Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

Samenvatting

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Samenvatting

Chemotaxis is migratie langs een specifieke chemische kleurovergang¹. Chemokines zijn Chemotactische cytokines die bevordering van cellulaire mensenhandel met anatomische en temporele specificiteit². Chemotaxis is een kritische functie van lymfocyten en andere immune cellen die kwantitatief kunnen worden beoordeeld in vitro. Dit manuscript worden methoden beschreven die de evaluatie van de chemotaxis, zowel in vitro en in vivo, voor diverse celtypen, met inbegrip van de cellijnen en inheemse cellen. De in vitro, plaat gebaseerde indeling toelaat de vergelijking van verschillende voorwaarden gelijktijdig in real-time, en kan worden afgerond binnen 1-4 h. In vitro assay voorwaarden kunnen worden gemanipuleerd om het introduceren van agonisten en antagonisten, als goed als onderscheiden chemotaxis van chemokinesis, die willekeurige beweging is. Voor in vivo mensenhandel evaluaties, kunnen immuuncellen worden aangeduid met meerdere fluorescente kleurstoffen en gebruikt voor de overdracht van de adoptie. De differentiële etikettering van cellen zorgt voor gemengde cel populaties worden ingevoerd in hetzelfde dier, daardoor dalende afwijking en de vermindering van het aantal dieren dat nodig is voor een adequaat aangedreven experiment. Migratie naar lymfoïde weefsel optreedt in zo weinig als 1 h en meerdere compartimenten van het weefsel kunnen worden bemonsterd. Stroom cytometry weefsel oogst na zorgt voor een snelle en kwantitatieve analyse van de migratiepatronen van meerdere celtypen.

Inleiding

Robuuste immuniteit vereist de complexe temporele en ruimtelijke coördinatie van een groot aantal celtypes om te reageren op verwonding, besmetting en genereren van self-tolerance. Verscheidene dozijn chemokine receptoren en hun overeenkomstige liganden zijn geconstateerd; gekarakteriseerd bieden moleculaire mechanismen door welke specifieke cellen in een specifieke weefsel kunnen worden gericht op een bepaald tijdstip. Studeren chemotaxis en migratie is dus een onmisbaar onderdeel van het onderzoek van de immunologie. Inderdaad, de beschreven in vitro -assay werd onlangs gebruikt als een instrument voor screening ter identificatie van een Chemotactische cofactor die chemotaxis van T-cellen naar C-C chemokines 19 en 21^{3 versnelt}. Het doel van de hier beschreven methoden zijn om vergunning van kwantitatieve analyses van immuun cel chemotaxis in vitro en in vivo.

De bepaling van de kamer Boyden (cel migratie en invasie) is een snelle, goedkope en reproduceerbare methode voor de beoordeling van de cel migratie^4,5. In de standaard assay, het Hogerhuis is bezaaid met cellen, en is gescheiden door een poreuze invoegen uit een tweede kamer, waarin de cellen migreren. Op het gewenste tijdstip, kunnen cellen die aan de onderkant van het donormateriaal hebt gemigreerd worden vastgesteld en gekleurd voor de kwantificatie van de lichte microscopie. Echter, dergelijke metingen beperken het verzamelen van gegevens naar een enkel eindpunt, die zich verzet tegen dynamische gegevensverzameling en uitgebreide optimalisatie om het optimale tijdstip voor analyse kunnen vereisen. Hier worden verschillende aanpassingen beschreven waarmee multiplexed, real-time en kwantitatieve metingen van chemotaxis in vitro.

Voor in vivo studies, een functionele eindpunt wordt gebruikt, namelijk de specifieke accumulatie van cellen in een bepaald weefsel compartiment. Vooraf gelabelde donor cellen worden in ontvangende dieren door middel van adoptie overdracht binnengebracht. Deze cellen van de donor kunnen vervolgens worden geïdentificeerd door stroom cytometry na de oogst van de ontvangende weefsel. Ook gepresenteerd is een co labeling strategie die het mogelijk voor de bepaling maakt van de handel in verschillende soorten cellen binnen een enkele begunstigde dier. Deze methode elimineert de dieren variatie van cel injectie, en rekeningen voor fysiologische spreiding over de dieren.

Protocol

alle procedures werden goedgekeurd door Rockefeller University ' s institutionele Animal Care en gebruik Comité. Alle dieren waren ondergebracht onder de voorwaarden van specifieke pathogenen vrije.

1. In Vitro Chemotaxis

1. cultuur THP-1 cellen ⁶ in Roswell Park Memorial Instituut 1640 (RPMI 1640) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic zuur (HEPES; 25 mM) (compleet media), handhaven van de dichtheid tussen 0,5-1,0 x 10 ⁶ cellen/mL.
2. In een 35 mm celkweek schotel, label 3.5 x 10 ⁵ THP-1 cellen per voorwaarde met calceïne acetoxymethyl (calceïne-AM; 2,5 µM) of andere geschikte fluorescente kleurstof in volledige media bij 37 ° C gedurende 30 minuten
   Opmerking: Kleurstoffen moeten celmembraan-permeabele en compatibel met live-cel labeling.
3. Pre warm een afleesapparaat tot 37 ° C.
   Opmerking: Naast/nacht temperatuurregeling bodem-lezing functionaliteit is ook vereist. Zie stap 1.10.2 naar een alternatief voor een afleesapparaat voor kwantificering van het migreren cellen.
4. Terwijl cellen zijn etikettering, bereiden de assay plaat en de tweede kamer.
   1. Gebruik een 24-well weefselkweek de plaat, met één voorwaarde per putje. Uitvoeren van elke voorwaarde in drievoud.
   2. Toevoegen 750 µL van Hank ' s Buffered zoutoplossing (HBSS) gebufferd met 25 mM HEPES en 0,1% bovien serumalbumine (BSA) naar de 24-well-plaat. Dit dient als de basale controle-voorwaarde.
      1. Gebruik andere putten voor Comparateur voorwaarden, altijd het onderhouden van het totale volume in de onderste kamer op 750 µL.
         Opmerking: In dit voorbeeld fungeert menselijke monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) als de positieve controle voor chemotaxis ⁷.
         1. Assemble het reagens mengsel door het combineren van HBSS met 25 mM HEPES, BSA (0,1%) en MCP-1 (75 ng/mL). Gebruik van volwassen runderserum (2,7% v / v) met MCP-1 als een extra positieve controle.
            Opmerking: Chemokine en chemokinereceptoren concentratie zal afhangen van de Chemotactische as bestudeerde. Gelyofiliseerd MCP-1 is geresuspendeerde in gedestilleerd water met BSA (0,1%) te maken van een stamoplossing waarvan een eindconcentratie van 50 μg/mL. Dit kan worden verdund in water om een werkoplossing van 10 μg/mL. 5.6 μL van deze oplossing toevoegen aan de tweede kamer.
   3. Nadat de samenstelling van de kamers van de bodem voltooid is, een poreuze invoegen in elk putje, ervoor te zorgen dat de tabs van het donormateriaal worden uitgelijnd met de inkepingen van de plaat plaatsen.
      Opmerking: Kies de juiste poriegrootte voor de inserts. Voor monocyten en lymfocyten presteert een poriegrootte van 3 μm goed. Sommige celtypen en/of chemokine systemen mogelijk een matrix-gecoate oppervlak voor optimale migratie. Bijvoorbeeld, voor het meten van THP-1 monocyt chemotaxis naar MCP-1, worden fibronectine of collageen beklede inserts aanbevolen. Afleesapparaat voor kwantificatie, het invoegen moet een licht-impermeant coating, zoals polyethyleentereftalaat, om te voorkomen dat de detectie van niet-migreren cellen in de bovenste kamer ⁸.
5. Na het broeden van cellen voor 30 min met calceïne-AM, overbrengen celsuspensie een conische tube van 15mL. Centrifuge cellen bij 1.000 x g gedurende 2 min. visueel inspecteren cellen om te bevestigen aanvaarding van calceïne-AM ( Figuur 1).
6. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof met behulp van een vacuüm aspirator. Wassen gelabelde cellen in serumvrij RPMI 1640 aangevuld met HEPES-25 mM. Centrifugeer cellen bij 1.000 x g gedurende 2 min en verwijder het supernatant.
7. Resuspendeer cellen in serumvrij RPMI 1640 aangevuld met HEPES-25 mM. Cellen tellen en het volume aanpassen, zodat de cellen op een eindconcentratie van 1.0-1.5 x 10 ⁶ cellen/mL.
8. 250 afzien μL van de celsuspensie in de insert (Hogerhuis).
9. Nadat alle bovenste holten zijn ingevuld, zachtjes de plaat op te heffen, en inspecteren de onderkant voor de aanwezigheid van luchtbellen die met migratie en opsporing interfereren kunnen. Als u wilt verwijderen een zeepbel, probeer eerst verwijderen vervolgens re-positionering het invoegen. Als dit niet lukt, kunt een 27 G naald punctie van de zeepbel en deze vervolgens opnieuw plaatsen de invoegen.
10. Plaats van de plaat in de voorverwarmde 37 ° C-afleesapparaat.
    1. Ophaal fluorescentie lezingen van de bodem met 1-3 min. intervallen. Bij het gebruik van calceïne-AM, vastgesteldop de fluorescentie excitatie en emissie golflengten 485 nm en 520 nm, respectievelijk. Afhankelijk van de cel type en chemokinereceptoren systeem chemotaxis treedt meestal op meer dan 1-4 h ( figuur 2A).
    2. Als alternatief voor continumetingen met behulp van een plaat-lezer, het beeld van de putjes met behulp van een omgekeerde fluorescente microscoop ( figuur 2B) staat van excitatie en opsporing van licht op 485 nm en 520 nm, respectievelijk. Gebruik een lage vergroting te vangen van de meerderheid van de onderkant van het donormateriaal. Kwantificeren van cellen door het verwerken van de beelden met ImageJ of soortgelijke software ⁹.

2. Adoptief Transfer van lymfkliertest lymfocyten

1. voorbereiding van donor cellen
   1. verdoving 8-12 weken-oude C57BL/6J mannelijke donor muizen met Isofluraan anesthesie (1-3%) met behulp van een vaporizer. Bevestigen van passende diepte van verdoving door teen-snuifje.
   2. Plaatst u de muisaanwijzer in de liggende positie. Maken met een scalpel een incisie van de middellijn en zoek de milt in het bovenste linker peritoneale ruimte. De hele milt accijnzen en leg in volledige media (RPMI aangevuld met 10% FBS en 25 mM HEPES; 1 mL/milt) op ijs. Narcose donordieren euthanaseren door onthoofding.
   3. Grind milt weefsel voorzichtig door 40 µm nylon gaas in volledige media (1 mL /spleen) met behulp van het einde van de zuiger van een injectiespuit te maken van een eencellige schorsing en overdracht aan een conische tube van 15 mL.
   4. Toevoegen 4 volumes van ammoniumchloride kalium (ACK) lysis buffer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur lyse van erytrocyten.
   5. Centrifugeren van de cellen bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en weggeworpen. Als erytrocyten in de pellet blijven, resuspendeer in ACK lysis-buffermengsel, Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeer cellen bij 1.000 x g gedurende 2 min en weggeworpen.
   6. Resuspendeer de cellen in de volledige media bij een concentratie van 2-5 x 10 ⁷ cellen/mL, dan stam van de celsuspensie via een 40 µm nylon gaas te verwijderen cel puin.
   7. Label 1 x 10 ⁷ cellen/ontvanger muis met een fluorescente kleurstof compatibel met levende cellen en dat blijft behouden op latere fixatie, zoals 5-chloromethylfluorescein DIACETAAT (eindconcentratie 2 μM) ¹⁰ . Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten
      Opmerking: Als u wilt bijhouden van meer dan één cel bevolking, gebruiken andere fluorescente kleurstoffen met extra-cel populaties. For example, een deel van de cellen van de donor kan worden aangeduid met 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoyl) amino) tetramethylrhodamine (eindconcentratie 2 μM) ¹¹.
   8. Toevoegen 4 volumes HBSS aangevuld met 25 mM HEPES en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 2 min en negeren supernatant. Resuspendeer de pellet in HBSS aangevuld met HEPES 25 mM tot een eindconcentratie van 1 x 10 ⁸ cellen/mL.
      1. Als u meer dan één fluorescente kleurstof, houden cel populaties gescheiden tot op het ogenblik injectie.
      2. Overbrengen van een kleine hoeveelheid (10 μL) van cellen van elke kleur naar een kleefpoeders oplossing (1 mL) voor latere cytometry stroomcompensatie.
2. Overdracht van lymfocyten
   1. verdoving 8-12 weken-oude C57BL/6J mannelijke ontvanger muizen met Isofluraan (1-3%) met behulp van een vaporizer; Bevestig diepte van verdoving door teen-snuifje. Veterinaire zalf toepassen dier ' s ogen om te voorkomen dat drogen.
   2. Kort vortex donor cellen (1 s) en transfer naar 1 mL injectiespuit met 27 G, 0,5 in naald, combineren van differentieel gelabelde cel populaties, indien van toepassing.
      1. Een kleine hoeveelheid (10 μL) van gemengde cellen overbrengen in een kleefpoeders oplossing (1 mL) voor latere stroom cytometry analyses.
   3. Donordieren in de vatbaar positie plaatsen. Milde caudal druk uitoefenen op de huid dorsale voor het oog, waardoor de oogbol naar iets uitsteken.
   4. Direct van de naald mediaal en injecteren 100 µL celsuspensie van donor retro-orbitally in elke ontvangende muis. Cellen kunnen ook worden geïnjecteerd via de staart ader.
   5. Geleidelijk trekt de injectie naald en plaatst van muis alleen in een kooi van herstel. Dier volgen totdat het heeft herwonnen bewustzijn; eenmaal volledig herstelde terugkeer het dier naar sociale huisvesting.
3. Verzamelen en analyseren
   1. na 1 h, anesthetize ontvangende muizen met Isofluraan anesthesie (1-3%) met behulp van een vaporizer; Bevestig diepte van verdoving door teen-snuifje. Oogst de milt (of ander weefsel van belang) (stap 2.1.2.) van elke geadresseerde muis en de plaats in volledige media (1 mL/ontvanger). Narcose dieren door onthoofding euthanaseren.
      Opmerking: Langere intervallen voorafgaand aan weefsel oogst zal toenemen weefsel accumulatie door middel van ten minste 24 h.
   2. Grind milt weefsel voorzichtig door 40 µm nylon gaas in volledige media met behulp van het einde van de zuiger van een injectiespuit een eencellige schorsing en overdracht maken met conische tube van 15 mL.
   3. Toevoegen 4 volumes van ACK lysis buffer en 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Centrifugeer de celsuspensie bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en weggeworpen.
   4. Resuspendeer cellen in kleuring buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing aangevuld met 1% FBS). Cellen tellen en aan te passen aan een eindconcentratie van 3 x 10 ⁷ cellen/mL. 100 µL celsuspensie overbrengen in een 96-Wells ronde bodemplaat.
   5. Vlek cellen voor gewenste markeringen (Zie de tabel van materialen) voor analyse door stroom cytometry. Fluorophore-geconjugeerde antilichamen (Zie de tabel van materialen) tegen de gewenste markeringen toevoegen en Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten in het donker. Voeg 100 µL kleuring buffer, centrifugeer cellen bij 1.000 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.
   6. Resuspendeer de pellet in 200 µL kleuring buffer, centrifugeer cellen bij 1.000 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.
   7. Resuspendeer de pellet in 125 µL kleuring buffer en het verwerven van de monsters met behulp van een cytometer van de stroom met behulp van standaardprocedures.
      Opmerking: De groene kleurstof is enthousiast over een 488 nm laser en de uitstoot wordt gedetecteerd met 505 en 530/30 dichroïde filters. De oranje kleurstof is opgewekt door een 561 nm en de uitstoot wordt gedetecteerd door een 582/15 dichroïde filter.
      1. Gebruik behoed cellen 2.1.8.2 om te compenseren voor elke fluorescente kleurstof.
         Opmerking: Gebruik kraal gebaseerde compensatie met fluorophores bijpassende de excitatie en emissie spectra van de labeling verfstoffen zal leiden tot suboptimaal compensatie.
      2. Kunt de opgeslagen invoercellen uit stap 2.2.2.1 nauwkeurig bepalen van de verhouding van differentieel invoercellen aangeduid als met behulp van meer dan één label bevolking ( Figuur 3). Berekenen van de specifieke migratie weefsel op basis van de verhouding van label naar labelloze cellen ( Figuur 4).

Resultaten

Bij het gebruik van calceïne-AM kleurstof, zal visueel onderzoek van de cellen bevestigen label opname (Figuur 1). Geautomatiseerde fluorescerende lezingen houdt migratie als de overdracht van de cellen op de onderkant van het donormateriaal na verloop van tijd. Deze gegevens tonen duidelijk een inductie van cel migratie naar MCP-1, evenals een vergroting van deze reactie door serum (figuur 2A). Afhankelijk van de sterkte van de ...

Discussie

Kwantificering van immuun cel migratie kan worden bereikt met behulp van eenvoudige en snelle testen zowel in vitro als in vivo. We tonen de chemotaxis in vitro van menselijke monocyten in reactie op een MCP-1 verloop en vergroting door serum. In vivo, donor lymfkliertest splenocytes differentieel waren gelabeld en na de overdracht van het adoptie, werden teruggevonden van geadresseerden dieren.

Het gebruik van een afleesapparaat heeft het voordeel van de ve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Cell culture flask	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
Cell culture dish	Corning	1007
24 well plate	Corning	353504
Fluoroblok Fibronectin Insert	Corning	CB354597
15 mL conical tube	Corning	352097
Bovine Serum Albumin	Cell Signaling Technology	9998S
Human Recombinant MCP-1	Peprotech	300-04
Adult bovine Serum	Sigma	B9433
HBSS with calcium and magnesium; no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e plate reader	Molecular Devices
Olympus IX71 inverted fluorescence microscope	Olympus
Isothesia	Henry Schein animal health	11695-6776-2	Isofluorane anesthesia
Cell strainer 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CellTracker Orange CMTMR Dye	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitation: 541nm, Emission: 565nm
CellTracker Green CMFDA Dye	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitation: 485nm, Emission: 520nm
5ml syringe	BD Syringe	309646
1ml TB syringe	BD Syringe	309625
THP-1 cell line	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100228	Excitation: 405nm, Emission: 421nm
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody	Biolegend	115540	Excitation: 405nm, Emission: 603nm
96-well round bottom plate	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences		Flow cytometer