Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Xiangduo Kong; Gladys M.S. Cruz; Bárbara A. Silva; Nicole M. Wakida; Nima Khatibzadeh; Michael W. Berns; Kyoko Yokomori

doi:10.3791/56213

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

9.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56213

⸱

31 januari 2018

Xiangduo Kong^*¹ , Gladys M.S. Cruz^*² , Bárbara A. Silva² , Nicole M. Wakida² , Nima Khatibzadeh² , Michael W. Berns²^,³^,⁴ , Kyoko Yokomori¹

¹Department of Biological Chemistry, School of Medicine, University of California, Irvine, ²Beckman Laser Institute and Medical Clinic, University of California, Irvine, ³Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, ⁴Department of Biomedical Engineering and Surgery, University of California, Irvine

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Samenvatting

DNA-beschadigingen induceert specifieke signalering en reparatie reacties in de cel, die is van cruciaal belang voor de bescherming van de integriteit van het genoom. Laser microirradiation werd een waardevol experimentele instrument te onderzoeken de DNA schade reactie (DDR) in vivo. Hierdoor real-time hoge resolutie eencellige analyse van macromoleculaire dynamiek in reactie op laser-veroorzaakte schade beperkt tot een submicrometer regio in de celkern. Verschillende laser omstandigheden zijn echter gebruikt zonder waardering van verschillen in de soorten schade veroorzaakte. Dientengevolge, de aard van de schade is vaak niet goed gekenmerkt of gecontroleerd, waardoor de schijnbare tegenstrijdigheden in de aanwerving of wijziging profielen. We toonden aan dat verschillende bestraling voorwaarden (d.w.z., verschillende golflengten evenals verschillende input bevoegdheden (irradiances) van een femtoseconde (fs) nabij-infrarood (NIR) laser) proteïne assembly's van verschillende DDR en reparatie geïnduceerde. Dit weerspiegelt het soort DNA schade geproduceerd. Dit protocol beschrijft hoe titratie van laser ingangsvermogen toestaat inductie van verschillende hoeveelheden en complexiteit van de DNA-beschadiging, die gemakkelijk kan worden gecontroleerd door detectie van base en crosslinking schade, differentiële poly (ADP-ribose) (PAR) signalering, en traject-specifieke reparatie factor assemblages op schade sites. Nadat de schade-voorwaarden zijn vastgesteld, is het mogelijk om te onderzoeken van de effecten van verschillende schade complexiteit en differentiële schade signalering en uitputting van de upstream factor(en) op enige factor van belang.

Inleiding

In Vivo DNA schade signalering is niet goed begrepen
In vivo, is DNA complexvorm met histonen en andere factoren aan formulier chromatine vezels. Regulering van de structuur van de chromatine is van het allergrootste belang voor DNA-metabolisme. Bijvoorbeeld, is de Histon variant H2AX phosphorylated door Ataxie Teleangiëctasie gemuteerd (ATM) en andere kinases volgende dubbel-strand (DSB) inductie breekt, en is belangrijk voor DSB schade signaal versterking, alsmede het verstrekken van een docking site voor andere factoren. Verspreiding van schade signalering en reparatie traject keuze lijken te kritisch worden beïnvloed door loka....