Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

6.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56239

⸱

5 november 2017

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California School of Medicine, Davis

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel schetst een protocol voor de detectie van een of meer plasma en/of intracellulaire membraaneiwitten grondtoestand uitputting (GSD) Super resolutie microscopie met zoogdiercellen. Hier bespreken we de voordelen en de overwegingen van het gebruik van dergelijke benaderingen voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten.

Samenvatting

Voorschotten in fluorescent microscopie en celbiologie zijn nauw gecorreleerd, met de verbeterde mogelijkheid om te visualiseren van cellulaire gebeurtenissen die vaak leiden tot dramatische sprongen in ons begrip van hoe cellen functie. De ontwikkeling en beschikbaarheid van super resolutie microscopie is aanzienlijk uitgebreid de grenzen van de optische resolutie van ~ 250-20 nm. Biologen zijn niet langer beperkt tot het beschrijven van de moleculaire interacties in termen van colocalization binnen een gebied van diffractie beperkt, eerder het is nu mogelijk om te visualiseren de dynamische interacties van afzonderlijke moleculen. Hier duidelijk naar voren komt een protocol voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten door uitputting van de grondtoestand microscopie voor beeldvorming van de vaste cel. We bieden voorbeelden uit twee verschillende membraaneiwitten, een element van het endoplasmatisch reticulum-translocon, sec61β, en een plasmamembraan-gelokaliseerde spanning-gated L-type Ca2 + kanaal (CaV1.2). Besproken zijn de specifieke Microscoop parameters, fixatie methoden, foto-switching buffer formulering, valkuilen en uitdagingen van de beeldverwerking.

Inleiding

Cellulaire signalering reacties vertalen veranderende interne en externe omgeving om te beginnen een cellulaire respons. Ze regelen alle aspecten van de menselijke fysiologie, de Stichting hormoon en neurotransmitter release, hartslag, visie, bevruchting, en cognitieve functie bijeenkomen. Verstoring van deze signalering cascades kan ernstige gevolgen in de vorm van pathofysiologische omstandigheden waaronder kanker, Parkinson en de ziekte van Alzheimer hebben. Voor decennia, heb biologische en medische onderzoekers met succes gebruikt fluorescente proteïnen, sondes en biosensoren fluorescentie microscopie gekoppeld als de belangrijkste instrumenten om te begrijpen van de precieze ruimtelijke en temporele organisatie van deze mobiele signalen.

De troeven van optische technieken zoals epifluorescence, confocal, of totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie zijn hun gevoeligheid, snelheid en compatibiliteit met levende cel imaging, terwijl de grote beperking is hun diffractie-beperkte resolutie, zin structuren of eiwitcomplexen kleiner dan 200-250 nm kunnen niet worden opgelost. Met de ontwikkeling van het theoretische en praktische van deterministische super resolutie (bijvoorbeeldgestimuleerde emissie uitputting microscopie (STED1), gestructureerd verlichting microscopie (SIM2) of stochastische super resolutie (bv , photoactivated lokalisatie microscopie (PALM3) of grondtoestand uitputting (GSD4,,5)), laterale en axiale resolutie fluorescentie microscopie is uitgebreid buiten de diffractie barrière, aan de orde van tientallen nanometer. Onderzoekers hebben dus nu de ongeëvenaarde mogelijkheid te visualiseren en te begrijpen hoe de dynamiek van de eiwitten en organisatie vertaalt naar functie op in de buurt van-moleculair niveau.

Grondtoestand uitputting microscopie gevolgd door individuele molecuul terugkeer (GSDIM), of gewoon GSD omzeilt genoemd, u de limiet van diffractie door het verminderen van het aantal gelijktijdig uitstoten fluorophores4,5. Hoge-energie laserlicht wordt gebruikt voor het prikkelen van het monster fluorophore-geëtiketteerd, bombarderen van elektronen met fotonen en het vergroten van de kans dat zij zal ondergaan een 'spin-flip' en voer de triplet of 'donker-state' van de geëxciteerde toestand4. Dit effectief de grondtoestand uitput, vandaar de naam 'de grond staat uitputting". In de triplet, fluorophores doen niet het uitstoten van fotonen en het monster verschijnt dimmer. Echter deze fluorophores stochastically terug naar de grondtoestand en verschillende foton uitstoten opgewonden-grond staat overgangen voordat hij terugkeerde naar de triplet staat kunt doorlopen. Met minder fluorophores uitstoten te allen tijde, uitgezonden foton uitbarstingen van individuele fluorophores ruimtelijk en stoffelijk losstaat van het naburige fluorophores geworden. De uitbarsting van fotonen worden past met een Gauss functie, de berekende centroid die correspondeert met de positie van de fluorophore met een nauwkeurigheid van lokalisatie die afhankelijk is van de numerieke diafragma (NA) van de lens, de golflengte van het licht gebruikt voor excitatie en cruciaal, het aantal fotonen uitgezonden per fluorophore. Een beperking van de GSD is dat, aangezien slechts een subset van fluorophores actief op elk gewenst moment stoot, duizenden beelden gedurende enkele minuten op te bouwen een volledige lokalisatie-kaart moeten worden verzameld. De lange acquisitietijd in combinatie met de hoge laser machtsvereiste, betekent dat de GSD is beter geschikt voor vaste in plaats van live monsters.

Dit artikel beschrijft de voorbereiding van vaste monsters voor super-resolutie microscopie beeldvorming van membraan en endoplasmatisch reticulum (ER)-resident eiwitten (voor een lijst van de nodig materialen en reagentia Zie de Tabel van de materialen). Voorbeelden van hoe dit protocol kan gemakkelijk aangepast om te kwantificeren van de grootte en de mate van clustering van L-type spanning-gated Ca2 + kanalen (Cav1.2) in het sarcolemma van cardiale myocytes of gebruikt voor het visualiseren van de cellulaire verdeling van de ER, worden aangetoond. Inzicht in de distributie en de organisatie van deze cellulaire componenten is uitermate belangrijk bij het begrijpen van de inleiding, vertaling, en uiteindelijk de functie van vele Ca2 +-afhankelijke signalering cascades. Bijvoorbeeld, zijn Cav1.2 kanalen fundamenteel belang voor de excitatie-contractie koppeling, terwijl receptor-gemedieerde Ca2 + vrijlating uit de ER misschien wel de meest alomtegenwoordige signalering cascade in zoogdiercellen is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. wassen glas Coverslips

  1. de dag vóór de verwerking van de steekproef, schoon #1.5 glas coverslips door sonicating in een oplossing van 1 M Koh gedurende 1 uur. Hiermee verwijdert u een fluorescerende contaminanten die mogelijk aanwezig zijn op de coverslips.
    1. Spoel de KOH uit de coverslips met de geïoniseerd water.
    2. Zodra gereinigd in KOH, bewaren de coverslips in 70% ethanol tot gebruiksklare.

2. Coating glas Coverslips

Opmerking: stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een cel cultuur kap om verontreiniging te voorkomen.

  1. Pincet gebruiken om een afzonderlijke dekglaasje aan van de 70% ethanol oplossing en snel om te verwijderen van de overtollige vlam. Plaats de coverslips in een 6-well-plaat. Als vlammen in de kap van een cultuur geen optie is, kunt u overwegen autoclaaf de coverslips na het spoelen met de geïoniseerd water en/of sterilisatie onder de UV-licht in de kap van de cultuur voor ten minste 30 min.
  2. Jas om steun hechting van de cellen, coverslips met steriele 0,01% poly-L-lysine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Gecombineerd de poly-L-lysine en spoel de coverslips met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Droge lucht en 's nachts in de koelkast plaatsen.
  4. De volgende ochtend, verwijder de coverslips uit de koelkast en voeg 300 µL van laminin, met een concentratie van 50 µg/mL, gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Ervoor zorgen dat de laminin wordt zorgvuldig geplaatst direct op het dekglaasje aan.
    Opmerking: Deze stap van de laminin is niet nodig voor COS-7 cellen of HEK293 cellen maar is vereist voor geïsoleerde ventriculaire myocytes. Andere elektrische elementen zoals vasculaire zachte spiercellen of neuronen kunnen houden beter collageen of fibronectine gecoat coverslips.

3. Voorbereiding van cellen

  1. gekweekte cellen
    1. groeien COS-7 cellen (of voorkeur cellijn) op een schotel cultuur 10 cm in 10 mL Dulbecco ' s bewerkt Eagles Medium (DMEM) kweekmedium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (PS) oplossing. Groeien van cellen in een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
    2. Wanneer de cellen bereiken 90% confluentie, oogst hen door aspirating de DMEM media en toevoeging van 5 mL van 0,05% trypsine-EGTA-oplossing van de 10 cm schotel. Zodra de cellen begint te ronden en losmaken, onmiddellijk de trypsine met aangevuld DMEM te neutraliseren.
      1. Gebruik een 5 mL serologische pipet om de cellen van de schotel. Pipetteer het medium tegen de onderkant van de schotel meerdere malen om alle cellen die blijven aanhanger en homogeen verdelen de cellen in de hele het kweekmedium.
    3. Cellen op 35 mm cultuur gerechten tot 70% confluentie voor Transfectie plaat. Maak de hoeveelheid medium in de schotel met verse DMEM/FBS/PS oplossing tot 2 mL.
    4. Transfect COS-7 cellen met de gewenste plasmide DNA constructies (b.v., sec61β-mCherry-plasmide), met behulp van een passende transfectiereagens en volgens de fabrikant ' s instructies.
      Opmerking: Het duurt 24-48 h voor de proteïne uitspreken, afhankelijk van de plasmide en/of het transfectiereagens gebruikt.
  2. Volwassen muis ventriculaire myocytes
    1. isoleren van ventriculaire myocytes volwassen muis met behulp van de gevestigde Langendorff perfusie methode 6. Resuspendeer de resulterende pellet van myocytes in Medium 199 (M199), aangevuld met 2,5% FBS en 1% PS.

4. Plating cellen

  1. COS-7 Transfected cellen
    1. gecombineerd 2 mL oplossing van DMEM/FBS/PS van 35 mm schotel en voeg 1 mL Ca 2 +-gratis PBS. De schotel van terug naar de incubator voor 2 min. oogst cellen de schotel door het eerste aspirating de Ca 2 +-gratis PBS en vervolgens toe te voegen 1 mL trypsine-EGTA-oplossing 0,05%.
      1. Zodra de cellen beginnen te ronden en loskoppelen, onmiddellijk het neutraliseren van de trypsine met 1 mL aangevuld DMEM. Zachtjes op en neer meerdere malen om ervoor te zorgen dat transfected cellen zijn gelijkmatig verspreid over de schorsing van 2 mL trypsine-EGTA-DMEM Pipetteer.
    2. Plaat transfected cellen van COS-7 op de gecoate coverslips poly-L-lysine bij een geschikte dichtheid zodat afzonderlijke cellen kunnen worden gevisualiseerd en vul de schotel volume maximaal 2 mL met DMEM/FBS/PS (bijvoorbeeld 90 µL celsuspensie toevoegen aan het dekglaasje aan Voeg vervolgens 1,910 µL aangevuld DMEM, swirl schotel om cellen verdelen).
      Opmerking: Cellen hoeven niet te worden geteld, maar het volume van cellen worden toegevoegd aan elk gerecht zal variëren afhankelijk van de confluentie cellen.
    3. Terugkeer verguld cellen aan de cel cultuur incubator's nachts om de cellen te houden en te herstellen.
  2. Volwassen muis ventriculaire myocytes
    1. laminin en plaat myocytes rechtstreeks op het gecoate coverslips bij een geschikte dichtheid gecombineerd zodat afzonderlijke cellen kunnen worden gevisualiseerd. Dit zal afhangen van de dichtheid van levensvatbare cellen verkregen uit het isolement.
    2. Evenwicht van de celsuspensie in een koepel op de plaats in een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voor ~ 45 min om hechting en dekglaasje aan.

5. Fixatie van de cellen

  1. verwijderen van cellen uit de incubator en zorgvuldig het medium gecombineerd.
    1. Spoel de Adherente cellen een keer met PBS.
    2. Fix cellen met een fixeer geoptimaliseerd tot de afzonderlijke toepassing en antilichamen.
      Opmerking: Een belangrijk criterium in gedachten te houden bij het selecteren van een fixeer is het instandhouden van de celstructuur van het monster, terwijl ook ervoor te zorgen dat er geen conformationele verandering in het antigeen van belang is. Voor de toepassing van dit protocol fixatie met 3% paraformaldehyde/0.1% Glutaaraldehyde (PFA/GA) en fixatie met 100% methanol is besproken.
  2. PFA/GA fixatie van transfected COS-7 cellen uiten van Sec61β-mCherry
    1. Meng 1.9 mL 16% PFA en 20 µL 50% GA en toevoegen van PBS zodat een eindvolume van 10 mL.
    2. Add 1 mL vers bereide PFA/GA oplossing voor elk gerecht van cellen en fix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. De PFA/GA en spoel cellen 3 keer met PBS gecombineerd.
    4. Wassen de zelfklevend cellen met PBS, 5 keer voor elke 5 min. Alle wassen stappen uitvoert op een rotator ingesteld op een matige snelheid (b.v., 50 cycli per minuut).
    5. Vervolgens de vrije aldehyde-groepen te verminderen met 1 mL vers bereide 0,1% massa/volume natriumboorhydride in-geïoniseerd water.
    6. Rinse cellen tweemaal daarna wassen 3 keer voor 5 min in PBS te verwijderen van alle sporen van natriumboorhydride en de alcohol het produceert wanneer het reageert met gratis aldehyden.
  3. Methanol fixatie van volwassen muis ventriculaire myocytes
    1. voorzichtig 1 mL ijskoud 100% methanol toegevoegd aan de cellen. Kantelen van de 6-well-plaat en Pipetteer de methanol tegen de zijwand in plaats van direct op het dekglaasje aan. Vervolgens tilt het 6-well plaat terug naar horizontaal ten opzichte van de methanol te gelijkmatig wassen toestaan over de gewenste cellen. Positiebepaling voor 5 min bij-20 ° C.
    2. De fixeer en spoel cellen 3 keer met PBS gecombineerd.
    3. Wassen van de zelfklevend cellen met PBS, 5 keer voor 5 min op een rotator.

6. Blokkeren van niet-specifieke Binding

  1. blok gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de blokkerende oplossing (Zie de Tabel van de materialen).
    Opmerking: Diverse oplossingen kunnen worden gebruikt voor niet-specifieke antilichaam binding met inbegrip van 3% bovien serumalbumine (BSA) of niet-immuun serum van dezelfde soort als het primaire antilichaam blokkeren.

7. Opsporing

  1. primair antilichaam-incubatie
    1. Aspirate de blokkerende oplossing. Niet wassen of spoelen.
    2. Bereid de primair antilichaam-oplossing als volgt (zie stap 7.1.5): Verdun het primaire antilichaam aan een concentratie van 10 µg/mL (of fabrikant ' s voorgestelde concentratie) in de antilichaam-incubatie oplossing (Zie de tabel van materialen ). Dit kleine volume op het dekglaasje aan balans en zorgvuldig het instellen van een vierkant van kunststof paraffine film op de top. Dit helpt om de geringe omvang van antilichaam verspreid over het dekglaasje aan en beschermt tegen verdamping.
    3. Plaats van de 6-well-plaat in een kamer vochtigheid en na een nacht in de koelkast te bebroeden.
    4. In de ochtend, de cellen uit de kamer vochtigheid te verwijderen, verwijder voorzichtig de vierkante paraffine-film van het oppervlak van het dekglaasje aan en het primaire antilichaam-oplossing gecombineerd.
    5. Rinse 3 keer met PBS, daarna wassen 5 keer voor 5 min met het wassen van blok oplossing (Zie Tabel van materialen) op de rotator.
      Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van de volgende antistoffen, anti-RFP muis monoklonaal antilichaam voor afbeeldingen weergegeven in Figuur 2 en konijn polyklonale FP1- 7 anti-Ca V 1.2 antilichaam (een geschenk van Prof. Johannes hel, UC Davis) voor afbeeldingen die zijn weergegeven in Figuur 3. Met betrekking tot de kamer vochtigheid bekleed een kunststof Lunchbox met een strakke deksel, met natte papieren handdoeken werken. PBS kan worden gebruikt voor het wassen van stappen, maar dit protocol labeling specificiteit verbetert en verlaagt de achtergrond met behulp van een verdunde blokkerende oplossing voor het wassen van stappen.
  2. Secundair antilichaam-incubatie
    1. de wassen oplossing gecombineerd en voeg 200 µL geconjugeerd secundair antilichaam oplossing verdund 1:1,000 in antilichaam-incubatie oplossing. Plaats een vierkant van paraffine film op de top van het dekglaasje aan (zie stap 7.1.2).
    2. Incubate gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
    3. Aspirate secundair antilichaam en spoel 3 keer met PBS.
    4. Wassen van cellen met verdunde blokkerende oplossing 5 keer voor 5 min op de rocker.
    5. Was 3 keer voor 5 min met PBS.
      Opmerking: Dit protocol beschrijft het gebruik van anti-muis Alexa 647 geconjugeerd secundair antilichaam en anti-konijn Alexa 647 geconjugeerd secundair antilichaam voor Figuur 2 en Figuur 3, respectievelijk. Voor het labelen van één eiwit, is Alexa 647 de voorkeur fluorophore vanwege zijn hoge foton graaf (verbetert lokalisatie precisie) en lage taakcyclus (verbetert de temporele resolutie) 8. Veel andere fluorophore-geconjugeerde secundair antilichaam opties, zoals Atto of Cy-kleurstoffen, zijn beschikbaar. Verwijzen naar Dempsey et al. 8 en Chozinski et al. 9 voor uitgebreide evaluaties van de geschiktheid van verschillende fluorophores/kleurstoffen voor super-resolutie beeldvorming.

8. Na fixatie (een optionele stap)

  1. Verdun 50 µL 50% GA 10 ml PBS te verkrijgen van een 0,25% GA oplossing. Na het bevestigen van cellen gedurende 10 minuten in deze oplossing bij kamertemperatuur.
  2. Wassen met PBS 3 keer gedurende 5 minuten op een rotator.

9. Opslag van de monsters

  1. monsters in de koelkast (4 ° C) bewaren in een verpakking van aluminiumfolie bekleed te beschermen tegen licht tot imaging.
  2. Voor de lange termijn opslag van monsters (tot enkele maanden), slaan in PBS met 3 mM natriumazide ter voorkoming van bacteriële groei.

10. GSD super resolutie Imaging Photoswitching Buffer voorbereiding

  1. bereiden de zuurstof opruiming ' GLOX ' oplossing als volgt:
    1. In een 1,5 mL microcentrifuge buis, het toevoegen van 12,5 µL katalase (voorraad 34 mg/mL), 3,5 mg glucose-oxidase en 0,5 µl 1 M Tris (pH = 8) naar 49,5 µL PBS.
    2. Vortex kort te ontbinden van componenten in oplossing dan Centrifugeer bij 20.800 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
      Opmerking: zuurstof-opruiming zoals GLOX, zijn oplossingen gevonden om zich te verzetten photobleaching. GLOX moet worden bewaard in de koelkast voor maximaal een week. Herhaal de stap van de centrifuge telkens wanneer het wordt gebruikt.
  2. De photoswitching-inducerende voorbereiden thiol oplossing als volgt:
    1. 100 mM β-mercaptoethylamine (MEA) oplossing in PBS bereiden en wijzigen van de pH op pH 8 of als alternatief gebruik β-mercaptoethanol (βME). Opslag aliquoted MEA oplossing in de diepvries (-20 ° C) voor maximaal 1 week.
  3. Onmiddellijk voor imaging, de definitieve switch buffer op ijs bereiden door toevoeging van de thiol en zuurstof-opruiming onderdelen samen. Voor 500 µL GLOX-MEA, 5 µL GLOX toevoegen aan 50 µL MEA (pH = 8) en 445 µL zoute buffer (2,5 mL 1 M Tris pH = 8, 29.22 mg NaCl (definitieve concentratie van 10 mM), 5 g glucose en 47.5 mL water). Als alternatief voor GLOX-βME oplossing 5 µL GLOX toevoegen aan 5 µL βME en 490 µL zoute buffer.
    1. Houden de oplossingen op ijs en zo nodig te monteren monsters op glas depressie dia's gebruiken.
      Opmerking: Thiol met oplossingen zoals βME of MEA induceren photoswitching cyanine gebaseerde kleurstoffen zoals Alexa 647 10 of xanthene gebaseerde kleurstoffen zoals Alexa 568. ΒME produceert betere resultaten met Alexa 647 overwegende dat MEA is de voorkeur voor Alexa 568 of wanneer 2 eiwitten moeten worden met een dubbele labeling aanpak met behulp van zowel Alexa 568 en 647 beeld. De buffer zal verslechteren gedurende een periode van uren als gevolg van verzuring. Dit zal leiden tot een vermindering van de gemiddelde foton telling van het monster. Om dit te voorkomen, is het raadzaam om verse photoswitching buffer na 2-3 h of als een daling van de gemiddelde foton telling of een opmerkelijke verlenging van termijnen voor geïnduceerde photoswitching wordt waargenomen. Een recent artikel beschreven een nieuwe beeldvorming buffer Ox-EA die wij nog niet hebben getest, maar naar verluidt exposities stabiele pH niveaus voor meerdere dagen en beter dan GLOX voor Multi-Color imaging toepassingen 11 presteert.

11. Montage van de monsters

  1. Mount coverslips aan gelabelde cellen (zie punten 1-9) op depressie dia's, met behulp van 100 µL imaging buffer.
  2. Zegel de randen van het dekglaasje aan met een siliconen lijm om te voorkomen dat snelle oxidatie van de beeldvorming buffer. Wacht enkele minuten totdat de siliconen lijm is volledig uitgehard, anders is het dekglaasje aan zal drijven wanneer imaging.
    Opmerking: Siliconen lijm zal niet verharden als het in contact βME komt. Zorg ervoor dat u de randen van het dekglaasje aan om te voorkomen dat de siliconen lijm contact opnemen met de beeldvorming buffer droog.

12. Afbeelding van overname

  1. Zie tabel 1 voor een lijst van de imaging parameters gebruikt in Figuur 2 en Figuur 3.
    1. Wilt beginnen, selecteert u de juiste laser voor het verlichten van het monster afhankelijk van de geselecteerde fluorophore. Het systeem van de SR-GSD gebruikt in dit protocol is uitgerust met krachtige lasers (488 nm, 1,4 KW/cm 2; 532 nm, 2.1 KW/cm 2; 561 2.1 KW/cm 2 642 nm, nm, 2.1 KW/cm 2). Figuur 2 gebruikt de laser nm 642.
  2. Gebruik van een olie-immersie objectief met een hoge NA. Het systeem van de SR-GSD gebruikt hier is uitgerust met een HC PL APO 160 X / 1.43 nb doelstelling.
  3. Koos de juiste dichroïde imaging kubus. Het SR-GSD-systeem in dit protocol is uitgerust met 488 HP-T, 532 HP-T, 568 HP-T, 642 HP-T met emissie band pass filters van 505-605 nm, 550-650 nm en 660-760 nm.
  4. Selecteer de overname van de 2D-modus. De camera ingesteld op frame-modus en de blootstelling transfertijd naar 10 ms (100 Hz). Stel de EM-winst op 300. Selecteer de detectie drempel.
    Opmerking: Lage drempels produceren beelden met hoge achtergrond. Hoge drempels kunnen wegfilteren van het signaal van belang. Bepalen van de drempel op basis van negatieve controles zoals imaging coverslips van niet-transfected cellen of cellen met secundair antilichaam alleen geïncubeerd.
  5. Zet auto gebeurtenis controle en set gebeurtenissen per beelden tot en met 8.
  6. Invoeren de pixelgrootte op het tabblad GSD-acquisitie (beginnen met 10 nm of 20 nm pixelgrootte). Zorgen dat " Histogram modus " is geselecteerd in het tabblad Extra GSD onder de hoge resolutie afbeelding Berekeningsopties voor Beeldacquisitie.
  7. Beeld van de eiwitten in het plasma-membraan, de TIRF-modus selecteren en wijzigen van de hoek van de incidentie te bepalen van de indringingsdiepte.
  8. Voor het verzenden van elektronen aan de donkere staat (de zogenaamde pompen), laser intensiteit op 100% instelt.
  9. Selecteer enkel molecuul detectie terwijl het pompen en ingesteld op automatisch verkrijgen wanneer de frame correlatie is 0.20.
  10. Voor acquisitie, laser intensiteit op 50% instelt.
  11. Stelt het aantal overname frames op 60.000.
    Opmerking: De onderzoeker kan vinden dat een monster een min of meer frames dan dit vereist. Wijzigen van de frame-telling gebaseerd op observaties van fluorophore photobleaching en stop verwerving wanneer geen verdere gebeurtenissen opspoorbaar zijn.
  12. Start acquisitie.
    Opmerking: Aan het begin van de overname, alle kleurstof moleculen zijn in de fluorescerende Braziliaanse en vervolgens overschakelt naar de donker staat. Wanneer de frame correlatie 0.20 bereikt, zullen beelden beginnen te worden verworven. Wanneer minder dan 8 evenementen worden gedetecteerd per frame, zullen de 405 laser inschakelen, stimuleren van fluorophores om de overgang van de donkere staat de grondtoestand. Bij het ophalen van afbeeldingen voor een dataset van n = x cellen uit n = y dieren, parameters zoals TIRF indringingsdiepte detectie drempel en aantal frames verworven moeten constant worden gehouden.

13. Analyse van het beeld

  1. om te kwantificeren eiwit clustergrootte, gebruiken de ' analyseren deeltjes ' functie voor ImageJ.
    Opmerking: Nadere analyse kan worden uitgevoerd met behulp van stochastische optische wederopbouw relatieve lokalisatie microscopie gebaseerde analyse (STORM-RLA) of soortgelijke 13.
    1. Clusteranalyse ( Figuur 3) met behulp van ImageJ als volgt uitvoeren:
    2. openen van het afbeeldingsbestand om te worden geanalyseerd. Dit moet een 10 nm histogram enkel molecuul lokalisatie kaart zoals die worden gegenereerd in de denkbaar software (sectie 12) bovengenoemde.
    3. De helderheid en het contrast met het visualiseren van de afbeelding aanpassen: Klik op het Afbeeldingsmenu selecteren, vervolgens helderheid en contrast aanpassen. Klik op de optie auto.
    4. 8-bit het afbeeldingstype wijzigen: Selecteer het Afbeeldingsmenu, dan Selecteer type en kies van 8-bit.
    5. De schaal van de afbeelding instellen: Open het menu analyseren, klikt u op set schaal en vul de volgende parameters: afstand = 1, bekend van afstand = 10, 1 pixel = 10 nm.
    6. Als de metingen worden verkregen, opent u het menu analyseren, selecteert u set metingen, en vink het selectievakje naast de optie gebied.
    7. De drempel van de afbeelding aanpassen. Open het menu van de afbeelding, selecteer aanpassen en selecteer vervolgens drempel, boven/onder selecteren De maximale waarde naar 255 en verplaatsen de minimumwaarde op 1 en klik op toepassen.
    8. Voor het analyseren van de deeltjes, opent u het menu analyseren, selecteert u analyseren deeltjes. Schakel het selectievakje schakelt pixel eenheden, resultaten weergeven en samenvatten. Stel de grootte naar 4-infinity (aangezien resolutie ~ 20 nm), de kale contouren optie en klik op ok. Een samenvatting bestand zal worden aangemaakt die de analyse details zoals de gemiddelde clustergrootte en het aantal clusters in de afbeelding zal bevatten.
      Opmerking: Voorzichtigheid moet worden betracht bij het maken van conclusies over het aantal eiwitten binnen een bepaald cluster, als het aantal gelokaliseerde punten is niet lineair gecorreleerd met het aantal eiwitten. GSD lokaliseert kleurstoffen die zijn geconjugeerd aan antilichamen, resulterend in een koppeling-fout die verdringt de fluorescerende label uit de epitoop door > 10 nm in elke gewenste richting. Bovendien, als polyclonal antilichamen worden gebruikt, meer dan één antilichaam aan een enkele antigeen kan binden en om te verwarren de kwestie nog verder, commerciële secundaire antilichamen zijn geconjugeerd aan, gemiddeld 3-6 moleculen van kleurstof zodat een fluorophore is niet altijd gelijk een eiwit. Koppeling-fout kan worden verminderd door conjugating van een kleurstof rechtstreeks naar het primaire antilichaam (het elimineren van de secundaire) of met behulp van een nanobody gebaseerde labeling scheme 14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals vermeld in de inleiding, zijn er veel verschillende super resolutie microscopie imaging modaliteiten. Dit protocol, richt zich op GSD super resolutie beeldvorming. Representatieve beelden en lokalisatie kaarten worden weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3.

Figuur 2 toont een COS-7 cellen transfected met de ER eiwit, mCherry-Sec61β en ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De recente explosie van technologieën waarmee imaging voorbij de diffractie-limiet hebben aangeboden nieuwe Vensters in de complexiteit van zoogdieren cel signalering in ruimte en tijd. Deze technologieën omvatten STORM, STED, PALM, GSD, SIM en hun varianten (b.v., dSTORM, FPALM). De vindingrijkheid van de wetenschappers achter deze technieken hebben ons tot het omzeilen van de beperkingen die worden opgelegd door de wetten van de fysica bestuur de diffractie van licht. Ondanks deze enorme prestatie, elk van dez...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende belangen openbaar te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de AHA R.E.D. (15SDG25560035). Auteurs wil erkennen Dr Fernando Santana voor gebruik van zijn Leica SR GSD 3D Microscoop, en Dr. Johannes Hell voorziet vriendelijk het FP1 antilichaam.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
KOHThermo ScientificP250-500Om coverglas te reinigen
#1.5 coverglas 18 x 18 mmMarienfeld Superior0107032)Om cellen te laten groeien/verwerken/afbeeldingen te maken
10x PBSThermo ScientificBP3994Verdunnen tot 1x met gedeïoniseerd water
Poly-L-LysineSigmaP4832Helpt bij celadhesie aan coverglas
laminineSigma114956-81-9Helpt bij celadhesie aan coverglas
Medium 199Thermo Scientific11150-059Ventriculaire myocyt cultuur media
DMEM 11995Gibco11995Celcultuur media
Fetal bovien Serum (FBS)Thermo Scientific10437028Media aanvulling
Penicilline/streptomycineSigmaP4333Media aanvulling
0,05% trypsin-EDTACorning25-052-CLCelcultuur oplossing
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Transiente transfectie reagens
Ca2+-vrij PBSGibco1419-144Celcultuur
100% MethanolThermo Fisher ScientificA414-4Cel Fixatie
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Cel Fixatie
GlutaraldehydeSigma AldrichSLBR6504VCel Fixatie
SEAblockThermo Scientific37527BSA of andere blokkerende oplossingen zijn beschikbaar
Triton-X 100SigmaT8787Detergentia om cellen te permeabiliseren
Konijn anti-CaV1.2 (FP1)GiftN/ACommerciële anti-CaV1.2 antilichamen zijn beschikbaar zoals Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Muis monoklonaal anti-RFPRockland Inc.200-301-379Primair antilichaam
Alexa Fluor 647 donkey anti-konijn IgG (H+L)Invitrogen (Thermo Scientific)A31573Secundair antilichaam
Alexa Fluor 568 geit anti-muis IgG (H+L)Invitrogen (Thermo Scientific)A11031Secundair antilichaam
NatriumazietSigmaS2002Voorkomt microbiële groei voor langdurige opslag van monsters
CatalaseSigmaC40Fotoswitching buffer ingrediënt
Glucose oxidaseSigmaG2133Fotoswitching buffer ingrediënt
TrisSigmaT6066Fotoswitching buffer ingrediënt
beta-Mercaptoethylamine hydrochlorideFisherBP2664100Fotoswitching buffer ingrediënt
β-mercaptoethanolSigma63689Fotoswitching buffer ingrediënt
NaClFisherS271-3Fotoswitching buffer ingrediënt
DextroseFisherD14-212Fotoswitching buffer ingrediënt
Glazen depressieschuivenNeolab1 – 6293Om monsters te monteren
TwinsilPicodent13001000Om coverglas te verzegelen
sec61β-mCherry plasmidAddgene49155
Leica SR GSD 3D-microscoopLeica
ImageJ
Washing block oplossing20% SEAblock in PBS
Primair antilichaam incubatie oplossing0,5% Triton-X100, 20% SEAblock, in PBS
Secundair antilichaam incubatie oplossing1:1000 in PBS

Referenties

  1. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
  2. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  5. Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).
  6. Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302(2011).
  7. Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  9. Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
  10. Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
  11. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).
  12. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  13. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  14. Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
  15. Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
  16. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  17. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  18. Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ground State Depletion MicroscopieImaging van Gefixeerde CellenTIRF modusPhoto Switching bufferZuurstofvrije OplossingSingle Molecule DetectieBeeldkwantificeringER tubulusstructuurImaging van Cardiale Myocyten
Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.