Dit protocol beschrijft een algemene strategie om te regenereren commerciële gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een label-vrije cel analyzer besparing op de hoge lopende kosten ofmicrochip gebaseerde tests gericht. Het regeneratieproces omvat de spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water, en een stap van spinnen, waardoor herhaalde gebruik van microchips.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De label-vrije cel-gebaseerde bepaling is voordelig voor biochemische studie vanwege het vereist niet het gebruik van proefdieren. Vanwege haar vermogen om meer dynamische informatie verstrekken over cellen onder fysiologische omstandigheden dan klassieke biochemische tests, dit label-gratis real-time cel assay gebaseerd op het principe van elektrische impedantie is het aantrekken van meer aandacht tijdens het verleden decennium. Echter, het praktische gebruik kan worden beperkt als gevolg van de relatief dure kosten van meting, waarbij kostbare verbruikbare wegwerp gouden microchips worden gebruikt voor de cel analyzer. In dit protocol hebben we een algemene strategie om te regenereren gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een commerciële etiket-vrije cel analyzer. Het regeneratieproces omvat spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water en een spinning-stap. De voorgestelde methode is getest en aangetoond dat het effectief is voor de regeneratie en het herhaalde gebruik van commerciële elektronische platen ten minste driemaal, die onderzoekers opslaan op de hoge lopende kosten van real-time cellen zal helpen.
Inleiding
Vanwege haar efficiënte en minder arbeidsintensieve experimentele proces, label-vrije cel-gebaseerde technologie is getuige geweest van snelle groei in het afgelopen decennium voor zowel analytische als screening doeleinden, zoals in het aspect van proteomics1,2 , levering3, etc.4,5 vergeleken met traditionele biochemische methoden gericht op cel analyse, real-time label-vrije cel assay met het prototype ontwikkeld door Giaever en collega's eerder6 van de drug is gebaseerd op het beginsel van de ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: In het algemeen, het regeneratieproces omvat spijsvertering van de trypsine en spoeldouche stap met ethanol en water. De tijd van de spijsvertering is afhankelijk van het aantal cellen die worden gebruikt, en het type en aantal cellen gebruikt kunnen verschillen afhankelijk van de experimentele doeleinden. Het is aangeraden om te controleren de geregenereerde microchips optische en elektrochemische methoden gebruiken voor het optimaliseren van de regeneratie-voorwaarden. Tijdens het experiment, oplosbare en onoplosbare stoffen kunnen worden betrokken, en hier deze twee typische gevallen van de regeneratie-procedures zijn gedetailleerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Oppervlakte-eigenschappen van gouden microchips: de regeneratie-procedures die in dit protocol werden geschetst in Figuur 1. Figuur 2 toont de microscopische afbeeldingen van zoet oppervlaktewater en elektronische platen geregenereerd door de optische Microscoop. Zoals aangegeven in figuur 2A en figuur 2C, microscopische opmerkingen aa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We samengevat de verschillende beschikbare methoden17,23,24,25,26 voor het regenereren van microchips in tabel 1. Kortom, deze methoden betrokken relatief harde proefomstandigheden om het volledige herstel van de chips door de aanwezigheid van sterke molecuul-molecuul interacties zoals die van het immuun complex gebruikt voor SPR-chips. Barre .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (U1703118), een project gefinancierd door de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu hogeronderwijs instellingen (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programma, Open fondsen van de sleutel staat Laboratorium voor Chemo/Biosensing en Chemometrie (2016015) en het nationale laboratorium van biomacromoleculen (2017kf05) en Jiangsu Specially-Appointed Professor project, China.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| muis anti-rat CD11b monoklonaal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Geiten polyklonaal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Konijn polyklonaal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Ezel anti-muis 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Ezel anti-geit 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Ezel anti-Konijn 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergens bij ICC-kleuring) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparansulfaat | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparine | Sigma | Cat# M3149 | |
| Pepton uit melkvaste stoffen | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Muur IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Schapenwol cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagene IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleaanzuur | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadieenzuur (Gondoïnezuur) | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM-kleur | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimeer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsine | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicilline/ Streptomycine | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteïne | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insuline | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrine | Sigma | Cat# T1147 | |
| Natriumseleniet | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (hoge glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Voorraadreagentia | reconstitutie | Gebruikte concentratie | Opslag |
| Apo-transferrine | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteïne | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Natriumseleniet | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagene IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Schapenwol cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparansulfaat | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleaanzuur/Gondoïnezuur | Gondoïnezuur: 0.001 mg/mL; Oleaanzuur: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparine | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Oplossingen | Recept | Opmerkingen | |
| Perfusiebuffer | 50 μg/mL heparine in DPBS++ (PBS met Ca++ en Mg+ +) | Gebruik wanneer ijs-koud | |
| Douncing Buffer | 200 μL van 0.4% DNaseI in 50 mL van DPBS++ | Gebruik wanneer ijs-koud | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL pepton uit melkvaste stoffen in DPBS++ | ||
| Microglia Groei Medium (MGM) | DMEM/F12 met 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteïne, 5 μg/mL insuline, 100 μg/mL apo-transferrine, en 100 ng/mL natriumseleniet | Gebruik ijs-koud MGM om microglia van de immunopanning schotel te scheiden. | |
| Collagene IV Coating | MGM met 2 μg/mL collageen IV | ||
| Myeline Separatie Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS zonder Ca++ en Mg++, 9 μ |
Referenties
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
