Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56237

⸱

23 oktober 2017

 , 
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Myelinating oligodendrocyten bevorderen snelle actiepotentiaal propagatie en neuronale overleving. Hier beschreven is een protocol voor Oligodendrocyt-specifieke expressie van fluorescente proteïnen in organotypic hersenen segmenten met latere time-lapse beeldvorming. Verder is wordt een eenvoudige procedure voor het visualiseren van onbevlekt myeline gepresenteerd.

Samenvatting

Neuronen zijn, is afhankelijk van de elektrische isolatie en trofische steun van myelinating oligodendrocyten. Ondanks het belang van de oligodendrocyten, zijn de geavanceerde hulpmiddelen die momenteel gebruikt voor het bestuderen van neuronen, slechts gedeeltelijk gezet op door Oligodendrocyt onderzoekers. Cel type-specifieke kleuring door virale transductie is handig om te studeren live organel dynamiek. Dit witboek beschrijft een protocol voor het visualiseren van Oligodendrocyt mitochondriën in organotypic hersenen plakjes door transductie met adeno-associated virus (AAV) uitvoering van genen voor mitochondriale gerichte fluorescerende eiwitten onder de Transcriptionele controle van de myeline fundamentele eiwit promotor. Het bevat het protocol voor het maken van organotypic coronale muis hersenen segmenten. Een procedure voor time-lapse beeldvorming van mitochondriën dan volgt. Deze methoden kunnen worden overgedragen aan andere organellen en kunnen bijzonder nuttig zijn voor de studie van de organellen in de myelineschede. Ten slotte, beschrijven we een gemakkelijk beschikbare techniek voor visualisatie van onbevlekt myeline in levende segmenten door reflectie van de Confocal Microscopie (CoRe). Kern vereist geen extra apparatuur en nuttig kan zijn voor het identificeren van de myelineschede tijdens live imaging.

Inleiding

Van de hersenen witte stof bestaat uit zenuwcel axonen verpakt in myeline, een gespecialiseerde uitgebreide plasmamembraan gevormd door oligodendrocyten. Myeline is vereist voor snelle en betrouwbare actiepotentiaal propagatie en voortbestaan van myelinated axonen, en een verlies van myeline neurologische stoornissen kan veroorzaken. Ondanks hun belang, worden de eigenschappen van de oligodendrocyten minder gekend vergeleken met neuronen en astrocyten. Bijgevolg zijn minder gereedschappen ontwikkeld voor het bestuderen van de oligodendrocyten.

Live beeldvorming van cel organellen, zoals mitochondriën, endoplasmatic reticulum (ER) of verschillende vesiculaire structuren kunnen nuttig zijn te onderzoeken van dynamische veranderingen in de organellen na verloop van tijd. Beeldvorming van levende oligodendrocyten is traditioneel, uitgevoerd in monoculturen1,2. Echter oligodendrocyten in monocultuur compacte myeline niet weergegeven, en organotypic of acute hersenen segmenten, dus wellicht een betere optie bij de studie van de lokalisatie en verkeer van organellen. Lokalisatie van kleine organellen en eiwitten in de myelineschede kan worden uitdagend vanwege de korte afstand tussen de myelinated axon en de omliggende myelineschede. Licht microscopische immunokleuring procedures alleen hoeft dus niet de ruimtelijke resolutie te discrimineren tussen organellen in de myelineschede en die in de myelinated axon. Dit kan worden opgelost door virale transductie met genen voor organel-gerichte fluorescente proteïnen gedreven door cel type-specifieke initiatiefnemers. De voordelen zijn een schaars en cel-specifieke expressie, waardoor accurate beoordeling van organel lokalisatie en dynamiek. Transgene dieren kunnen ook worden gebruikt om dergelijke een organel-gerichte cel-specifieke expression3. Echter, de productie en het onderhoud van transgene dieren is duur en bieden meestal niet de schaars expressie die kan worden bereikt door virale methoden.

De beschreven methode gebruikt hier virale transductie van oligodendrocyten met fluorescerende eiwitten mitochondriaal-gerichte (dsred of groen fluorescent protein, GFP) gedreven door de promotor van myeline basic protein (MBP-mito-dsred of MBP-mito-GFP) te visualiseren Oligodendrocyt mitochondriën in organotypic hersenen plakjes. Bovendien wordt expressie van een ander fluorescent proteïne in het cytoplasma (GFP gebruikt in combinatie met mito-dsred of tdtomato gebruikt met mito-GFP) gebruikt om de visualisatie van de morfologie van de cel, met inbegrip van de cytoplasmatische compartimenten van de myelineschede. Het protocol bevat de procedure voor het maken van organotypic hersenen segmenten (een gemodificeerde versie van het protocol beschreven door De Simoni en Yu, 20064,5). Vervolgens beschrijven we de time-lapse imaging procedure voor het bestuderen van mitochondriale beweging. Deze procedure maakt gebruik van een rechtop confocal microscoop met een voortdurende uitwisseling van imaging medium, een setup waarmee de gemakkelijke toepassing van drugs of andere middellange wijzigingen tijdens imaging. De time-lapse imaging procedure kan worden uitgevoerd op elke confocal microscoop, met wat extra apparatuur voor het behoud van levende segmenten zoals hieronder beschreven. Het protocol bevat ook verschillende tips om optimaliseren van beeldvorming en verminderen van fototoxiciteit.

Tot slot, een snelle en eenvoudige manier om te visualiseren onbevlekt myeline door reflectie van de Confocal Microscopie (CoRe) wordt beschreven. Dit kan zinvol zijn om te identificeren van de myelineschede tijdens live imaging. In de afgelopen jaren verschillende technieken zijn ontwikkeld om de afbeelding myeline zonder enige kleuring vereist, maar de meeste van deze vereisen specifieke apparatuur en expertise6,7,-8. De hier beschreven procedure maakt gebruik van de reflectie-eigenschappen van de myelineschede en is een vereenvoudigde single-excitatie golflengte versie van de reflectiecoëfficiënt van spectrale Confocal Microscopie (SCoRe, waarin verschillende golflengten laser worden gecombineerd om te visualiseren van myeline) 9. kern kan gebeuren op elke confocal microscoop met een 488 nm laser en een 470-500 nm bandpass emissie filter of een afstembare emissie-filter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

de procedures die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Noorse dier onderzoek autoriteit. Leveranciers en catalogus nummers voor de verbruiksartikelen en andere vereiste uitrusting zijn beschikbaar in de lijst van de materialen aan het einde van het document.

1. voorbereiding van de segmenten van de Organotypic

Opmerking: dit recept maakt gebruik van twee muis pups op postnatale dag 7-9 (p7-9), die de opbrengst van 24 organotypic segmenten verdeeld over twee zes-well cultuur gerechten. Tenzij anders vermeld, alle procedures moeten gebeuren in een steriele kap en Nitriel of latex handschoenen moeten worden gebruikt. Alleen cel cultuur grade ingrediënten moeten worden gebruikt.

  1. Autoclaaf flessen, dissectie tools (1 grote schaar, 1 kleine schaar, 1 grote platte spatel, 1 kleine afgeronde en scherp spatel en 1 pincet, zie materialen lijst voor details), glas pipettes, pipet tips en weefsel doekjes gebruikt voor de bereiding van segment.
  2. Als de helft van de pipetten van glas moet worden gebruikt met de grote opening, het afbreken van het smalle einde.
    1. Score met een diamant scriber pen (indien beschikbaar) rond de pipet net onder het punt waar het glas vernauwing begint. Plaats dan het puntige einde van de pipet in een nitril handschoen of soortgelijke. De tip zorgvuldig afbreken door het buigen van de pipet terwijl het duwen tegen een bank werk.
    2. Dan botte het gebroken einde door het wrijven over een stukje schuurpapier of iets smelten op een bunsenbrander. De gebroken pipetten gewend bent gesneden hersenen segmenten Pipetteer met behulp van het gebroken einde omgezet in de rubber-lamp en de grote open einde aanraken van de oplossing/segmenten.
      Opmerking: Dit wordt niet gedaan in een steriele kap en enkele dagen vooraf kan gebeuren.
  3. Cultuur gerechten bereiden.
    Opmerking: Dit kan worden gedaan de dag vóór het snijden of ten minste 2 uur voor het snijden.
    1. Steriliseren polytetrafluorethyleen (PTFE) membranen (" confetti "). Gebruik twee steriel pincet te verwijderen enkele confetti uit de omringende blauwe plastic stukken en steriliseren door dompelen tweemaal in een petrischaal met 96% ethanol (EtOH). Dan lag confetti plat in een steriele grote petrischaal drogen.
      Opmerking: De confetti zijn hydrofiel PTFE membranen vergelijkbaar met de membranen in de cultuur-inserts. Het gebruik van confetti helpt de levende imaging omdat enkele segmenten kunnen gemakkelijk worden overgedragen van de invoegen aan de opstelling van de Microscoop door het opheffen van de confetti met een tang (zie 4.8. voor meer informatie). Alternatief, kunnen de hersenen segmenten worden gekweekt zonder de confetti (waarin de segmenten zal hechten rechtstreeks aan het membraan van de cultuur-insert). In dit geval het invoegen van het membraan moet worden verminderd met een scalpel overbrengen van het segment naar de Microscoop bad.
    2. Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem (recept laboratoriumreagentia ' tabel) aan elk putje van de zes-well cultuur gerechten.
    3. Plaats één cultuur invoegen in elk putje met steriel pincet. Vermijden van luchtbellen tussen het invoegen en het kweekmedium.
      Opmerking: Als u wilt sparen geld en het milieu, is het hergebruiken van de cultuur-inserts. Dit kan gebeuren door grondig spoelen in gedestilleerd H 2 O (dH 2 van O) gevolgd door incubatie in 70% EtOH gedurende ten minste 24 h tot hergebruik. Bij de voorbereiding van nieuwe cultuur, drogen de inserts in een cel cultuur plaat onder ultraviolet (UV) licht voor 15-30 min.
    4. Plaats twee (gesteriliseerd en droog) confetti op elk van de cultuur-inserts. Plaats de confetti aan de randen van de inserts om minimale overlap.
    5. Zet de platen in de cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO 2.
  4. Bubble koude dissectie medium (recept laboratoriumreagentia ' tabel) met bioxide gas (95% O 2 /5%CO 2). Om de oplossing steriel, de buis van de gasfles verbinding te maken met een steriele injectiespuit filter (0,22 µm poriëngrootte).
    1. Koppel het andere uiteinde van de spuit filter aan een steriele buis aangesloten op een steriele glazen pipet. Plaats de glazen pipet in de oplossing, bedek met parafilm en zet het gas. Dient u de dissectie medium op ice.
  5. Bereiden de dissectie/snijden gebied.
    Opmerking: Idealiter, deze procedure moet gebeuren in een steriele kap. Als dit niet mogelijk is, kan de vibratome worden verlaten op een bank werk. In dit geval is het aanbevolen om het gebruik van een haar net en gezicht masker.
    1. Met behulp van een enkele rand scheermesje, Knip een rechthoekig stuk (ongeveer 2 x 0,5 cm) van agarose gel (recept laboratoriumreagentia ' tabel) en lijm deze op het vibratome podium zodanig dat de lange zijde wordt geconfronteerd met het mes vibratome.
    2. Reinigen van alle oppervlakken en de onderdelen van de vibratome met 70% EtOH en veeg met een gesteriliseerde met autoclaaf weefsel doekjes.
      Opmerking: Het is belangrijk dat alle stukken die in contact met het hersenweefsel worden zal volledig droog zijn, omdat EtOH kan de cellen beschadigen.
    3. Een steriele scheermesje hechten aan de vibratome en vibratie controle uitvoeren als de vibratome deze functie heeft.
    4. Plaats gesteriliseerde met autoclaaf dissectie tools in de kap samen met gesteriliseerde met autoclaaf weefsel veegt, vier kleine petrischaaltjes, een ronde-rand scalpel, 2 glazen pipetten met rubberen bollen, twee open-end glas pipetten (zie pt. 1.1) en super lijm (besproeid met EtOH).
    5. Pour geborreld dissectie medium naar de boot vibratome en naar de vier kleine petrischaaltjes.
      Opmerking: Deze stap dient alleen te gebeuren onmiddellijk vóór dissectie aangezien medium vanaf dit punt is niet borrelen of ice. gehouden
  6. Ontleden en mount hersenen.
    Opmerking: Voor het verkrijgen van gezonde segmenten, deze stap moet gebeuren snel en precies. Wat oefening nodig is.
    1. Euthanaseren dier #1 door ontwrichting van de neckor volgens lokale richtsnoeren en vervolgens met de grote schaar onthoofden.
    2. Met kleine, scherpe schaar, snel verwijderen van de huid doordat een Sagittaal snede vanaf de nek tot de neus en trek opzij te onthullen van de schedel.
      1. u snijdt langs de Sagittaal hechtdraad, gevolgd door de zijdelingse insnijdingen over het inwendige deel van de frontale botten en de lamboid hechtdraad (de grens tussen cerebrum en cerebellum).
      2. Gebruik pincet te buigen open de schedel aan elke kant. De craniale zenuwen zijn afgesneden van de hersenen door het invoegen van een afgeronde, scherpe spatel onder de ventrale zijde van de hersenen en zachtjes bewegen de spatel lateraal.
    3. Een enkele rand scheermesje gebruiken om een coronale snede rostraal van het cerebellum.
      Opmerking: Op deze manier bespaart bepaalt de hoek waarmee de plakjes worden gesneden. Het moet daarom worden gemaakt in een rechte hoek.
    4. Spiegelen de hersenen uit de schedel en in een kleine petrischaal met dissectie middellange.
    5. Herhaal stappen 1.6.1.-1.6.4. voor dier #2 en plaats deze hersenen in een tweede Petri schotel.
      Opmerking: De dieren zijn niet steriel. De dissectie uitvoeren aan de ene kant van de kap en verplaats naar de andere, schone kant zodra de hersenen hebben verwijderd van de schedel.
    6. Handschoenen wijzigen.
    7. Bijvoegen hersenen naar vibratome fase: een dun laagje van superlijm toevoegen aan het werkgebied vlak voor de gemonteerde agarose gel. Houden van de kant van de hersenen #1 met een grote platte spatel met de vers gesneden (caudal) aanraken van de spatel en de ventrale zijde naar (en wordt zo dicht mogelijk bij) het agarose gel.
      1. Plaats dan voorzichtig de hersenen op de lijm door te drukken het uit de spatel met een pincet. Zorg ervoor dat u genoeg ruimte voor hersenen #2.
        Opmerking: Het is belangrijk dat de hersenen goed zijn aangesloten op het podium, maar zonder buitensporige lijm, zoals dit het stekje belemmeren kan.
    8. Onmiddellijk na montage van hersenen #1, de grote spatel te gebruiken voor het toevoegen van enkele druppels van dissectie medium op de top van de hersenen. Dit zal vochtig houden van de hersenen, de lijm uitharden en te voorkomen dat het vasthouden aan de zijkanten van de hersenen.
    9. Herhaal stap 1.6.7 en 1.6.8. voor hersenen #2.
    10. Hechten van het podium op de boot vibratome.
  7. Gesneden 230 µm dik coronale segmenten met een amplitude van 1-1,5 mm, een frequentie van 85 Hz en een snelheid van 0,2 mm/s. verzamelen segmenten ongeveer tussen 1.4 mm rostraal en 2.1 mm caudal naar Bregma.
    1. Verzamelen segmenten na elk segment heeft zijn gesneden met behulp van open-end glas pipetten (pt. 1.1). Segmenten omzetten in een petrischaal met dissectie medium. Gebruik van een afgeronde scalpel te de plakjes snijden in twee stukken, delen de twee hemisferen.
  8. Wanneer alle segmenten zijn gesneden, moet u segmenten plaatsen in de cultuur gerechten.
    1. Nemen van de cultuur-schotel (één op het moment) uit de incubator.
    2. Met behulp van de open-end glas pipetten, zorgvuldig overbrengen in een segment elk van de confetti.
      Opmerking: De segmenten moeten plat lag in het midden van de confetti. Dit vereist enige vaardigheid. Als sommige segmenten niet perfect zijn, het is echter beter om ze te laten dan om te besteden tijd proberen te verplaatsen want het is belangrijk om zo snel mogelijk alle segmenten in de incubator.
    3. Gebruiken een glazen pipet (puntige einde) zachtjes verwijderen overtollige medium zonder het aanraken van het segment.
      Opmerking: Segmenten moeten niet ondergedompeld worden in vloeistof tijdens de incubatie. Overtollige medium moet zo worden aanzuiging zodat de segmenten worden blootgesteld aan de lucht (een dunne film van medium standaardclustermodel voldoet nog steeds de segmenten). Segmenten die nog ondergedompeld in vloeibare zal meestal ongezond of sterven (4 en onze observaties).
    4. De schotel terug in de incubator bewegen zodra alle de confetti hebben één segment.
    5. Herhaal stap 1.7.8.-1.8.4. voor schotel #2.
  9. Wijzigen het kweekmedium.
    Opmerking: Dit moet gebeuren de dag na het snijden van (dag 1 in vitro DIV1) en vervolgens elke 2-3 dagen.
    1. Verwarm kweekmedium in een waterbad of de broedstoof.
    2. In een steriele kap, kunt vacuüm zuig of een regelmatige Pipetteer met een steriele tip gecombineerd kweekmedium van elk putje. Dit wordt gedaan door zachtjes kantelen van de schotel (door ongeveer 30 graden) en het uiteinde van de pipet plaatsen aan de rand van de cultuur-insert.
    3. Verwijderen ongeveer 800 µL van elk putje (verlaten net genoeg medium om te houden van de bodem van het donormateriaal bedekt met medium). Vervolgens met behulp van een schone precisiepipet, 800 µL van het voorverwarmde medium toevoegen aan elk putje. Plaats dan de gerechten terug in de cel cultuur incubator.

2. Virale transductie

  1. Inkoop- of make AAVs met een plasmide van belang, zoals eerder beschreven 10 , 11.
    Opmerking: Dit protocol beschrijft het gebruik van AAV serotype 2/8 (AAV 2/8) uitvoering mitochondriale gericht dsred of GFP als een verslaggever gen onder de Transcriptionele controle van de myeline fundamentele eiwit promotor 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred of AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) om te visualiseren Oligodendrocyt mitochondriën. AAV 2/8 GFP of tdtomato uitvoering als reporter gene gedreven door de algemene CAG-promotor (AAV 2/8 CAG_GFP of AAV 2/8 CAG_tdtomato) wordt gebruikt om te visualiseren Oligodendrocyt cytoplasma. Dus, de combinatie van AAV2/8 MBP_mito_dsred met AAV 2/8 CAG_GFP geeft rode mitochondriën en groene cytoplasma in oligodendrocyten, overwegende dat het combineren van AAV2/8 MBP_mito_GFP en AAV 2/8 CAG_tdtomato geeft groene mitochondriën en rode cytoplasma. De constructies worden beschreven in meer detail elders 13.
  2. Op dag 7 in vitro (DIV7), transduce met de AAVs oligodendrocyten.
    Let op: Volg veiligheidsvoorschriften voor het werken met AAVs. Zorg ervoor dat de juiste opleiding en het bioveiligheidsniveau goedkeuring nodig hebben. Alle van de volgende punten moeten worden uitgevoerd in een klasse II bioveiligheid-kast met handschoenen en laboratoriumjas. Hier, wordt toepassing van AAV op het gebied van de cortex van de segmenten beschreven, zoals dit is het gebied waarin de beste herstel.
    1. Dilute de AAV in voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium. Verdunningen rond 2 × 10 9 genoom kopieën/mL (GC/mL) wordt aangeraden om een schaars transductie van oligodendrocyten waarmee beeldvorming van afzonderlijke cellen binnen het segment. Echter, een piloot die met behulp van verschillende titers moet gebeuren om ervoor te zorgen een bevolkingsdichtheid van getransduceerde oligodendrocyten die geschikt is voor de specifieke experimenten. Als twee verschillende AAVs worden gebruikt, moeten ze worden gemengd in dezelfde oplossing en tegelijkertijd aan het segment toegevoegd.
    2. Toevoegen ongeveer 1.3 µL AAV verdund tot elk segment: Zorg ervoor dat de buitenkant van het uiteinde van de pipet droog is. Pipetteer 1.3 µL verdund AAV en houd de pipet boven de cortex, zo dicht mogelijk zonder het aanraken van het segment met het uiteinde van de Pipet (ongeveer 1 mm weg).
    3. Vervolgens langzaam push oplossing uit de pipet. Wanneer de oplossing het segment raakt, beweeg de pipet tip over de cortex te verspreiden de oplossing over de hele cortex gebied.
      Opmerking: Deze procedure moet worden zo snel mogelijk om te voorkomen dat het houden van de segmenten uit de kap voor langer dan nodig. Doe dit op één schotel op het moment en zet de eerste schotel terug in de incubator voordat u begint op schotel #2. Om een bevredigende verdeling van AAV zonder beschadiging van het weefsel enige oefening en een vaste hand vereist.
  3. Als een rechtop fluorescentie Microscoop beschikbaar in de cel-lab is, eiwit expressie gedurende de tijd in cultuur kan worden gecontroleerd door het plaatsen van de schotel onder de Microscoop.
    Opmerking: De schotel moet niet worden bewaard uit de incubator voor meer dan 2-5 minuten.

3. Time-lapse Imaging

Opmerking: de beeldvorming kan worden uitgevoerd wanneer de niveaus van de expressie van de fluorescerende markers voldoende zijn en de plakjes er gezond uitzien (meestal DIV11-14).

  1. Zorg ervoor dat de Microscoop, perfusie en verwarming correct zijn ingesteld zodat geborreld imaging oplossing wordt verwarmd en kan betreden en verlaten van het bad.
    Opmerking: Er bestaan verschillende oplossingen voor badkamers. Een eenvoudige versie is hier gepresenteerd.
    1. Maken in- en uitlaatopeningen van het bad door afgestompte spuit naalden (gebogen ~ 45 °) die zijn gekoppeld aan de zijkanten van het bad door blu-tack/fun tack.
    2. Zorgen dat leidingen uit een fles van continu geborreld imaging oplossing, via de peristaltische pomp, door de buis van de verwarming van de eenheid van de kachel, en vervolgens naar de inlaat spuit-naald in het bad gaat.
    3. Sluit een andere buis aan de injectiespuit naald wandcontactdoos. Deze buis gaat dan via de peristaltische pomp en terug naar de fles van imaging oplossing (of op een afval fles).
  2. Bubble imaging oplossing (recept laboratoriumreagentia ' tabel) met bioxide gas.
    Opmerking: Dit moet started ten minste 15 minuten voordat de beeldvorming en blijven gedurende het gehele experiment.
  3. Beurt peristaltische pomp en verwarming en uitvoeren oplossing via het bad aan het verkrijgen van optimale Bad temperatuur (37 ± 0,5 ° C). Zorgen dat de sensor van de thermometer verbonden aan de temperatuur-eenheid wordt ondergedompeld in de bad oplossing.
  4. Inschakelen de Microscoop, fluorescentie lamp en passende lasers.
  5. Set up een geschikte licht pad voor het monster.
    Opmerking: Dit hangt af van Microscoop setup en sonde. Algemene kennis over het gebruik van de confocal microscoop is vereist en zal worden hier niet behandeld.
  6. Gebruiken een water onderdompeling doelstelling met de juiste vergroting en numerieke diafragma (n.a.). Wij gebruiken een 40 x water onderdompeling plan-apochromat doelstelling (n.a. 1.0).
  7. Open gaatje te bereiken een optische sectie van ongeveer 2-2,5 µm voor de time-lapse video. Dit vermindert het optreden van mitochondriën bewegen onscherp tijdens time-lapse.
  8. Overdracht organotypic segment naar het bad:
    1. een daling van imaging oplossing of kweekmedium toevoegen aan een kleine plastic petrischaal.
    2. In een steriele kap, gebruik steriel pincet voor het overzetten van één segment van de organotypic van het membraan invoegen aan de daling. De verlostang moet alleen raken de confetti en niet de slice.
    3. Zet het deksel op de petrischaal.
    4. Onmiddellijk zet de schotel van de cultuur met de rest van de segmenten terug in de incubator.
    5. Brengen petrischaal met segment naar de Microscoop.
    6. Uitschakelen peristaltische pomp tijdens het overzetten van segment te Microscoop bad. Gebruik pincet eerst op te heffen confetti met segment van de petrischaal naar de top van het bad (de confetti wordt een zwevende werkbalk). Vervolgens plaats de twee uiteinden van de verlostang aan weerskanten van de confetti, zodat ze de confetti aanraken zonder het aanraken van het segment, en duw de confetti door de oplossing naar de bodem van het bad. De confetti in het midden van het bad centreren.
    7. Gebruik pincet te plaatsen van het hold-down-anker (harp) op de top van de confetti zonder het aanraken van het segment.
      Opmerking: Een harp is een hoefijzer-vormige platina anker die wordt gebruikt om te voorkomen dat het segment van drijvende of drijven in het bad. Voor acute segmenten lopen dunne snaren van de ene kant van de harp naar de andere (lijkt op een muziek-harp). Voor organotypic de segmenten, de harp moet worden stringless en past de grootte van de confetti op zodanige wijze dat het op de top van de confetti leggen kan zonder het aanraken van het segment.
    8. Peristaltische pomp terug inschakelen.
  9. De doelstelling tot het monster Verlaag.
  10. Selecteer cel en regio naar afbeelding.
    Opmerking: Vermijd overmatige blootstelling van de cellen aan het laserlicht omdat dit leiden cel toxiciteit tot kan (Zie tips in de punten hieronder).
    1. Gebruiken de oculairs en de TL-lamp te vinden van een gezond uitziende Oligodendrocyt met de juiste expressie. Oligodendrocyten die een sterke overexpressie van fluorescente proteïne hebben verschijnen meestal ongezond. Ongezonde oligodendrocyten processen met een blobby uitstraling zal hebben, en de mitochondriën gefragmenteerde zal verschijnen. In gezonde oligodendrocyten, de soma en processen altijd gelijkmatig weergegeven- en mitochondriën hebben verschillende lengtes (hoewel meestal veel korter dan in neuronen en astrocyten 13 , 14 , 15).
    2. de cel van belang in het midden van het gezichtsveld plaats.
    3. Gebruik het " leven " functie in de software (voor Leica en Zeiss microscopen) te identificeren van de cel op het scherm en kies een gebied van belang, bijvoorbeeld een deel van de cel waarin verschillende primaire processen of myeline omhulsels, of een enkel proces of myelineschede.
      Opmerking: Om te kunnen beeld zo veel van de processen/omhulsels mogelijk, kies gebieden met processen die lag relatief vlakke in de x-en y-richting.
    4. Inzoomen op het gebied van belang (meestal het produceren van een afbeelding met pixelgrootte van 0.14 - 0,30 µm).
    5. Gebruiken de " regio's " tool, tekent u een rechthoek rond het gebied en kies de optie voor het scannen van alleen de geselecteerde regio. Scannen tijd, en dus laser belichting, wordt verminderd door het scannen van alleen de geselecteerde regio.
      Opmerking: Horizontale rechthoekige gebieden zullen worden afgetast sneller dan verticale regio's vanwege de kortere aantal gescande regels nodig. Als een verticale rechthoek regio is gescand, het scannen tijd kan worden verminderd door het draaien van de scan veld door 90 graden (met behulp van het gereedschap rotatie).
  11. Aanpassen laser macht en gewin te krijgen een goed zicht op de mitochondriën.
    Opmerking: Gebruik de kracht van de minimale laser nodig. Indien mogelijk, Verruim winst in plaats van groeiende macht van de laser. Naast de cel toxiciteit veroorzaakt, zal te hoog laser macht bleken de verbeelde objecten na verloop van tijd, waarvoor derhalve een verdere stijging van laser macht of krijgen tijdens het scannen. De vereiste laser macht en gewin zal afhangen van het niveau van expressie en de Microscoop. Met een LSM700 confocal microscoop, gebruiken we een 555 nm laser op een kracht van 20-40 μW naar afbeelding dsred of tdtomato en een 488 nm laser is op 20-30 μW ingezet om het imago van GFP (laser kracht gemeten op de opening van de doelstelling van de rug). Winst ligt hoog voor levende imaging, meestal in het bereik van 700-800 voor GFP en 850-980 voor dsred en tdtomato. De hoge winst kan veroorzaken sommige meer achtergrondgeluiden, die is verwijderd door het verhogen van de digitale offset (offset waarden lag meestal tussen 0 en 15). In onze ervaring, met behulp van MBP_mito_GFP geeft een betere signaal-ruis dan MBP_mito_dsred.
  12. Selecteer scansnelheid.
    Opmerking: Sneller scannen met behulp van een snelle scansnelheid en door het opstellen van een kleine scannen regio (zie punt 4.10.5 hieronder). Het is ook mogelijk om te besparen tijd scannen door het uitvoeren van een scan bidirectionele. Dit is echter niet aanbevolen als gevolg van armere beeldkwaliteit.
  13. Set frequentie en duur van time-lapse opname, bijvoorbeeld capture beelden elke 2 seconden voor een totaal van 20 minuten voor mitochondriale imaging in oligodendrocyten.
    Opmerking:, De frequentie en de duur ervan moeten worden vastgesteld volgens de mobiliteit van de objecten van belang. Een hogere frequentie zal het model om meer laserlicht blootstellen, maar sneller bewegende objecten vereisen ook een kortere duur van time-lapse video's (bijvoorbeeld mitochondriën in neuronen, die steeds vaker en op een veel hogere snelheid dan mitochondriën in verplaatsen oligodendrocyten, zijn typisch beeld per seconde voor een totaal van 2 minuten 16).
  14. Start time-lapse opname.
    Opmerking: De mitochondriën kunnen verplaatsen onscherp en/of drift uit de verbeelde regio tijdens de opname. Aanpassen om te minimaliseren van trillingen en verkeer, in - en uitlaatopeningen van het bad en toerental van de pomp te verminderen, indien nodig. Kleine veranderingen in focus meestal nog steeds optreden. Dus, continue controle van het scherm tijdens imaging vereist is, met kleine aanpassingen van de scherpstelling tijdens de opname.
  15. Vangen van een z-stapel van de hele cel voor toekomstige identificatie van cel en beeld proces.
    Opmerking: Voor betere resolutie, het gaatje moet worden teruggezet naar 1 luchtige eenheid voor de z-stack.
  16. Optioneel: visualiseren onbevlekt myeline.
    Opmerking: In getransduceerde met (cytoplasmatische) GFP oligodendrocyten, de omhulsels van myeline kan meestal worden geïdentificeerd als rechte lijnen van cytoplasma (de cytoplasmatische ruggen) aangesloten op een primaire proces (Zie Figuur 2 A en B). Als GFP expressie te zwak is, of een cytoplasmatische markering niet wordt gebruikt, is het echter mogelijk te visualiseren van de myelineschede door reflectie van de confocal microscopie (CoRe), zoals hier uitgelegd.
    1. Een nieuw licht pad in de software met laser excitatie op 488 instellen nm en vangen uitgestraalde licht rond dezelfde golflengte, bijvoorbeeld 470-500 nm.
    2. Aanpassen laser macht en krijgen totdat myeline zichtbaar is (zie voorbeeld in < sterke class = "xfig "> figuur 3). Met behulp van een Microscoop LSM 510 Meta, gebruiken we meestal een kracht van de laser van 7-12 μW (gemeten op de opening van de achterkant van de doelstelling).
  17. Optioneel: voorbereiding van segmenten voor immunokleuring.
    1. Als de verbeelde cel moet worden geïdentificeerd na immunokleuring, opname een lage vergroting (10 x) voor de cel en de locatie in de afbeelding geven door het opstellen van een pijl of soortgelijk. Om steun detectie van de cel, het is aanbevolen om ook het tekenen van een handmatige kaart van het hele segment, met vermelding van de locatie van de cel.
    2. Fix snijd in 4% paraformaldehyde (PFA) van schudinrichting gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      Let op: PFA is schadelijk. Gebruik beschermende slijtage en alleen gebruiken in een geventileerde kap.
    3. Verdund fixeerspray 1:10 in PBS en verlaten bij 4° C tot starten van immunohistochemistry zoals elders beschreven 17.
      Opmerking: Hoewel segmenten kunnen worden overgelaten in verdunde fixeerspray voor enkele weken, fluorescentie kan vervagen. Uitvoeren van immunohistochemistry binnen 10 dagen na fixatie verdient.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Organotypic hersenen segmenten die werden gekweekt en getransduceerde zoals hierboven beschreven toonde een schaars verdeling van corticale oligodendrocyten mito_dsred en GFP uitspreken. Immunokleuring met antilichamen tegen Olig2 en MBP bevestigd dat de expressie specifiek voor oligodendrocyten (Figuur 1 was).

Voor levende imaging, werden getransduceerde oligodendrocyten erkend door hun kenmerkende...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol voor het maken van organotypic culturen hier beschreven is een gewijzigde versie18 van het protocol beschreven door De Simoni en Yu (2006)5. De belangrijkste wijzigingen hebben zijn hieronder. Tris-buffer wordt toegevoegd aan het kweekmedium, waardoor het voortbestaan van de segmenten als buiten de incubator tijdens virale transductie en wijzigen van de cel-medium worden verbeterd. De sterilisatie procedure voor confetti is ook veranderd. Terwijl andere protoco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Wij danken Linda Hildegard Bergersen en Magnar Bjørås voor toegang naar cel lab en apparatuur, Janelia moleculaire biologie gedeelde Resource personeel voor plasmide en virus productie als Koen Vervaeke voor hulp bij laser macht metingen. Dit werk werd gefinancierd door de Noorse Health Association, de Noorse Onderzoeksraad en de apparatuur van de microscopie werd gefinancierd door Norbrain.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose Sigma A9539
BD Microlance 19GBD301500Naalden gebruikt voor in- en uitlaat van bad
Bioxide gasAGA105701
Brand pipette bulbsSigma-AldrichZ615927Pipetbulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner)VWR89038-530
Cable assembly for heater controllersWarner Instruments64-0106 Temperatuurregelaar - thermometer deel
CaCl2Fluka21100
CO2 AGA100309CO2 voor incubator
Cover glass, square CorningThermo  Fischer Scientific13206778Om onder bad te bevestigen voor live imaging. Verzegeld met lijm of petroleum jelly.
D-(+)-GlucoseSigmaG7021
Delicate forcepsFinescience11063-07Voor dissectie
Diamond scriber penTed Pella Inc.54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mmVWR612-1702Glazen pipetten
Double edge stainless steel razor bladeElectron Microscopy Sciences#7200Vleesmes voor vibratoom
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
Filter paper circlesSchleicher & Schuell300,220Filterpapier gebruikt voor filtratie van PFA
Fun tackLoctite1270884Gebruik om de positie van in- en uitlaten in het bad te verbinden/aanpassen
Hand towel C-Fold 2Katrin344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber,Warner Instruments 64-1418Harp om confetti in het bad vast te houden. Snijd de snaren af voor gebruik met organotypische plakjes. 1,5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3SigmaH-7006
Holten LaminAir, Model 1.2Heto-Holten96004000MLaminare stroomkap
Horse serum, heat inactivatedGibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
LCR Membrane, PTFE, MilliporeFHLC0130Confetti 
Leica VT1200Leica14048142065Vibratoom
MEM-Glutamax with HEPESThermo  Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Micro Spoon Heyman Type BElectron Microscopy Sciences62411-BKleine, afgeronde spatel met geslepen punt voor dissectie
Millex-GP filter unitMilliporeSLGPM33RASpuitfiltereenheid
Millicell cell culture insert, 30 mmMilliporePICM03050Celcultuur inzetstukken
Minipuls 3 Speed Control ModuleGILSONF155001Peristaltische pomp voor live imaging - Besturingsmodule-onderdeel (aansluiten op tweekanaals kop)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon Delta SurfaceThermo  Fischer Scientific140675Kweekplaat
Nystatin SuspensionSigma-AldrichN1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC Zeiss441452-9900-000 Waterimmersieobjectief gebruikt voor live imaging. (WD=2,5mm), VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
Paraformaldehyde, granulairElectron Microscopy Sciences#19208
PC-R perfusion chamberSiSkiYou 15280000EBad voor live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquidInvitrogen15070-063
Petri dish 140 mm Heger1075Grote petrischaal 
Petri dish 92x16 mm Sarstedt 82.1473Gemiddelde petrischaal 
Petridish 55x14,2 mmVWR391-0868Kleine petrischaal
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417PBS-tabletten
R2 Two Channel Head GILSONF117800Peristaltische pomp voor live imaging - Tweekanaals kopdeel (vereist besturingsmodule)
Round/Flat Spatulas, Stainless SteelVWR82027-528Grote spatel voor dissectie
Sand paperVWRMMMA63119Optioneel, voor het gladstrijken van gebroken glazen pipetten
Scissors,  17,5 cmFinescience14130-17Grote schaar voor dissectie
Scissors, 8,5 Finescience14084-08Kleine, scherpe schaar voor  dissectie
Single edge, gem bladeElectron Microscopy Sciences#71972Enkelzijdig vleesmes
Single inline solution heater SH-27BWarner Instruments64-0102Temperatuurregelaar - verwarmingsdeel
Steritop-GP Filter unit, 500 ml, 45mmMilliporeSCGPT05REFilter om oplossingen te steriliseren
Super glue precisionLoctite1577386
Surgical scalpel blade no. 22Swann Morton Ltd.209Afgeronde scalpelmes

Referenties

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Mitochondri n van oligodendrocytenAAV transductiemitochondriale beeldvormingmyelinisch basisprote netime lapse opnameconfocale reflectantieaflevering van virale vectorenfluorescent eiwitexpressie
Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.