Method Article

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

DOI:

10.3791/56214

⸱

August 9th, 2017

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangeboren oog- en craniofaciale afwijkingen weerspiegelen verstoringen in de neurale crest, een voorbijgaande bevolking van trekkende stamcellen die aanleiding tot talrijke celtypes in het lichaam geven. Inzicht in de biologie van de neurale crest is beperkt, als gevolg van een gebrek aan genetisch hanteerbare modellen die bestudeerd in vivo worden kunnen en in real-time. Zebravis is een bijzonder belangrijk developmental model voor het bestuderen van de trekkende cel populaties, zoals de neurale crest. Onderzoek naar neurale crest migratie naar het derde oog, werd een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie uitgevoerd om vast te leggen met een hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time video's van het derde oog in transgene zebrafish embryo's, namelijk GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP), zoals sox10 en foxd3 zijn aangetoond in talloze dierlijke modellen om te reguleren van vroege crest van de neurale differentiatie en waarschijnlijk vertegenwoordigen markers voor neurale kamcellen. Multi foton time-lapse imaging werd gebruikt om te onderscheiden van het gedrag en de migratiepatronen van twee neurale crest cel populaties bij te dragen tot de vroege ontwikkeling van het oog. Dit protocol biedt informatie voor het genereren van time-lapse video's tijdens de zebravis neurale crest migratie als een voorbeeld, en verder kan worden toegepast om te visualiseren van de vroege ontwikkeling van vele structuren in de zebravis en andere modelorganismen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erfelijke oogziekten jeugd blindheid kunnen veroorzaken en zijn vaak te wijten aan afwijkingen van de craniale neurale crest. Neurale kamcellen zijn voorbijgaande stamcellen die voortvloeien uit de neurale buis en vormen van talrijke weefsels in het lichaam. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 neurale kamcellen, afgeleid van het prosencephalon en mesencephalon, aanleiding geven tot de botten en het kraakbeen van de midface en frontale regio's, en de iris, hoornvlies trabecular gevlochten en sclera in het anterieure segment van het oog. 4 , 6 , 7 , 8 neurale kamcellen uit de rhombencephalon vorm die de faryngaal bogen, kaak en cardiale uitstroom tractus. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studies hebben gewezen op de bijdrage van de neurale crest aan oogbeschadigingen en/of en periocular ontwikkelen, wijzend op het belang van deze cellen in gewervelde oog ontwikkeling. Immers, verstoring van neurale crest cel migratie en differentiatie leiden tot craniofaciale en oogbeschadigingen en/of afwijkingen zoals waargenomen in Axenfeld-Rieger syndroom en Peters Plus syndroom. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 zo een grondig inzicht in de migratie, de proliferatie en differentiatie van deze neurale kamcellen geven inzicht in de complexiteit ten grondslag liggen aan erfelijke oogziekten.

De zebravis is een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van oogbeschadigingen en/of ontwikkeling, zoals de structuren van de zebravis oog vergelijkbaar met hun tegenhangers van zoogdieren zijn, en vele genen zijn evolutionair bewaard tussen zebravis en zoogdieren. 18 , 19 , 20 voorts zebrafish embryo's zijn transparant en een zoutwatervis, vergemakkelijkt de visualisatie van oog ontwikkeling in real-time.

Uitbreiding op de eerder gepubliceerde werk,6,7,20 de trekkende patroon van neurale kamcellen werd beschreven met behulp van meerdere foton fluorescentie time-lapse imaging op transgene zebrafish lijnen gemarkeerd met groen fluorescente proteïne (GFP) onder de Transcriptionele controle van het SRY (seks-bepalen regio Y)-vak 10 (sox10) of Forkhead vak D3 (foxd3) gen regelgevende regio's. 21 , 22 , 23 , 24. multi photon fluorescentie time-lapse imaging is een krachtige techniek die combineert de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie om hoge resolutie, drie-dimensionale beelden van specimens gelabeld met fluorophores te vangen. 25 , 26 , 27 het gebruik van de multi photon laser heeft duidelijke voordelen boven standaard confocale microscopie, waaronder verhoogde weefsel penetratie en verminderde fluorophore bleken.

Met behulp van deze methode, waren twee verschillende populaties van neurale kamcellen variërend in timing van de migratie en migratiestromen trajecten gediscrimineerde, namelijk foxd3-positieve neurale kamcellen in de periocular mesenchym en het derde oog- en sox10-positieve neurale kamcellen in de craniofaciale mesenchym. Met deze methode wordt een benadering van de migratie van oculaire en craniofaciale neurale crest migratie in zebrafish visualiseren ingevoerd, waardoor het gemakkelijk is om te observeren gereglementeerde neurale crest migratie in real-time tijdens de ontwikkeling.

Dit protocol biedt informatie voor het genereren van time-lapse video's tijdens de vroege ontwikkeling van de oog in GS (sox10:EGFP) en de transgene zebrafish GS (foxd3:GFP), als voorbeeld. Dit protocol kan verder worden toegepast voor de hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time visualisatie van de vroege ontwikkeling van een structuur van het oogbeschadigingen en/of en craniofaciale afgeleid van neurale kamcellen in zebrafish. Bovendien kan deze methode verder worden toegepast voor de visualisatie van de ontwikkeling van andere weefsels en organen in de zebravis en andere diermodellen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de humane behandeling van laboratoriumdieren die zijn vastgesteld door het University of Michigan Committee on the Use and Care of Animals (UCUCA).

1. Embryo Collectie voor Time-lapse Beeldvorming

  1. Tussen 15:00 en 21:00 uur, zet mannelijke en vrouwelijke volwassen Tg(sox10:EGFP) of Tg(foxd3:GFP) transgene zebravissen in een verdeelde kweektank voor paarsgewijze paring.
    OPMERKING: De Tg(sox10:EGFP) en Tg(foxd3:GFP) vissen, vriendelijk geschonken door Thomas Schilling en Mary Halloran, respectievelijk, werden gekruist in de Casper (roy -/-, nacre -/-) achtergrond om auto-fluorescentie en interferentie met pigmentatie te verminderen.
    1. Assembleer de kweektank (gegroefde binnentank + massieve buitentank) en vul deze met omgekeerd osmose (RO) systeem water.
    2. Breng maximaal 3 vrouwtjes en 3 mannetjes over in tegenoverliggende kanten van de tank gescheiden door een scheidingswand; maximaal 6 vissen kunnen paarsgewijs worden gekweekt in een enkele kweektank.
    3. De volgende ochtend, verwijder de scheidingswand kort nadat de lichten in het vivarium zijn ingeschakeld.
      OPMERKING: In de huidige studie zijn de lichten aan op een cyclus van 14 uur licht (aan om 9:00 uur) en 10 uur donker (uit om 23:00 uur).
    4. Sta 20 minuten ongestoorde paring toe of totdat voldoende aantallen embryo's zijn geproduceerd; de embryo's zullen zich aan de onderkant van de kweektank bevinden. Wanneer eieren worden waargenomen, til de gegroefde binnentank samen met de vissen op en plaats ze (vissen en binnentank) snel in een schone massieve buitentank gevuld met RO-water.
  2. Bereid standaard 1X embryo medium voor door per 1 L RO-water het volgende toe te voegen: 0,287 g (4,9 mM) NaCl, 0,127 g (0,17 mM) KCl, 0,048 g (0,33 mM) CaCl2.2H2O, 0,04 g (0,33 mM) MgSO4 (watervrij). Roer de oplossing tot de zouten volledig zijn opgelost.
    1. Voeg 100 µL van 0,1% methyleenblauw toe als fungicide. Voeg 0,25 g natriumbicarbonaat toe om de pH op 7,75 aan te passen. Bewaar het medium bij kamertemperatuur.
  3. Verzamel eieren uit de buitentank met behulp van een eierverzamelscherm en breng de eieren over naar petrischalen (~50 embryo's per schotel) met 30 mL 1X embryo medium. Bewaar de verzamelde eieren bij 28,5 °C.
  4. Embryo voorbereiding
    1. Tg(sox10:EGFP) embryo's.
      1. Voor Tg(sox10:EGFP) embryo's, verwijder bij 12 uur post-fertilisatie (hpf) de dode eieren en beoordeel de ontwikkelingsfase van de embryo's. Selecteer GFP-positieve embryo's met behulp van een disserterende fluorescente stereomicroscoop met een standaard 460-490 nm bandpass excitatiefilter. Verwijder met behulp van een pincet de chorion uit 3-4 embryo's die GFP uitdrukken, en breng deze embryo's over naar een aparte petrischaal met 30 mL vers 1X embryo medium.
    2. Tg(foxd3:GFP) embryo's.
      1. Voor Tg(foxd3:GFP) embryo's, verwijder bij 22-24 hpf de dode eieren en beoordeel de ontwikkelingsfase van de embryo's. Selecteer positieve embryo's met behulp van een disserterende fluorescente stereomicroscoop met een standaard 460-490 nm bandpass excitatiefilter. Verwijder met behulp van een pincet het chorion uit 3-4 embryo's die GFP uitdrukken.
      2. Bereid 1000X Fenylthioureum (PTU) stamoplossing door 0,75 g (3%) PTU op te lossen in 25 mL Dimethylsulfoxide (DMSO). Verdeel de stamoplossing in porties en bewaar deze bij 4 °C. Voeg 30 µL van 1000X PTU (3%) stamoplossing toe aan 30 mL 1X embryo medium om een 0,003% PTU oplossing te genereren.
      3. Plaats de gescreende en gedechorioneerde GFP-positieve embryo's in een 0,003% PTU oplossing om pigmentatie te remmen. Begin de behandeling van de embryo's met PTU niet eerder dan 20 hpf, omdat vroege behandeling (bij < 20 hpf) nadelige effecten kan hebben op de ontwikkeling van de neurale crest en het neuroepitheel.28
    3. Voordat het time-lapse experiment wordt uitgevoerd, bewaak de embryo's door live imaging met behulp van een standaard stereomicroscoop met intervallen van 12-24 uur in leeftijdsgematchte vergelijkingen als controle voor temperatuurdrift.

2. Montage van Embryo voor Time-lapse Beeldvorming

  1. Voorbereiding van time-lapse embryo medium
    1. Bereid een standaard 0,4% tricaine stamoplossing door 0,004 g tricaine toe te voegen aan 100 mL RO-water. Verdeel (~1 mL) de stamoplossing in verse 1,5-mL centrifugeerbuisjes en bewaar bij -20 °C.
    2. Bereid time-lapse embryo medium (50 mL 1X embryo medium, 0,016% tricaine) door 2 mL 0,4% tricaine oplossing toe te voegen aan 48 mL 1X embryo medium. Als er gebruik wordt gemaakt van embryo's >22 hpf, voeg dan ook 50 µL 3% PTU stamoplossing toe aan het embryo medium (eindconcentratie 0,003% PTU).
  2. <

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi foton fluorescentie time-lapse imaging gegenereerd een aantal video's dat geopenbaard de migratiepatronen van craniale neurale kamcellen die aanleiding tot de craniofaciale structuren en anterieure segment van het oog in de GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish lijnen geven. Als voorbeeld migreren sox10 -positieve neurale kamcellen tussen 12 en 30 hpf vanaf de rand van de neurale buis in de craniofaciale regio (Video 1,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi foton time-lapse imaging kunt het volgen in vivo van voorbijgaande aard en trekvogels cel populaties. Deze krachtige techniek kan worden gebruikt om embryonale processen in real-time te bestuderen, en in de huidige studie, de resultaten van deze methode de huidige kennis van neurale crest cel migratie en ontwikkeling verbeterd. Eerdere time-lapse imaging studies gebruiken meestal confocale laser scanning microscopie. 29 , 30 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd financieel ondersteund door middel van subsidies uit het nationale Instituut van het oog van het National Institutes of Health (K08EY022912-01) en de visie onderzoek kern (P30 EY007003).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Thomas Schilling voor het vriendelijk gifting de GS (sox10:eGFP)-fish and Mary Halloran voor het vriendelijk gifting de vis GS(foxd3:GFP) .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Breeding Tanks with DividersAquaneeringZHCT100Kruising Tank Set (1.0-liter) Helder Polycarbonaat met Deksel en Inzet
M205 FA Combi-ScopeLeica Microsystems CMS GmbHStereofluorescentie Microscoop - FusionOptics en TripleBeam
Sodium ChlorideMillipore (EMD)7760-5KGDubbel PE zak. CAS Nr. 7647-14-5, EC Nummer 231-598-3
Potassium ChlorideMillipore (EMD)1049380500Kaliumchloride 99.999 Suprapur. CAS Nr. 7447-40-7, EC Nummer 231-211-8.
Calcium Chloride DihydrateFisher ScientificC79-500Poly fles; 500 g. CAS Nr. 10035-04-8
Magnesium Sulfate (Anhydrous)Millipore (EMD)MX0075-1Poly fles; 500 g. CAS Nr. 7487-88-9, EC Nummer 231-298-2
Methylene BlueMillipore (EMD)284-12Glasmaatje; 25 g. Poeder, Gecertificeerde Biologische Kleurstof
Sodium BicarbonateMillipore (EMD)SX0320-1Poly fles; 500 g. Poeder, GR ACS. CAS Nr. 144-55-8, EC Nummer 205-633-8
N-PhenylthioureaSigmaP7629-25G>98%. CAS Nummer 103-85-5, EC Nummer 203-151-2
DimethylsulfoxideSigmaD8418-500MLMoleculair Biologie kwaliteit. CAS Nummer 67-68-5, EC Nummer 200-664-3
Tricaine MethanesulfonateWestern Chemical Inc.MS222Tricaine-S
Low-Melt AgaroseISC BioexpressE-3112-25GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g
Open Bath ChamberWarner InstrumentsRC-40HPHigh Profile
Glass CoverslipsFisher Scientific12-545-102Cirkel dekglas. 25 mm diameter
High Vacuum GreaseFisher Scientific14-635-5C2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION
1658832
Quick Exchange PlatformWarner InstrumentsQE-135 mm
Stage AdapterWarner InstrumentsSA-20LZ-AL16.5 x 10 cm
TC SP5 MP multi-photon microscopeLeica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire LaserSpectraPhysics
Laser Safety BoxLeica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  SoftwareLeica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 SoftwareAdobe
iMovie Version 10.1.4 SoftwareApple

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
  2. Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
  3. Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
  4. Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
  5. Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
  6. Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
  7. Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
  8. Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
  9. Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
  10. Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
  11. Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984(2010).
  12. Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
  13. Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
  14. Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
  15. Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
  16. Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
  17. Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
  18. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  19. Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
  20. Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
  21. Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
  22. Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
  23. Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
  24. Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
  25. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  27. Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  28. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991(2011).
  29. Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525(2013).
  30. Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
  31. McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  32. Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Photon ImagingTime Lapse MicroscopyNeural Crest CellsZebrafish EmbryosSox10 EGFPFoxd3 GFPLaser Scanning MicroscopyFluorescence ImagingEmbryo MountingZ Stack Acquisition

Related Articles