Methodenartikel

Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer

DOI:

10.3791/56250

⸱

12 maart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een algemene strategie om te regenereren commerciële gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een label-vrije cel analyzer besparing op de hoge lopende kosten ofmicrochip gebaseerde tests gericht. Het regeneratieproces omvat de spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water, en een stap van spinnen, waardoor herhaalde gebruik van microchips.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De label-vrije cel-gebaseerde bepaling is voordelig voor biochemische studie vanwege het vereist niet het gebruik van proefdieren. Vanwege haar vermogen om meer dynamische informatie verstrekken over cellen onder fysiologische omstandigheden dan klassieke biochemische tests, dit label-gratis real-time cel assay gebaseerd op het principe van elektrische impedantie is het aantrekken van meer aandacht tijdens het verleden decennium. Echter, het praktische gebruik kan worden beperkt als gevolg van de relatief dure kosten van meting, waarbij kostbare verbruikbare wegwerp gouden microchips worden gebruikt voor de cel analyzer. In dit protocol hebben we een algemene strategie om te regenereren gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een commerciële etiket-vrije cel analyzer. Het regeneratieproces omvat spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water en een spinning-stap. De voorgestelde methode is getest en aangetoond dat het effectief is voor de regeneratie en het herhaalde gebruik van commerciële elektronische platen ten minste driemaal, die onderzoekers opslaan op de hoge lopende kosten van real-time cellen zal helpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vanwege haar efficiënte en minder arbeidsintensieve experimentele proces, label-vrije cel-gebaseerde technologie is getuige geweest van snelle groei in het afgelopen decennium voor zowel analytische als screening doeleinden, zoals in het aspect van proteomics1,2 , levering3, etc.4,5 vergeleken met traditionele biochemische methoden gericht op cel analyse, real-time label-vrije cel assay met het prototype ontwikkeld door Giaever en collega's eerder6 van de drug is gebaseerd op het beginsel van de opname van wijzigingen van het elektrische signaal op het oppervlak van de cel-ingeschrevenen microchips, die het mogelijk een Continumeting van celgroei of migratie op een kwantitatieve manier maken. Naar aanleiding van deze strategie, een real-time cel elektronische sensing (RT-CES) systeem met behulp van elektrische impedantie gebaseerde detectie beginsel werd geïntroduceerde7,8 , en meer recentelijk een commerciële real-time cel analyzer (RTCA) werd gelanceerd voor laboratorium onderzoek9.

De commerciële real-time cel analyzer voornamelijk leest de cellen evoked signalen van elektrische impedantie, die uit de fysiologische veranderingen van bebroede cellen voortvloeien, met inbegrip van celproliferatie, migratie, levensvatbaarheid, morfologie en naleving van de oppervlak van microchips10,11. Deze elektrische signalen worden verder omgezet door de analyzer een dimensieloze parameter met de naam de cel Index (CI) te beoordelen van de status van de cel. De verandering van de impedantie van microchips weerspiegelt voornamelijk de Ionische omgeving van overdekte cellen op het raakvlak van de elektrode/oplossing. Dus, de analytische prestaties van de cel analyzer leunt op de kern sensing eenheid, de wegwerp microchips (d.w.z., zogenaamde elektronische platen, bijvoorbeeld, 96/16/8-well), die zijn vervaardigd van gekleed gouden microelectrodes lithographically onderaan van incubatie putten. De gouden microelectrodes monteren in een cirkel-on-line indeling (Figuur 1) en dekking van de meeste van de oppervlakte van de incubatie putten, waarmee dynamische en gevoelige detectie van gekoppelde cellen3,12,13 ,14. De CI zal vergroten in het geval van meer oppervlakte dekking van cellen op de chip en afnemen wanneer cellen worden blootgesteld aan een veroorzaken als gevolg in apoptosis. Hoewel de real-time cel analyzer vaak gebruikt is om te bepalen van cytotoxiciteit11 en neurotoxiciteit15 en meer kinetische informatie verstrekken dan eindpunten van de klassieke methode, zijn de wegwerp elektronische platen de duurste verbruiksgoederen.

Tot nu toe zijn er geen beschikbare methoden voor de regeneratie van de elektronische plaat, die waarschijnlijk wijten aan het feit dat harde regeneratie aandoeningen, zoals piranha-oplossing of azijnzuur betrokken16,17, zijn 18, die de elektrische status van gouden microchips kunnen veranderen. Een milde en efficiënte methode om te verwijderen van de Adherente cellen en andere stoffen van het oppervlak van goud chips zullen daarom wenselijk voor het regeneratieproces elektronische plaat. Onlangs hebben we een protocol gericht op het herstel van de wegwerp elektronische platen met behulp van niet-corrosieve reagentia en de geregenereerde chips werden gekenmerkt door elektrochemische evenals optische methodes19. Met behulp van gemakkelijk beschikbaar en matige laboratoriumreagentia, met inbegrip van trypsine en ethanol, hebben we een algemene methode om te regenereren de commerciële elektronische plaat zonder bijwerkingen, die goed is toegepast op het regenereren van de twee belangrijkste soorten opgericht van elektronische plaat (16 en L8) gebruikt voor RTCA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: In het algemeen, het regeneratieproces omvat spijsvertering van de trypsine en spoeldouche stap met ethanol en water. De tijd van de spijsvertering is afhankelijk van het aantal cellen die worden gebruikt, en het type en aantal cellen gebruikt kunnen verschillen afhankelijk van de experimentele doeleinden. Het is aangeraden om te controleren de geregenereerde microchips optische en elektrochemische methoden gebruiken voor het optimaliseren van de regeneratie-voorwaarden. Tijdens het experiment, oplosbare en onoplosbare stoffen kunnen worden betrokken, en hier deze twee typische gevallen van de regeneratie-procedures zijn gedetailleerd.

1. bereiding van de oplossingen van de regeneratie

Opmerking: Voorbereiden en verwerken van alle oplossingen onder steriele omstandigheden.

  1. Bereid verse trypsine-oplossing van 0,25% (g/v). Trypsine kan worden ingekocht of vers bereid als volgt.
    1. Los 0,25 g trypsine in 100 mL pH 7.4-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Roer de oplossing tot de trypsine volledig bij 4 oC. Roer de oplossing bij lage snelheid verzorgen opgelost is om te voorkomen dat de vorming van een zeepbel.
    3. Filtreer de oplossing met een 0,22 µm filter in de kap van de bioveiligheid.
  2. 75% ethanol met behulp van absolute ethanol te bereiden. Giet de absolute ethanol 75 mL in een volumetrische maatkolf en Voeg gedeïoniseerd water toe totdat het volume 100 mL bereikt. Verdere sterilisatie uitvoeren indien nodig.

2. de incubatie en proliferatie van A549 cellen in elektronische platen

Opmerking: Elektronische plaat typen 16 en L8 zijn beide gemaakt van gekleed gouden microelectrodes lithographically onderaan van incubatie putten. Elektronische plaat 16 heeft 16 wells terwijl elektronische plaat L8 8 putten. De putten van elektronische plaat 16 zijn ronde terwijl de putjes van elektronische plaat L8 afgeronde rechthoeken. Het volume van elke elektronische plaat 8 Nou is ongeveer 830 µL en elke elektronische plaat 16 Nou is ongeveer 270 µL.

  1. De cultuur van de cel van de A549
    1. Cultuur A549 cellen in Roswell Park Memorial Instituut-1640 medium (RPMI-1640) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine in de celcultuur schotel.
    2. Passage van de cellen wanneer de celdichtheid ~ 75% bereikt dan wassen het aanhangend cellaag met 1 × PBS en trypsinize met 0,25% trypsine oplossing voor 1 min bij 37 oC. Centrifuge de cellen bij 179 × g gedurende 5 min trypsine verwijderen. Resuspendeer de cellen in 10 mL medium voor verdere cultuur of andere experimenten.
      Opmerking: De oplossing van cellen geresuspendeerde in het medium is hier aangewezen als de schorsing van de cel buffer.
    3. Neem 10 µL en het nummer van de cel met een hemocytometer rekenen. Gebruik het RPMI-1640 medium om te verder verdunnen de opschorting van de cel buffer ter voorbereiding van de opschorting van de cel van 30.000-80.000 cellen/mL buffer voor de experimenten.
  2. Proliferatie/cytotoxiciteit experiment en data-acquisitie
    1. 50 µL (150 µL voor elektronische plaat L8) cel medium aan elke incubatie goed van de elektronische plaat 16 en laat het gedurende 30 min. in het biosafety kap voor evenwichtsinstelling toevoegen. Handmatig invoegen de elektronische plaat 16 in de real-time cel analyzer in de CO2 incubator bij 37 oC.
    2. Start het real-time cel analyzer werking programma op de computer. Experimenteren op zijn standaard patroon setup-pagina, selecteer "Experiment model" en de naam van de lopende assay.
    3. Selecteer de overeenkomstige putten die zijn opgenomen in het experiment en de inbreng van de informatie zoals cel type, nummer en drug namen in de invoervakken op haar pagina lay-out. Op de pagina Schedule de experimentele stappen toevoegen en selecteer vervolgens de lopende tijd (bijvoorbeeld 12, 24 of 48 uur) van elke stap en interval van real-time data-acquisitie.
      Opmerking: Hier het interval van stap 1 en 2 zijn 1 min en 15 min daarna.
    4. Sla het bestand op en klik op "Start" knop om te meten de impedantie van de achtergrond van de media op haar celindex pagina; de resulterende gegevens zal automatisch worden afgetrokken. Op de pagina goed grafiek kan alle goed krommen bezichtigd worden. Voeg op de pagina Plot wells en de grafiek van tijd-celindex wordt getoond.
    5. Voor de cel proliferatie experiment, om te beginnen klik op "Pauze" om te onderbreken van het programma. Dan nemen de elektronische plaat en voeg 100 µL A549 cel schorsing buffer per putje bij kamertemperatuur. Laat de plaat gedurende 30 minuten in de kap van de bioveiligheid te laten de cellen regelen naar de onderkant van de incubatie wells.
    6. Handmatig invoegen de elektronische plaat in de real-time cel analyzer station. Klik op de "Start" knop om verder te gaan van het experiment.
      Opmerking: Op de pagina van de Plot, de analyzer voortdurend records celindex waarden of curven gedurende het gehele experiment.
    7. Wanneer het experiment voltooid is, voert u de Plot-pagina en open het experiment-bestand. Selecteer vervolgens alle putjes van de geteste incubatie en de resulterende celindex curves die kunnen worden gemiddeld of genormaliseerd voor de laatste keer vóór toevoegen van farmaceutische geneesmiddelen of wijzigen van middellange ter vermindering van de verschillen tussen de testen. Op de pagina van de gegevensanalyse, kan EC50 of IC50 worden berekend

3. regeneratie van elektronische platen

Opmerking: Voor elke spoeldouche stap, de oplossing in de elektronische plaat werd gemengd grondig (5 - 10 keer) met behulp van een precisiepipet.

  1. Case 1: voor de beoordeling van de cytotoxiciteit van anti -kanker drug
    1. Zaad A549 cellen op de elektronische plaat zoals beschreven in sectie 2.
    2. Los eerst de anti-kanker drug Doxorubicine hydrochloride (DOX) in het medium van de cel. Voeg langzaam DOX aan de cellen (eindconcentratie van DOX is 30 µg/mL) met behulp van een precisiepipet. De CI opnemen zoals beschreven in sectie 2.
      Opmerking: De elektronische plaat gebruikt werd hersteld onmiddellijk na het experiment compleet was. In dit geval, zoals DOX een oplosbare chemische stof is, de regeneratie van de elektronische plaat volgens het protocol is relatief gemakkelijk te hanteren en geen extra stappen nodig zijn.
    3. Regeneratie
      1. De elektronische plaat met cellen van het real-time cel analyzer station nemen. Plaats van de gebruikte elektronische plaat in een steriele bioveiligheid kap bij kamertemperatuur en meng kweekmedium grondig met behulp van een pipet. Pipetteer uit alle van het medium.
      2. Spoel de elektronische platen met 200 µL gedeïoniseerd water voor 3 keer bij kamertemperatuur.
      3. De resterende cellen op de elektronische platen met 0,25% vers bereide trypsine voor 1-2 h (200 µL per putje) in een incubator bij 37 oC. verteren Wanneer de vertering is voltooid, meng de oplossing van de incubatie 5 - 10 keer met behulp van een pipet en Pipetteer uit alle de oplossing in de kap van de bioveiligheid bij kamertemperatuur.
      4. Spoel de elektronische platen met 200 µL ethanol en 200 µL water, respectievelijk, als volgt: gedeïoniseerd water 2 keer, 100% ethanol 2 maal; 75% ethanol 2 maal; gedeïoniseerd water 2 keer. Omkeren van de elektronische plaat op een steriel gaas of een papieren zakdoekje te decanteren in de resterende water op kamertemperatuur.
      5. Ultraviolet steriliseren de geregenereerde elektronische plaat voor 1-2 h in de kap van de bioveiligheid bij kamertemperatuur.
        Opmerking: Het dubbele van het volume van alle oplossingen voor de regeneratie van elektronische plaat L8.
  2. Case 2: drug levering met behulp van mesoporous materiaal.
    1. Staafvormige mesoporous silica materialen gebruikt met een gemiddelde poriegrootte van 5.6 nm als drug delivery matrices, als eerder gemeld20.
      Opmerking: Hier, de elektronische plaat werkte om te controleren van het effect van de drug-release op cellen.
      1. Voeg mesoporous materialen in de oplossing van de incubatie van elk putje van de elektronische platen. Als kiezelzuur materialen, niet oplosbaar en neerslag in de elektronische plaat zijn, spoel de plaat als volgt:
    2. Voer stappen 3.1.3.1-3.1.3.3 als beschreven voor het geval 1.
    3. Spoel de microchips met 200 µL gedeïoniseerd water eenmaal in de kap van de bioveiligheid bij kamertemperatuur.
    4. Spoel de microchips met 200 µL absolute ethanol 2 keer bij kamertemperatuur.
    5. Spoel de microchips met 200 µL 75% ethanol eenmaal bij kamertemperatuur.
    6. Voeg 250 µL van 75% ethanol in elk putje en verzegel de elektronische plaat met de verzegeling film bij kamertemperatuur.
    7. Spin bij 114 x g gedurende 2 min en leeg de elektronische plaat. Omkeren van de elektronische plaat op een steriel gaas of een papieren zakdoekje te decanteren in de resterende water op kamertemperatuur.
    8. Herhaal stap 3.2.5-3.2.7 eens.
    9. Ultraviolet steriliseren de geregenereerde elektronische plaat voor 1-2 h in de kap van de bioveiligheid bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Verdubbelen het volume van alle oplossing wanneer L8 elektronische platen spoelen.

4. beoordeling van het Effect van de regeneratie

  1. Optische kenmerken van geregenereerde elektronische plaat oppervlak
    1. Gebruik een staal lepel om zorgvuldig het demonteren van het onderste gedeelte van de incubatie goed van vers en elektronische plaat waarin geregenereerd gekleed gouden microelectrodes. Het dragen van een plastic handschoen, zorgvuldig veeg de microchip-bevattende deel van de elektronische plaat met behulp van de stalen lepel.
    2. Plaats beide delen in het midden van het glas Microscoop dia's en het verzamelen van de resulterende Raman spectra door Raman Microscoop uitgerust met een CCD detector21.
      Opmerking: De spectrometer was uitgerust met een 633 nm laser en de spectra werd opgenomen met een interval van 30 s laser blootstelling bij een golflengte in het bereik van 500-3500 cm-1. De optische beelden werden verkregen door een Microscoop Raman met behulp van een 10 x eye-lens en de 50 x doelstelling. Figuur 1A en Figuur 1 c werden ook verkregen met behulp van het geïnstalleerde apparaat Raman Microscoop.
    3. Om te beoordelen van de levensvatbaarheid van de gekoppelde cellen na opname van de anti-kanker medicijn op het verse en geregenereerde laser elektronische platen, gebruik een confocale scanning microscoop voor het controleren van de spontane fluorescentie van DOX moleculen die door de A549 geabsorbeerd.
      1. Als u wilt opnemen van de spontane fluorescentie van geabsorbeerde DOX door de cellen (vers en geregenereerde elektronische platen met A549 cellen), gebruik olie een 63 X objectieve en 485 nm als de excitatie golflengte.
  2. Elektrochemische gedrag van geregenereerde elektroden
    Opmerking: Als handmatige dissembling van een commerciële elektronische plaat is moeilijk en niet ideaal voor de beoordeling van oppervlakte elektrische toestand zoals gecontroleerd, de efficiëntie van de regeneratie van het protocol werd beoordeeld met behulp van normale goud/glazig koolstof elektrode (GCE) als een test platform, waarop de elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS) werd uitgevoerd. De diameters van de Au-elektrode en GCE beide zijn 3 mm. elektrochemische gegevens werden verkregen door een elektrochemische analyzer met een drie-elektrode-systeem en de impedantie metingen werden uitgevoerd met behulp van een signaal van de wisselstroom (AC) van 10 mV amplitude bij een breed frequentiebereik van 100 kHz tot 0,01 Hz.
    1. Vóór de meting, gepolijste de Au elektrode en GCE een spiegel-achtig oppervlak met een drijfmest aluminiumoxide op een polijst doek, gevolgd door ultrasoonapparaat in water om alle deeltjes te verwijderen.
    2. Activeren van de Au-elektrode in 0.5 M H2dus4. Het verkrijgen van gegevens van de EIS van de kale Au elektrode en GCE in 10 mM KCl elektrolyt oplossing met 1mM K3[Fe(CN)6] beschreven22.
    3. A549 cel stockoplossing volgens 2.1.2 en 2.1.3 bereiden. 10 µL celsuspensie op het oppervlak van Au elektrode en GCE neerzet. Incubeer Au elektrode en GCE bewerkt met cellen in een 37 oC incubator voor 3 h. verkrijgen EIS gegevens van de Au-elektrode en GCE bewerkt met cellen in 10 mM KCl elektrolyt oplossing met 1 mM K3[Fe(CN)6].
    4. Regenereren de elektroden met behulp van het protocol en de maatregel EIS.
      1. Onderdompelen van de Au-elektrode en GCE bewerkt met cellen in 0,25% trypsine voor 0,5-2 h. Spoel de Au elektrode en GCE zachtjes met water 4 keer. Spoel de elektroden zachtjes met absolute ethanol 4 keer. Dompel Au elektrode en GCE in 75% ethanol voor ~ 5 min. Spoel de chips zachtjes met 75% ethanol 4 keer.
      2. Het verkrijgen van gegevens van de EIS van geregenereerde Au elektrode en GCE in 10 mM KCl elektrolyt oplossing met 1mM K3[Fe(CN)6].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oppervlakte-eigenschappen van gouden microchips: de regeneratie-procedures die in dit protocol werden geschetst in Figuur 1. Figuur 2 toont de microscopische afbeeldingen van zoet oppervlaktewater en elektronische platen geregenereerd door de optische Microscoop. Zoals aangegeven in figuur 2A en figuur 2C, microscopische opmerkingen aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We samengevat de verschillende beschikbare methoden17,23,24,25,26 voor het regenereren van microchips in tabel 1. Kortom, deze methoden betrokken relatief harde proefomstandigheden om het volledige herstel van de chips door de aanwezigheid van sterke molecuul-molecuul interacties zoals die van het immuun complex gebruikt voor SPR-chips. Barre ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (U1703118), een project gefinancierd door de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu hogeronderwijs instellingen (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programma, Open fondsen van de sleutel staat Laboratorium voor Chemo/Biosensing en Chemometrie (2016015) en het nationale laboratorium van biomacromoleculen (2017kf05) en Jiangsu Specially-Appointed Professor project, China.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Rat: Sprague-DawleyCharles RiverCat# 400
muis anti-rat CD11b monoklonaal (clone OX42)Bio-RadCat# MCA275RPanning: 1:1,000; Staining: 1:500
Geiten polyklonaal anti-Iba1 AbcamCat# AB5076Staining: 1:500
Konijn polyklonaal anti-Ki67 Abcam Cat# AB15580Staining: 1:500
Alexa Fluor Ezel anti-muis 594InvitrogenCat# 11055Staining: 1:500
Alexa Fluor Ezel anti-geit 488InvitrogenCat# A-21203Staining: 1:500
Alexa Fluor Ezel anti-Konijn 647InvitrogenCat# A-31573Staining: 1:500
Triton-X (detergens bij ICC-kleuring)Thermo FisherCat# 28313
HeparansulfaatGalen Laboratory SuppliesCat# GAG-HS01
HeparineSigma Cat# M3149
Pepton uit melkvaste stoffenSigmaCat# P6838
TGF-β2PeprotechCat# 100-35B
Muur IL-34R&D SystemsCat# 5195-ML/CF
Schapenwol cholesterolAvanti Polar LipidsCat# 700000P
Collagene IVCorning Cat# 354233
OleaanzuurCayman Chemicals Cat# 90260
11(Z)Eicosadieenzuur (Gondoïnezuur)Cayman Chemicals Cat# 20606
Calcein AM-kleurInvitrogenCat# C3100MP
Ethidium homodimeer-1InvitrogenCat# E1169
DNaseIWorthingtonCat# DPRFS
Percoll PLUSGE HealthcareCat# 17-5445-02
Trypsine SigmaCat# T9935
DMEM/F12GibcoCat# 21041-02
Penicilline/ StreptomycineGibcoCat# 15140-122
GlutamineGibcoCat# 25030-081
N-acetyl cysteïne SigmaCat# A9165
InsulineSigmaCat# 16634
Apo-transferrine SigmaCat# T1147
NatriumselenietSigmaCat# S-5261
DMEM (hoge glucose)GibcoCat# 11960-044
Dapi Fluoromount-GSouthern BiotechCat# 0100-20 
Poly-D-Lysine SigmaCat# A-003-E
Primaria Plates VWRCat# 62406-456
Voorraadreagentia reconstitutie Gebruikte concentratieOpslag
Apo-transferrine10 mg/mL in PBS 1:100-20°C
N-acetyl cysteïne5 mg/mL in H2O 1:1,000-20°C
Natriumseleniet2.5 mg/mL in H2O 1:25,000-20°C
Collagene IV200 μg/mL in PBS 1:100-80°C
TGF-b220 μg/mL in PBS 1:10,000-20°C
IL-34100 μg/mL in PBS 1:1,000-80°C
Schapenwol cholesterol1.5 mg/mL in 100% ethanol 1:1,000-20°C
Heparansulfaat1 mg/mL in H2O1:1,000-20°C
Oleaanzuur/GondoïnezuurGondoïnezuur: 0.001 mg/mL; Oleaanzuur: 0.1 mg/mL in 100% ethanol 1:1,000-20°C
Heparine50 mg/mL in PBS 1:100-20°C
Oplossingen Recept Opmerkingen
Perfusiebuffer50 μg/mL heparine in DPBS++ (PBS met Ca++ en Mg+ +)Gebruik wanneer ijs-koud
Douncing Buffer200 μL van 0.4% DNaseI in 50 mL van DPBS++Gebruik wanneer ijs-koud
Panning Buffer2 mg/mL pepton uit melkvaste stoffen in DPBS++
Microglia Groei Medium (MGM)DMEM/F12 met 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteïne, 5 μg/mL insuline, 100 μg/mL apo-transferrine, en 100 ng/mL natriumselenietGebruik ijs-koud MGM om microglia van de immunopanning schotel te scheiden.
Collagene IV CoatingMGM met 2 μg/mL collageen IV
Myeline Separatie Buffer9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS zonder Ca++ en Mg++, 9 μ

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
  2. Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
  3. Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
  4. Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
  5. Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
  6. Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  7. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  8. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
  9. Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
  10. Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
  11. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
  12. Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
  13. Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792(2011).
  14. Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
  15. Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748(2014).
  16. Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
  17. Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
  18. Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
  19. Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
  20. Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
  21. Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
  22. Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
  23. Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
  24. McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
  25. Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
  26. Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Trypsin DigestionEthanol RinseSpinning StepElectronic Plate RegenerationCell Proliferation AssayCytotoxicity EvaluationElectrochemical Impedance SpectroscopyConfocal Microscopy

Gerelateerde artikelen