, 7,8, waardoor uitschakeling longitudinale studies op hetzelfde dier.

In de kliniek is echografie een betrouwbare en onschatbaar hulpmiddel voor de monitoring van menselijke foetale levensvatbaarheid en ontwikkeling in een niet-invasieve wijze9,10,11. Meer recentelijk, hoge-frequentie echografie (HFUS) is begonnen met beperkte toepassingen vinden in de muis als een methode voor de controle van de foetale levensvatbaarheid en de groei tijdens de zwangerschap12,13,14. De recente technologische vooruitgang in echografie beeldbewerking toestemming hebben de toepassing van driedimensionale (3-D) gegevens voor visuele wederopbouw van dierlijke organen en de daaropvolgende monitoring van pathologieën15,16, 17. Gebruik van deze geavanceerde weergavetechnologie heeft de bevoegdheid om te detecteren kleiner volume schommelingen, om spreiding over de dieren, en om te controleren de progressie van een pathologie of de werkzaamheid van een therapeutische interventie17aanzienlijk verbeterd. Terwijl de primaire nut van deze technologie is geweest om te controleren van maligniteit progressie in Europa modellen15,16, is 3-D HFUS imaging pas onlangs gebruikt te kwantificeren en te controleren van de actieve groei van embryo-implantatie en foetale ontwikkeling in de muis baarmoeder18.

Hier, laten we zien hoe uit te voeren HFUS imaging te produceren van 2D en 3D-gegevens voor het genereren van reconstructies van de vroege muis van de zwangere baarmoeder. We tonen het nut van deze nieuwe methode voor het detecteren van deze vroege embryonale implantatie gebeurtenissen zonder de noodzaak voor beëindiging van de zwangerschap, waardoor onderzoekers om gegevens te verzamelen in een niet-invasieve wijze.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

deze studies werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health en de dierlijke protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Baylor College of Medicine onder protocol nummer AN-4203.

1. voorbereiding van de zwangere muis voor echografie

  1. getimede paring
    1. plaats de dam met een bewezen vruchtbare mannelijke muis 's nachts begin na 1700. Dam en gescheiden man door 0700 uren (h), ongeacht als vaginale plug aanwezig is, om ervoor te zorgen nauwkeurige datering van zwangerschap.
      Opmerking: De ochtend na de paring wordt beschouwd als 0,5 dag post coitum (d.p.c.).
  2. Voorbereiding voor echografie
    1. plaats van de zwangere muis in een verzegelde verdoving inductie container.
    2. Sedate met Isofluraan (2%) door inademing verdoving en zuurstof (1 L/min) totdat het dier de restarmen reflex (ongeveer 1-2 min afhankelijk van de grootte van de muis verliest) en spontane bewegingen niet worden nageleefd (naast de ademhaling).
    3. Plaats ingetogen muis in liggende positie in neus kegel met Isofluraan (2%) inademing verdoving en zuurstof (1 L/min). Ophthalmic zalf van toepassing op het dier ' s ogen.
    4. Met een wattenstaafje, ontharende room van toepassing op de hele buik, borstbeen naar de vagina, en lateraal aan de flanken.
    5. Toestaan crème te blijven voor een maximum van 3 min, en verwijder vervolgens crème en haar met weefsel. Zorg ervoor dat u alle haren is, zoals elke resterende haren beeldkwaliteit zal afnemen.

2. Voorbereiding van de echografie fase

  1. inschakelen de transducer.
  2. Hechten van 3D-motor fase motor fase aan de transducer.
    1. Plug in 3D motor door het aansluiten van de 3D motor-kabel aan op de 3D motor aansluiting op het achterpaneel. Het 3D locomotorisch stelsel aan de montagesysteem met behulp van de snelsluiter post op de top te verbinden met de beeldvorming station, te koppelen en de quick release mount op de bodem te bevestigen de transducer klem.
  3. Hechten van de sonde aan de transducer klem.

3. Begin de zwangere muis Imaging

  1. plaats muis liggende op het waarnemingsplatform. De muis voortdurend ontvangt Isofluraan verdoving (tussen 1,5 tot 2,5%) en zuurstof (1 L/min) via de neus. Zachtjes tape alle poten tegen hartslag stootkussens op het platform toezicht.
    1. 1-2 mL van echografie transmissie gel van toepassing op buik.
  2. De ultrasone sonde met behulp van de handmatige motor fase, plaats op de onderbuik.
    1. Ga naar de blaas, die moet worden weergegeven als een vloeistof gevulde donkere cirkel net craniale om de vaginale opening.
    2. Zodra de blaas zich bevindt, beweeg de sonde zeer langzaam craniale te visualiseren van de zwangere baarmoeder, die moet worden weergegeven als een cilindrische vorm met ronde gebieden op zwangerschap sites. Dit kan worden omschreven als het op zoek als parels aan een ketting.
    3. Zodra de zwangere baarmoeder is geconstateerd, beginnen 2D-imaging.

4. De 2-D echografie beeldvorming (figuur 1)

  1. zodra de zwangere baarmoeder is geconstateerd, begint bij de zwangerschap-site die zich het dichtst bij de blaas en langzaam en sequentieel naar craniale bepalen van aantal en de locatie van zwangerschap sites.
  2. Als de nieren, de milt of de lever worden gevisualiseerd, verplaatsen de sonde dichter caudal (dichter bij de blaas) als de gebruiker gegaan ook veel craniale.
  3. Beeld van de contralaterale uteriene hoorn op dezelfde wijze.
  4. Het beeld bevriezen wanneer het frame van de echografie is in het midden van de implantatie/zwangerschap site op te slaan voor latere analyse en metingen.
    Opmerking: Het duurt minder dan een seconde voor de afbeelding moet worden bevroren en opgeslagen voor latere analyse.
  5. Maatregel implantatie afstand met behulp van de hyperechoic decidualization reactie als merkstof door handmatig te klikken op de " maatregel " gereedschap eerst, en vervolgens te klikken op de locatie van een site van de innesteling. Sleep vervolgens de cursor naar de volgende implantatie-site en klik op een punt dat de computer automatisch verslag aan de afstand uitbrengen zal. De software zal vervolgens verslag wat de handmatige meting is. Deze stap is niet geautomatiseerd, maar vertrouwt op de gebruiker ter gelegenheid van de afstand tussen decidualized sites door een lijn te trekken tussen de decidualized sites, die het programma biedt een meting voor
  6. Implantatie grootte, zwangerschapsduur OSS grootte en foetale pole grootte meten.

5. Foetale hartslag

Opmerking: bij 9.5 d.p.c., de foetale hartslag moet duidelijk worden gevisualiseerd.

  1. Terwijl de sonde nog steeds zeer, zet de pols golf Doppler en plaatst dit op de zichtbare heartbeat.
  2. Record de cardiale hartslag pulsaties.
    Opmerking: Afgezien van het hart, deze procedure kan ook opnemen pulsaties in de navelstreng.

6. 3D-echografie overname

  1. na de zwangere baarmoeder heeft zijn gevisualiseerd op 2D-imaging, plaatst u de sonde in een gebied dat is ongeveer halverwege de gewenste 3D-afbeelding. Bijvoorbeeld, als een waren een appel in 3D imaging, de sonde moet in eerste instantie worden geplaatst waar het klokhuis wordt voorspeld worden gevestigd (dwz midden van object).
  2. Met de sonde in een positie in het midden van de gewenste afbeelding, het verkrijgen van een 3D-overname. De 3D-motor fase zal deze afstand reizen over de baarmoeder in een reeks van stappen of frames, met de bedoeling in geheel vastleggen wat de onderzoeker verlangens.
  3. Bevestigen dat de beoogde structuren volledig worden vastgelegd in het 3D-scannen voordat het real-time echografie gedeelte is voltooid. Bewaar deze 3D-gegevens voor post-processing op een later tijdstip. De totale tijd voor 2D en 3D-echografie acquisitie is ongeveer 10-20 minuten wanneer uitgevoerd door een ervaren gebruiker.

7. 3D-reconstructie post-processing (figuur 2)

  1. de gewenste gegevens voor 3D-beeldverwerking laden.
  2. Kiezen " parallelle en roterende methode ", die alle frames van de 3D-afbeelding wordt geladen in een 3-D " vak " dat de gebruiker vervolgens het gewenste object in, frame-voor-frame zal traceren. Kies stap grootte van 0,08 mL. Beginnen aan de ene kant van het blok van de afbeelding en blader door vertrouwd maken met de beelden die zijn vastgelegd binnen ruimte.
    1. Start aan het ene uiteinde van de afbeelding en handmatig trace de omtrek van het object.
    2. Ga naar de volgende segment van 2D-afbeelding of " frame " en handmatig de omtrek van het object traceren.
    3. Herhaal deze procedure totdat alle frames handmatig geannoteerd/opgespoord door de gebruiker zijn.
    4. Klik op " afwerking " te verkrijgen van de 3D-afbeelding en het totale volume berekeningen.
  3. Kiezen tussen Maas en solide overlay, die een pijl in de linker bovenhoek.
  4. Wilt behouden of verwijderen van de omliggende echografie beeldinformatie voor duidelijkheid. Elk 3D-reconstructie duurt tussen 10 en 20 min.

8. Post procedurele zorg

  1. wanneer de echografie voltooid is, uitschakelen van het gas van de verdoving, verwijder de muis uit het platform en veeg voorzichtig schoon en elke ultrageluid-gel uit het dier persoon wegwassen.
  2. Plaatst u de muisaanwijzer weer in de kooi in een liggend in een gevuld gebied. Volgen totdat het dier wakker en ontroerend spontaan is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals aangetoond in Figuur 1, kan de hoge frequentie echografie detecteren implantatie site ontwikkeling beginnen zo vroeg als de 5.5 tijdstip van d.p.c. Met behulp van de lichtere hyperechoic kunt decidualized endometrium als een marker van implantatie sites op 6.5 d.p.c het aantal implantatie sites en afstand van deze sites worden gekwantificeerd. Als de zwangerschap zijn vordert 7,5 d.p.c., donkerder hypoechoic zwangerschapsduur OSS en foetale paal ook gem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze roman gebruik van 3D-HFUS imaging bewijst de mogelijkheid met succes kunt ontdekken, visualiseren en karakteriseren van embryo-implantatie sites tijdens de vroege lymfkliertest zwangerschap in een niet-invasieve wijze. De technologie biedt een significante verbetering over huidige methodes, die afhankelijk zijn van de onderbreking van de zwangerschappen voor grove weefsels en histopathologische karakterisering. Echter moet worden opgemerkt dat histologische methoden zou nog steeds worden beschouwd als meer optimale ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn erg blij met de hulp van Rong Zhao en Jie Li Yan Ying.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/MachineVisualSonics, inc.VS-11945
Vevo Imaging StationVisualSonics, inc.SA-11982
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission GelParker#SKU PLI 01-08
Isoflurane (IsoThesia) 100mL flesHenry Shein#29404
PuraLubenAnimal OogzalfDechra#12920060

Referenties

  1. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  2. Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
  3. Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
  4. Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
  5. Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
  6. Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897(2015).
  7. Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364(2012).
  8. Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
  9. Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
  10. Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
  11. Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
  12. Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205(2013).
  13. Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38(2014).
  14. Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
  15. Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97(2015).
  16. Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
  17. Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
  18. Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312(2017).
  19. Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
  20. Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500(2012).
  21. Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171(2016).
  22. Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
  23. Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
  24. Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
  25. Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
  26. Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
  27. Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Driedimensionale reconstructiemuiszwangerschapembryo implantatiein vivo imagingmeting van de vruchtzakmonitoring van de hartactiviteitmesh solid overlaypositionering van de transducer probeechogel

Gerelateerde artikelen