Methodenartikel

RGB- en spectrale Root Imaging voor Plant fenotypering en fysiologisch onderzoek: experimentele opzet en Imaging protocollen

17.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56251

⸱

8 augustus 2017

 ,  ,  ,  , 
1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

In dit artikel

Samenvatting

Een experimenteel protocol wordt gepresenteerd voor de beoordeling van de grond gekweekte plant wortelstelsel met RGB- en Hyperspectrale beeldvorming. Combinatie van RGB-afbeelding tijd serie met chemometric informatie van hyperspectrale scant optimaliseert inzichten in plant wortel dynamiek.

Samenvatting

Beter begrip van de plant wortel dynamiek is essentieel voor de verbetering van de hulpbronnenefficiëntie gebruik van landbouwsystemen en verhogen de weerstand van gewas cultivars tegen milieu benadrukt. Een experimenteel protocol wordt gepresenteerd voor RGB- en Hyperspectrale beeldvorming van het wortelstelsel. De benadering wordt rhizoboxes gebruikt waar de planten groeien in natuurlijke grond over een langere tijd te observeren volledig ontwikkelde wortelstelsel. Experimentele instellingen zijn geïllustreerd voor het beoordelen van rhizobox planten onder waterstress en bestuderen van de rol van de wortels. Een RGB-imaging installatie is beschreven voor goedkope en snelle kwantificering van wortel ontwikkeling na verloop van tijd. Hyperspectrale beeldvorming verbetert de segmentering van de wortel van de achtergrond van de bodem in vergelijking met de RGB-kleur gebaseerd drempelmethode. De bijzondere kracht van Hyperspectrale beeldvorming is de overname van chemometric informatie over het systeem van de root-bodem voor functioneel begrip. Dit is aangetoond met hoge resolutie water inhoud mapping. Spectrale imaging is echter complexer in Beeldacquisitie, verwerking en analyse in vergelijking met de RGB-aanpak. Een combinatie van beide methoden kan een veelomvattende beoordeling gegeven van het wortelsysteem optimaliseren. Toepassingsvoorbeelden integratie van wortel en bovengrondse eigenschappen worden gegeven voor de context van plant fenotypering en planten fysiologisch onderzoek. Verdere verbetering van de beeldvorming van de wortel kan worden verkregen door het optimaliseren van de kwaliteit van de afbeelding RGB met betere verlichting met behulp van verschillende lichtbronnen en door uitbreiding van afbeelding analysemethoden op root zone-eigenschappen uit de spectrale gegevens afleiden.

Inleiding

Wortels voorzien planten zoals opslag van verschillende essentiële functies assimileert, ankerplaats van terrestrische planten uit de bodem, en de opname en het transport van water en voedingsstoffen1. Vanuit een evolutionair oogpunt, de vorming van wortel assen wordt beschouwd als een fundamentele voorwaarde voor het ontstaan van land planten2. Ondanks deze belangrijke rol, hebben historisch wortels bezet slechts een marginale positie in biologisch onderzoek. In recentere tijden, echter er is steeds meer wetenschappelijke belangstelling in plant wortelstelsel zoals blijkt uit Figuur 1.

figure-introduction-1
Figuur 1: Relevantie van wortel studies in Plantenwetenschappen.
Aantal wortel gerelateerde studies als een percentage van alle gepubliceerde plant studies in SCI tijdschriften in de afgelopen decennia. Zoekresultaat van Scopus met behulp van de trefwoorden "plant" en "plant en root". Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Twee belangrijke redenen kunnen worden veronderstelde om ten grondslag liggen aan de recente vooruitgang in het onderzoek van de wortel. Eerste, terrestrische vegetatie wordt blootgesteld aan vaker milieu benadrukt als gevolg van veranderingen in het aardsysteem3. In het kader van landbouwgewassen productie geschat wordt dat wereldwijd ongeveer 30% van het landbouwareaal wordt beperkt door water en fosfor4,5. Stress reductie van gewasopbrengst zijn een hoofdoorzaak van significante opbrengst leemtes die wereldwijd worden geschat op lagere 50% van de potentiële productiviteit voor neerslag agro-ecosystemen6. Naast lage resourcebeschikbaarheid, is dit ook gerelateerd aan arme gebruik efficiënt beheer van hulpbronnen, d.w.z. onvoldoende capaciteit van een installatie te benutten van de beschikbare middelen7. Dit resulteert in verlies van mobiele bronnen zoals nitraat die negatief van invloed kan zijn op de andere ecosystemen. De huidige wereldwijde stikstof gebruik efficiëntie wordt bijvoorbeeld geschat op 47%8. Betere resource gebruik efficiëntie via verbeterde managementmethoden en cultivars is daarom van groot belang voor zowel duurzame groei landbouwprodukten alsook wat betreft de duurzaamheid van het milieu. In deze context fabriek wortels worden beschouwd als een kerndoel voor verbeterde gewassen en bijsnijden systemen9,10.

Een tweede belangrijk achtergrond voor de recente belangstelling voor plantenwortels is technologische vooruitgang in meetmethoden. Root methoden hebben lang zijn beperkt door twee belangrijke uitdagingen: voor meting van de wortels van planten die groeien in de bodem worden geïsoleerd voor kwantificering moesten, meestal door het wassen van11, gevolg daarvan verstoringen ondergaat de architecturale rangschikking van wortel assen. In-situ wortel observatie met behulp van de opgraving methoden, waardoor het behoud van de natuurlijke ligging van de wortels in de bodem, voor Botanische beschrijving12zijn gebruikt. Nog steeds zijn zeer tijdrovend en dus niet voldoen aan de eisen van de doorvoer van vergelijkende structurele-functionele wortelsysteem analyse. Aan de andere kant werden hoge gegevensdoorvoer methoden voor root het platform meting meestal gedaan op kunstmatige media en voor seedling planten13 waar de extrapolatie naar de omgeving van de natuurlijke groei van planten is twijfelachtig14.

De recente boom van wortel onderzoek is nauw verbonden met het voorschot in imaging methoden15. Imaging benaderingen in wortel studies kan ruwweg worden ingedeeld in drie typen. Ten eerste zijn er hoge resolutie 3D methoden zoals CT en MRI16. Deze methoden zijn meest geschikt om interactie processen van plantenwortels met grond, te bestuderen, zoals droogte veroorzaakte xylem longembolie17. Meestal worden ze toegepast op relatief kleine steekproeven waar zij gedetailleerde opmerkingen maken. Een vergelijking van CT en MRI voor verschillend formaat potten en fijne wortel imaging is beschikbaar in18. Ten tweede, zijn er high-throughput beeldvormende methoden19,20. Deze methoden zijn meestal op basis van gemeenschappelijke 2D RGB beeldvorming van wortels groeien op kunstmatige media (gel, kiemkracht papier) waar hoog contrast kan relatief eenvoudig dissectie tussen wortels en achtergrond. Ze zijn geschikt voor hoge doorvoer vergelijking tussen zaailing wortel eigenschappen van verschillende gewas genotypen onder gestandaardiseerde kunstmatige groeiende voorwaarden13. Tussen deze twee benaderingen zijn rhizobox methoden: ze gebruiken 2D beeldvorming van wortels groeien in de bodem over langere periode en hebben middellange doorvoer21,22. Een recente uitdaging aan (2D) wortel imaging is te vangen ook indicatoren van wortel functionaliteit naast de beschrijving van de structuur23.

In het huidige document presenteren we de experimentele protocollen voor imaging-rhizobox root-systemen die gebruikmaken van (i) een goedkope en eenvoudige op maat gemaakte RGB imaging setup en (ii) een complexere NIR imaging setup gegroeid. Voorbeeld van de resultaten van deze twee opstellingen worden getoond en besproken in het kader van de plant fenotypering en de fysiologische plantenonderzoek.

Protocol

1. Rhizoboxen voor plantengroei

LET OP: Het experimentele systeem maakt gebruik van rhizoboxen om planten te kweken voor wortelbeeldvorming. Eerst worden het ontwerp van de boxen en het gebruikte substraat beschreven, waarna details over de vullingsprocedure worden gegeven.

  1. Ontwerp van rhizoboxen
    1. Stel rhizoboxen samen (Figuur 2>) met een achterplaat en zijframes van grijs PVC met een dikte van 15 mm. Gebruik een boxformaat van 30 mm x 10 mm. Gebruik voor het voorraam 6 mm mineraalglas, dat met metalen rails in de zijwanden wordt geschroefd aan het PVC-frame bevestigd is.
    2. Maak drie gaten in het bodemframe om afwatering van overtollig water mogelijk te maken. Deze gaten kunnen optioneel worden afgesloten met plastic schroeven.
    3. Pas voor het vullen de binnendiameter van de rhizobox aan (tussen 10 mm en 30 mm) door PC-meervoudige plaatmaterialen in te voegen. Voor de meeste gewassen wordt een binnenruimte van 10 mm aanbevolen om het gewicht van het gehele systeem te verminderen (het gewicht van de rhizobox zonder grond is 13,2 kg).

Diagram van de wandstructuur met PVC, glas, meerwandige platen; ontwerp van de afwatering; dimensies zijn aangegeven.
Figuur 2: Rhizobox-experimenteel systeem en de bijbehorende componenten.
De linkerfiguur toont de afmetingen van een rhizobox en de rechterfiguur de afzonderlijke componenten, bestaande uit een grijze PVC-achterplaat met zijframe, een voorzijde van mineraalglas, meerwandige platen voor een variabele binnendiameter en metalen hoekprofielen om het voorglas aan het achtercompartiment te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Substraat
    1. Vul de rhizoboxen met veldgrond (voor dit experiment: siltloam-topgrond van een kalkrijke chernozem) gezeefd tot een korrelgrootte van 2 mm.
    2. Open de rhizoboxen om het substraat in horizontale positie in het binnencompartiment (achterplaat met zijframes) te vullen met behulp van vooraf bevochtigd substraat. Vul horizontaal om gelaagdheid en segregatie tussen fijne en grove deeltjes te voorkomen, wat wel gebeurt bij vullen in verticale positie door het substraat door de bovenopening te gieten.
    3. Bevocht het substraat vooraf voordat u het vult. Afhankelijk van het type substraat (in het bijzonder het silt- en kleigehalte), mag een watergehalte van 0.12-0.18 cm3*cm-3 niet worden overschreden om versmeering en structuurdegradatie te voorkomen. Voeg het verschil tussen het voor-menggehalte en het doelwatergehalte toe nadat het substraat in de rhizoboxen is gevuld.
      OPMERKING: Vullen met (oven-)droog substraat en het daaropvolgende toevoegen van het volledige volume water wordt niet aanbevolen, omdat dit kan leiden tot sterke inklinking van het substraat en de vorming van grote scheuren.
  2. Voorbeeld van stapsgewijs vullen
    1. Definieer het doelwatergehalte. Hier is dit aanvankelijk ingesteld op 80% plantbeschikbaar water (PAW), waarbij planten niet lijden onder enig watertekort.
    2. Bepaal de veldkapactiteit (FC) en het permanent verwelkingspunt (PWP) van het substraat. Bepaal hier de FC met behulp van een PVC-buis met een gelijkwaardige hoogte (10 cm) als de rhizoboxen.
      1. Sluit de buis aan de onderkant af met een stop voorzien van kleine drainagegaatjes, voeg 1 cm grind toe om verstopping van de gaatjes door fijner substraat te voorkomen en vul het substraat tot dezelfde bulkdensiteit als gebruikt voor de rhizoboxen (1.3 g cm-3).
      2. Verzadig de buis met water tot er drainage optreedt en laat deze twee dagen rusten om te equilibreren (het resulterende watergehalte is per definitie gelijk aan de veldkapactiteit), terwijl de bovenopening met vershoudfolie wordt afgedekt om verdamping te voorkomen. De behaalde veldkapactiteitswaarde voor de bodem in dit experiment was 0.357 cm3 cm-3.
        OPMERKING: Het watergehalte bij PWP moet vooraf bekend zijn via standaard bodemfysische methoden (bijv. drukvatmetingen24) of via textuurgebaseerde pedotransferfuncties25. Hier is dit gelijk aan 0.12 cm3 cm-3 voor de gebruikte bodem.
      3. Bij het meten van de FC via drukvat-extractie, neem dan het watergehalte bij een matrixpotentiaal van h=-100 hPa en niet h=-330 hPa om overeen te komen met de geometrie van de rhizobox (hoogte van 10 cm = 10 hPa).
      4. Bereken het watergehalte (WC) bij 80% PAW: WC (cm3 cm-3) = 0.80 (FC-PWP) + PWP. Voor de hydraulische limieten van de hier gebruikte bodem geeft dit een volumetrisch watergehalte bij 80% PAW van 0.31 cm3 cm-3.
      5. Bereken de hoeveelheid water voor een rhizobox-volume van 2850 cm3 (30 cm breed, 1 cm binnenruimte, 95 cm hoogte, waarbij de bovenste 5 cm vrij van substraat worden gehouden voor het bewateren). Dit geeft een watervolume van 83.5 cm3, gelijk aan 83.5 g bij een waterdichtheid van 1.0 g cm-3 bij 20 °C.
    3. Definieer de bulkdensiteit (db) om de rhizoboxen te vullen. Hier ingesteld op 1.3 g cm-3, overeenkomend met waarden die typisch worden gevonden in landbouwbodems. De hoeveelheid droog substraat die nodig is om een rhizobox-volume van 2850 cm3 bij deze db te vullen, is gelijk aan 3705 g droge grond.
    4. Bevocht de droge grond vooraf tot een gravimetrisch watergehalte van 0.108 g-1 (gelijk aan een volumetrisch watergehalte van 0.14 cm3 cm-3) door 40 g water toe te voegen aan 3705 g droge grond en meng dit voorzichtig om een homogene waterverdeling te verkrijgen. Breek grotere aggregaten handmatig op om de korrelgrootte ≤ 2 mm te houden.
    5. Vul de vooraf bevochtigde grond in de geopende rhizoboxen en verdicht deze voorzichtig met een polystyreenplaat (30 x 10 x 1.5 cm) om het binnenvolume van de box te bedekken, resulterend in een homogene db van 1.3 g cm-3.
    6. Voeg de resterende hoeveelheid water (483.2 g) toe om het doelwatergehalte van 0.31 cm3 cm-3 te bereiken door dit met een plantenspuit op het oppervlak te spuiten. Zorg voor een kleine druppelgrootte om degradatie van de oppervlaktestructuur te voorkomen en een homogene bevochtiging te garanderen. Houd de box tijdens het spuiten op een balans om de hoeveelheid water die daadwerkelijk aan het substraat wordt toegevoegd te monitoren.
    7. Laat het water 10 minuten herverdelen en druk vervolgens het glas op het oppervlak en fixeer dit met de metalen zijrails. Het gemiddelde eindgewicht van de rhizoboxen met bevochtigd substraat was 17818 ± 68 g (13230 g gewicht rhizobox + 3705 g droge grond + 83 g water).
      OPMERKING: Het homogene watergehalte dat in de horizontale boxen is gevuld, zal zich herverdelen wanneer de boxen in hun uiteindelijke positie worden geplaatst, conform de resulterende potentiaalgradiënt. Dit is een fysisch proces in alle plantengroeipotten afhankelijk van hun geometrie (hoogte), en experimentatoren dienen zich bewust te zijn van de hydrauliek van hun potten26.

2. Inrichting van de klimaatkamer

  1. Rust de klimaatkamer (Figuur 3>) uit met 8 LED-lampen die een homogene verlichting van 450 μmol m-2 s-1 bieden met spectrale pieken op 40 (blauw) en 660 (rood) nm voor een optimale plantengroei.

Diagram van plantstress-experiment; LED-opstelling, weerstation, stomataire conductantie, grafiek van het dampdeficit.
Figuur 3: Klimaatkast met rhizoboxen voor stressexperiment.
(A) Linkerzicht van de gehele kamer met LED-verlichting, weerstation en pc (hier gebruikt voor het registreren van bladhygrometers); rechterzicht met een detailopname van het metalen frame waarin de rhizoboxen zijn geplaatst 45 ° hellingshoek en houten platen die worden gebruikt om het glazen venster van de rhizobox af te schermen tegen licht. (B) Stressexperiment met suikerbiet waarin vier fasen worden gecombineerd met stress door uiteenlopende atmosferische vraag (hoog/laag) en bodemwaterbeschikbaarheid (hoog/laag). De groene balken van de gemiddelde stomataire conductantie geven een indicatie van de stressrespons van de plant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Stel de omgevingsparameters in volgens de behoeften van de plant of het experiment. Gebruik hier een lichtcyclus van 14 uur licht en 10 uur donker. Tijdens de vestiging van de planten en voordat de stressbehandelingen startten, werd de temperatuur ingesteld op 20° C overdag en 15° C 's nachts, waarbij de relatieve vochtigheid op 50 ± 8% werd gehouden.
  2. Plaats de rhizoboxen onder een hoek van 45° met behulp van een geschikt metalen frame. Dit maximaliseert de wortelgroei richting het glasoppervlak als gevolg van gravitropisme.
  3. Bedek het glazen venster met een houten plaat om de wortelzone donker te houden en algengroei te voorkomen door licht dat door het glasoppervlak dringt.

3. Voorbeeldopstelling en behandelingen van suikerbiet

  1. Pre-germineer suikerbietzaadjes op nat filterpapier gedurende drie dagen bij 20 °C in een incubator totdat de wortel opkomt. Dit garandeert dat er levensvatbare planten worden gezaaid.
    OPMERKING: Pre-germinatie is niet nodig voor planten met een hoge kiemkracht, waardoor het risico op beschadiging van de wortel tijdens het zaaien wordt vermeden. Voor suikerbietzaadjes met een dik pericarp is het risico op niet-levensvatbare zaden echter hoog en versnelt pre-germinatie het verschijnen van de wortel aanzienlijk in vergelijking met direct zaaien in de bodem.
  2. Boor met een schroevendraaier een klein gaatje tot een bodemdiepte van ongeveer 1,5 cm in het midden van de rhizobox, plaats er één zaadje in met een pincet waarbij de wortel naar beneden is georiënteerd en zich naast het glazen venster bevindt (dit verbetert de initiële zichtbaarheid) en bedek dit voorzichtig met grond.
  3. Voeg een laag van 0,5 cm fijn grind (2-4 mm) bovenop de grond toe om de bodemaggregaten te beschermen tegen verslapping tijdens irrigatie en om verdampingsverliezen te verminderen. Houd om het opkomen te vergemakkelijken het grondoppervlak vrij van grind op de plek waar het zaadje is geplaatst.
  4. Voeg 10 g water toe om de vestiging te bevorderen.
  5. Irrigeer de rhizoboxen tijdens de vestiging en vroege groei tot aan het begin van de experimentele stresstbehandelingen elke 2-4 dagen om het initiële vochtgehalte van 80% PAW te handhaven.
    1. Bepaal de benodigde hoeveelheid irrigatiewater door de rhizoboxen te wegen en water toe te voegen tot het oorspronkelijke gewicht van elke individuele box is bereikt. Gebruik bij handmatige irrigatie een pipet om degradatie van de oppervlaktestructuur tijdens het bewateren te voorkomen.
  6. Plaats de rhizoboxen volgens het vastgestelde ontwerp in de klimaatkamer. Het hier beschreven protocol is gebaseerd op een experiment met zes suikerbietcultivars in vijf herhalingen in een volledig gerandomiseerd ontwerp (CRD).
    1. Herschik de rhizoboxen telkens wanneer ze uit de metalen houder worden gehaald voor het wegen en bewateren. Dit voorkomt eventuele effecten van residuele (licht)inhomogeniteit in de klimaatkamer.
  7. Definieer het tijdstip voor de start van de stressbehandelingen en het type stress. De volgende instellingen (Figuur 4) worden hier gebruikt.
    1. Start de metingen bij BBCH 15 (vijf onvoltooide bladeren) waarbij de wortels ongeveer 75% van de rhizoboxdiepte beslaan en het bladerdek voldoende ontwikkeld is voor metingen aan de bladeren. Houd elke fase gedurende ten minste drie dagen aan om adaptatie aan de nieuwe instellingen te garanderen en voer de meting uit.
    2. Houd voor de waarnemingen zonder stress de initiële instellingen aan met optimale bodemvochtigheid (80% PAW) en omgevingscondities (20° C/15° C temperatuur, 50 ± 8% rH), wat resulteert in een dagelijks dampdruktekort (VPD) van 1,28 ± 0,1 kPa (cf. Figuur 3 C).
    3. Verhoog de atmosferische vraag naar een dagelijkse VPD van 2,45 ± 0,4 kPa door de temperatuur te verhogen naar 27°C/20°C en de rH te verlagen naar 35%, terwijl de bodemvochtigheid op 80% PAW wordt gehouden.
    4. Droog vervolgens de rhizoboxen uit tot 40% PAW, wat overeenkomt met een watergehalte van 0,215 cm3 cm-3, door de irrigatie stop te zetten. Herstel de initiële omgevingscondities met een lage atmosferische vraag (VPD van 1,28 kPa).
    5. Combineer de stressfactoren door de atmosferische vraag te verhogen naar een VPD van 2,45 kPa en de bodemvochtigheid op 40% PAW te houden.

4. Wortelbeeldvormingsmethoden

  1. Combineer beeldgevingsmethoden om gebruik te maken van hun respectievelijke voordelen en afhankelijk van de beoogde informatie.
    1. Pas RGB-beeldgeving toe in het VIS-bereik om wortelgroei, architectuur en morfologie in de tijd te volgen, wat impliciet frequente metingen vereist. Voordelen van RGB-beeldgeving zijn (i) lage kosten, (ii) snelle beeldacquisitie, (iii) geringe eisen aan hardeschijfruimte (beeldgrootte: 48 MB) en (iv) een hoge resolutie (3648 x 5472 pixels).
    2. Gebruik hyperspectrale beeldgeving (HSI) in het NIR-bereik wanneer chemometrische kenmerken van wortel en bodem vereist zijn. Voordelen zijn (i) spectrale kenmerken voor segmentatie tussen wortels en de bodemachtergrond en (ii) toegang tot fysisch-chemische systeemeigenschappen (bijv. bodemwatergehalte, wortelleeftijd). Nadelen zijn (i) een langere scantijd (ongeveer 16 minuten per rhizobox), (ii) een grote omvang van de datasets (13,7 GB per rhizobox-beeld) en (iii) een lagere resolutie van de NIR-camera (320 x 256 pixels), en (iv) een hogere complexiteit van de data-analyse.
  2. RGB-wortelbeeldgeving
    1. Gebruik een beeldgevingsbox (Figuur 4) die afschermt van omgevingslicht en de camerapositie fixeert, bestaande uit een metalen frame met een breedte van 1 m en een hoogte van 1 m met zijwanden bekleed met hardboard. Fixeer aan de voorzijde de camera op twee posities op een afstand van 80 cm van de rhizobox.
      1. Bevestig een meetlint op het frame van de rhizobox met transparante plakband en plaats de rhizobox in de houder van de beeldgevingsbox.
      2. Verlicht de rhizobox met vier fluorescerende lichtbuizen van 24 W, bevestigd op een afstand van 80 cm van de rhizobox. Monteer daarnaast vier UV-buizen van 15 W op 20 cm van de rhizobox als alternatieve verlichting, gebruikmakend van wortel-autofluorescentie in geval van een laag contrast tussen de wortel en de (lichtgekleurde) achtergrond van het substraat.
      3. Neem twee beelden (boven- en onderpositie) om de bovenste en onderste helft van een rhizobox te bestrijken met een overlap van ongeveer 3 cm.
    2. Verkrijg RGB-beelden met een digitale spiegelreflexcamera die met snelkoppelingen is bevestigd op de respectievelijke posities van de beeldgevingsbox.
      1. Pas de volgende instellingen toe bij gebruik van de fluorescerende lichtbuizen. Pas deze voorbeeldinstellingen aan bij eventuele wijzigingen in afmetingen en verlichting, alsook bij het cameramodel.
        1. Schakel de autofocus en stabilisator van het cameralens uit. Zet de camera in de handmatige modus.
        2. Stel de ISO-waarde in op 50. Stel de sluitertijd in op 13. Stel het diafragma in op 5,6.
        3. Schakel de spiegelvertraging uit. Stel de witbalans in op Automatische Witbalans.
      2. Gebruik de volgende instellingen voor verlichting met UV-buizen:
        1. Schakel de autofocus en stabilisator van het cameralens uit. Zet de camera in de handmatige modus.
        2. Stel de ISO-waarde in op 100. Stel de sluitertijd in op 13. Stel het diafragma in op 5,6.
        3. Schakel de spiegelvertraging uit. Stel de witbalans in op Fluorescentie.
    3. Voeg de RGB-beelden van de boven- en onderkant van de rhizobox samen tot één beeld in een fotobewerkingsprogramma (bijv. Adobe Photoshop). Gebruik het meetlint aan het zijframe van de rhizoboxen en controleer overlappende objecten (wortel- en bodemkenmerken).
      1. Kopieer de twee afzonderlijke beelden, elk met een pixelgrootte van 3648 x 5472, naar een nieuw bestand van 3648 x 1094 pixels met een witte achtergrond.
      2. Verlaag de laagopaciteit van één beeld naar 60% en lijn de overlappende delen van de beelden uit (meetlint, objecten). Herstel daarna de laagopaciteit naar 10%.
      3. Voeg op basis van de liniaal op het beeld twee rode lijnen van precies 1 cm toe aan de bovenkant van het beeld waar geen wortels aanwezig zijn. Deze lijnen worden later bij de beeldanalyse gebruikt om het beeld naar de correcte lengteafmetingen te schalen.
      4. Voeg alle lagen samen en verwijder delen van het beeld buiten het met grond gevulde venster met de bijsnijtool.
      5. Sla het beeld op als tiff-bestand voor verdere analyse.
      6. In het geval van beelden met UV-verlichting, reduceer de kleuren naar grijswaarden vóór het opslaan via de werkbalk Aanpassingen-Zwart-wit, en selecteer het vooraf gedefinieerde filter Hoog contrast blauw.
    4. Voor segmentatie tussen wortels en de bodemachtergrond, alsook voor kwantificering van relevante wortelkenmerken (bijv. lengte, oppervlakte, diameter, vertakking), gebruik software voor wortelanalyse (zie www.plant-image-analysis.org voor beschikbare tools). Hier wordt WinRhizo gebruikt.
      1. Open het tiff-beeld van de rhizobox in de software.
      2. Kalibreer de lengteschaal van het beeld met de schaalbalken die aan het beeld zijn toegevoegd.
      3. Selecteer Based on Color in het Analysis-menu, waarbij Root & Background Distinction wordt gekozen.
      4. Definieer een kalibratiebestand met kleurklassen die overeenkomen met wortels en bodem (achtergrond). Voor de hier gebruikte voorbeeldbeelden (cf. Figuur 8) worden drie wortelkleurklassen (oude zijwortels, jonge zijwortels, hoofdwortel) en drie bodemkleurklassen gedefinieerd.
      5. Selecteer voor de grijswaardenbeelden (UV-verlichting) (i) Based on grey levels en (ii) Pale Root on Black Background in het Root & Background Distinction-menu en gebruik een lokale Lagarde-intensiteitsdrempel voor segmentatie.
      6. Open een databestand waarin de resultaten worden opgeslagen.
      7. Voer de analyse uit en controleer vervolgens of er regio's zijn (bijv. aan de randen) die niet correct zijn toegewezen. Definieer in dat geval een uitsluitingsregio en start de analyse opnieuw. Voeg voor niet-geclassificeerde wortels extra kleurklassen toe en start de analyse opnieuw. Activeer/verhoog voor elementen die onterecht als wortels zijn geclassificeerd de filteropties Debris & Rough Edges.

Plant-beeldvormingsopstelling met UV- en halogeenlampen; rhizoboxhouder, cameramontages voor wortel- en kroonanalyse.
Figuur 4: Beeldvormingsbox voor het maken van RGB-foto's van rhizoboxen.
Linkerweergave van de voorzijde waar de rhizoboxen zijn bevestigd voor beeldvorming met lichtbronnen binnenin; rechterweergave van de achterzijde waar de camera is gemonteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Hyperspectrale wortelbeeldvorming
    1. Hardware-installatie
      1. Gebruik een hyperspectraal wortelbeeldingssysteem (Figuur 5) bestaande uit (i) een thermo-elektrisch gekoelde 14-bits monochrome NIR-camera met een spectraal bereik van 900 nm tot 170 nm, 320 bij 256 pixels en een framerate van 10 Hz en (ii) een beeldspectrograaf met een spectraal bereik van 900 nm tot 250 nm en een spectrale resolutie van 3,6 nm. Plaats een halogeen lijnverlichtingsbron (vier halogeenspots van 50 W) in een 45°/-45° geometrie. Monteer de beeldsensor op een tweassig positioneringssysteem. Het scanvenster heeft een afmeting van 240 x 10 mm, wat betekent dat aan elke zijde van de rhizobox 30 mm niet door het beeld worden gedekt.
      2. Bestuur het systeem met een Matlab-script voor (i) wit- en donkerstandaardacquisitie, (ii) instellen van de integratietijd van de camera, (iii) selecteren van de ruimtelijke resolutie (pixelgrootte 0,1 mm; pixelgrootte 1,0 mm) en spectrale resolutie (alle 2 spectrale banden met een resolutie van 3,6 nm; afgevlakt spectrum met 54 banden en een resolutie van 14,8 nm), en (iv) definiëren van het scangebied op de rhizobox.
      3. Sla afbeeldingen op als SIF-bestanden. Om problemen bij het opslaan van grote bestanden te voorkomen, wordt elke gescande beeldbaan (9 banen per rhizobox) onderverdeeld in vier segmenten (drie van 30 mm lengte, één van 10 mm lengte), die afzonderlijk worden opgeslagen met een unieke bestandsnaam bestaande uit het baannummer (1 tot 9) en het deel (1 tot 4), evenals de datum en tijd (JJ.MM.DD UU:MM:SS). Een volledige scan van een rhizobox vereist 13,7 GB aan hardeschijfruimte.
    2. Beeldacquisitie en -analyse.
      OPMERKING: Figuur 6 toont de stappen van beeldacquisitie, segmentatie en analyse.
      1. Beeldacquisitie omvat de selectie van camerainstellingen voor een optimale beeldkwaliteit en de definitie van scanparameters.
        1. Bepaal de integratietijden van de camera voor de rhizobox-scan en de witte standaard in de camerasoftware.
          1. Open de GUI voor beeldvorming en verplaats de camera naar een positie in de rhizobox waar wortels aanwezig zijn.
          2. Pas de integratietijd van de camera aan bij het richten op een licht object (bijv. een wortel), zodanig dat ongeveer 85% van het volledige dynamische bereik van de camera wordt benut op het door de software weergegeven histogram. Herhaal dit voor de witte standaard door het positioneringssysteem van de camera te verplaatsen om op de witte standaard te richten. Sluit vervolgens de camerasoftware.
        2. Open de Matlab Imaging GUI en stel alle instellingen in voor de huidige rhizobox-scan. Gebruik voor de hier gerapporteerde gegevens de volgende instellingen:
          Integratietijd wit standaard: 10
          Integratietijd rhizobox: 40
          Spectrale resolutie: Volle resolutie (d.w.z. 2 smalbandige spectrale banden)
          Volledige ruimtelijke resolutie (pixelgrootte van 0,1 mm)
          1. Verkrijg de donkere en witte standaarden voor elke beeldsessie, bijvoorbeeld één keer per dag. De donkere standaard vertegenwoordigt de cameraruis, terwijl de witte standaard de maximale reflectiviteit aangeeft. Deze gegevens zijn vereist voor beeldnormalisatie tijdens de voorbewerking.
          2. Definieer of de volledige rhizobox of slechts een deel daarvan wordt gescand. In het huidige geval worden de volledige rhizoboxen afgebeeld. Start vervolgens de scan.
      2. Verwerk de afbeelding met een Matlab-script. De bewerkingen die door het script worden uitgevoerd, worden beschreven.
        OPMERKING: De scripts bevinden zich momenteel in een ongedocumenteerde versie en kunnen worden opgevraagd bij de corresponderende auteur. Na volledige documentatie zullen ze beschikbaar zijn voor download via de website van de instelling van de corresponderende auteur (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Stel een volledige beeldreeks samen vanaf het centrum van de rhizobox (met de wortels) door de vier delen van de reeks samen te voegen.
          OPMERKING: In dit stadium is het noch noodzakelijk, noch aanbevolen om een spectraal beeld van een volledige rhizobox te gebruiken (d.w.z. alle 9 strides), aangezien de bestandsgrootte elke berekeningsstap in Matlab zeer tijdrovend zal maken en de informatie in één centrale stride voldoende is voor de eerste stappen van de beeldanalyse.
        2. Normaliseer de afbeelding met behulp van de verkregen donkere en witte standaarden, rekening houdend met de verschillende integratietijden van de witte standaard en de rhizobox-scans, die tijdens het scannen automatisch in een bestand worden opgeslagen.
        3. Pas optioneel een smoothingfilter toe om ruis uit de afbeelding te verwijderen. Het script biedt momenteel mediaanfiltering met een 3x3-kernel en correctie voor meervoudige verstrooiing. Voor de hier gepresenteerde beeldevaluatie zijn geen filters toegepast.
        4. Toon de afbeelding in alle geregistreerde spectrale banden om een eerste inzicht te verkrijgen en bepaal een golflengte om weer te geven voor het selecteren van regio's van interesse (vergl. beeldsegmentatie).
      3. Voer de segmentatie tussen wortels en de bodemachtergrond uit in een apart script met de volgende stappen.
        1. Select geïnteresseerde gebieden (ROI) voor wortel en bodem om spectrale kenmerken voor segmentatie te vinden. Gebruik het instrument voor vrije selectie om een ROI te markeren op het beeld dat wordt weergegeven bij een golflengte die eerder is geïdentificeerd met een goed contrast tussen wortels en bodem. Gebruik hier drie ROI's op de wortel (oude en jonge zijwortels, penwortel) en twee ROI's in de bodem (droog gebied, nat gebied).
        2. Toon een rechthoek met de geselecteerde ROI's en het overige gedeelte als een zwart masker, en visualiseer de geselecteerde ROI-afbeelding bij alle golflengten.
        3. Verwijder alle regels in de beeldimmatrix die pixels bevatten met een spectrale intensiteit = 0 (zwarte pixels).
        4. Voeg de root- en soil-ROI's samen tot één voorgrond- (wortel) en één achtergrondmatrix (bodem) voor segmentatie.
        5. Zoek naar spectrale banden (intensiteit van enkelvoudige spectra of spectrale ratio's) die de beste scheiding bieden tussen de wortelvoorgrond en de bodemachtergrond27Kwantificeer het onderscheid tussen de resulterende pixelhistogrammen voor wortel en bodem met behulp van de Bhattacharyya-afstand28.
        6. Selecteer een drempelwaarde voor de intensiteit die de histogrammen scheidt.
        7. Creëer een binair beeld door de geselecteerde drempelwaarde op het originele beeld toe te passen. Hierdoor worden alle pixels met een lagere intensiteit dan de drempelwaarde op nul gezet en pixels met een hogere intensiteit op één (dit gebeurt automatisch door het script).
        8. Sla het binaire beeld op als tiff-bestand.
      4. Open het binaire beeld en analyseer de worteleigenschappen. Selecteer (i) Op basis van grijswaardenen (ii) Bleke wortel op zwarte achtergrond in de Wortel & Onderscheid van de achtergrond menu en gebruik globale intensiteitsdrempel (de afbeelding is reeds gebinariseerd).
      5. Voor het in kaart brengen van het watergehalte op basis van de hyperspectrale gegevens dient een kalibratieset te worden verzameld en een kalibratievergelijking op een rhizobox-beeld te worden toegepast.
        1. Verdeel een rhizobox in compartimenten van 5 cm met behulp van polystyreenvellen om ze te vullen met grond (dezelfde substraat en db zoals gebruikt voor het experiment) bij verschillende watergehaltes (Figuur 8).
        2. Bereken de respectieve hoeveelheden water die met de bodem moeten worden gemengd en vul de compartimenten (dezelfde procedure als beschreven in 1.3. voor de gehele rhizobox).
        3. Scan de kalibratierhizobox met dezelfde instellingen als gebruikt voor de beplante rhizoboxen.
        4. Voer de volgende stappen uit met behulp van een script.
          1. Voeg de vier delen van een scan vanuit de waterkalibratiebox samen tot één scan en normaliseer deze met donkere en witte standaarden.
          2. Selecteer rechthoekige kaders bij elk compartiment met een verschillend watergehalte en sla deze op in een structuur-array.
          3. Bepaal de spectrale eigenschap die de compartimenten van het watergehalte het best scheidt. Dit wordt gedaan met een zoekalgoritme voor het globale maximum van de intensiteitsverschillen tussen gemiddelde spectra van opeenvolgende watergehaltes.
          4. Bereken de gemiddelde spectrale intensiteitswaarde voor deze feature voor elk watergehaltecompartiment van de kalibratierhizobox.
          5. Pas een regressievergelijking toe op het direct gemeten watergehalte en de respectievelijke spectrale kwantificator.
          6. Pas de regressievergelijking toe op elke pixel op een rhizobox-afbeelding die niet als wortel is geclassificeerd en voor de spectrale eigenschap (band) die hierboven is bepaald als de beste relatie met het watergehalte.

Opstelling van de spectrograaf voor optische analyse; halogeenverlichting, rhizobox, aansturingseenheid voor vermogen/beweging.
Figuur 5: Hyperspectrale wortelscanner.
De belangrijkste componenten van de scanner zijn aangegeven. De kleine afbeelding toont de camera tijdens de beeldvorming van een rhizobox. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Diagram van hyperspectrale beeldanalyse: acquisitie-opstelling, segmentatie, watermapping, chemometrische analyse.
Figuur 6: Stappen in hyperspectrale wortelbeeldvorming.
Hyperspectrale wortelbeeldvorming bestaat uit drie hoofdstappen, namelijk (i) beeldacquisitie, (ii) beeldsegmentatie en (iii) analyse van de spectrale gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zaadkiemexperiment; vochtgradiënten op polystyreen en kiempapier.
Figuur 7: Rhizobox voor waterkalibratie.
De rhizobox bevat compartimenten met substraat bij verschillende watergehaltes, die door polystyreenplaten van elkaar zijn gescheiden. Kiempapier in de droge compartimenten voorkomt dat bodemdeeltjes in aangrenzende compartimenten spoelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Toepassingsvoorbeelden

OPMERKING: Kwantitatieve wortelinformatie wordt toegepast in de context van plantfenotypering (vergelijking van cultivars) en voor plantenfysiologisch onderzoek. De volgende bovengrondse gegevens worden gerapporteerd om deze gevallen te illustreren.

  1. Bladoppervlak: Meet het bladoppervlak op niet-destructieve wijze tijdens geselecteerde stadia van het experiment via de lengte en breedte van de bladeren als proxy. Alternatief kunnen canopy-afbeeldingen worden gebruikt29.
    1. Meet aan het einde van het experiment de bladlengte en -breedte samen met het oppervlak van afgeknipte bladeren met behulp van een bladoppervlakmeter. Calibreer de niet-destructieve methode door een regressievergelijking toe te passen op de dataparen.
  2. Droge stof: Meet aan het einde van het experiment de bovengrondse droge stof door de planten met een schaar af te knippen en deze 24 uur gedurende 105 °C in een oven te drogen.
  3. Stomataire conductantie: Meet de stomataire conductantie met een bladporometer. Bewaar het apparaat vóór de meting ten minste één uur in de klimaatkamer om de sensoren te laten equilibreren met de omgevingscondities en calibreer het apparaat telkens wanneer de omgevingsinstellingen in de klimaatkamer worden gewijzigd. Voer metingen uit bij ten minste drie bladeren per plant.

Resultaten

Voorbeeldresultaten worden gepresenteerd voor wortelsegmentatie op basis van RGB- en HS-beeldvorming. Voor spectrale beeldvorming wordt een voorbeeld van hoge-resolutie watermapping gegeven. Ten slotte worden resultaten getoond die de wetenschappelijke context demonstreren waarin beeldgebaseerde wortelgegevens worden toegepast.

RGB-gebaseerde wortelmeting

Figuur 8 toont een RGB-tijdreeks van wortelbeelden van suikerbieten cultivar Ferrara. De beelden vertonen enkele artefacten door inhomogene verlichting van de rhizoboxen, met lichtere gebieden langs de linkerkant en een verschillende helderheid in het overlappende gebied tussen de bovenste en onderste beelden.

RGB-studie naar wortelgroei, suikerbiet 'Ferrara', dag 20-35, time-lapse-analyse, groeidiagram.
Figuur 8: Tijdserie van wortelgroei op basis van RGB-beeldvorming.
De afbeeldingen tonen de suikerbietcultivar Ferrara op verschillende dagen na zaaien (DNS). De beelden vertonen enkele artefacten als gevolg van niet-homogene verlichting aan de linkerzijde van de afbeelding en tussen de bovenste en onderste beelden. Schaalbalken, 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9 geeft details over wortelsegmentatie op basis van kleurthresholding voor het ras Ferrara op 35 dagen na zaaien (DAS). Als referentie (Figuur 9A) is een binair beeld gebruikt waarbij alle wortels handmatig met een grafisch tablet zijn gevolgd. De tijd die nodig was voor het handmatig volgen van het volledige, volledig ontwikkelde, dichte wortelstelsel van de suikerbiet was ongeveer vier uur. Figuur 9B biedt een gedetailleerd beeld van een geselecteerd gebied aan de bovenkant van de afbeelding waar oude zijwortels aanwezig zijn. Hier worden verschillende wortelassen niet geclassificeerd door de kleurthreshold. Onderaan (Figuur 9C) daarentegen, waar witte jonge wortels overheersen, classificeert de op kleur gebaseerde segmentatie alle wortelassen correct. Het gebinariseerde wortelstelsel (Figuur 9D) vertoont aan de linkerkant een zwart gebied door een belichtingsartefact, dat als uitsluitingsgebied is gedefinieerd vóór het uitvoeren van de kwantitatieve analyse. Figuur 9E toont de bijbehorende pixelhistogrammen van geselecteerde kenmerken (wortels versus bodem) voor het rode kanaal van de RGB-afbeelding van Ferrara op DAS 35. De wortelpixels (blauwe kleur) vertonen duidelijk drie pieken die overeenkomen met heldere jonge zijwortels, donkere oude zijwortels en de penwortel. De overlap tussen de oude zijwortels en de bodemachtergrond is zeer sterk, wat leidt tot ongeclassificeerde wortelassen (cf. Figuur 9B).

Diagram voor wortelsegmentatie op basis van RGB-kleuren met histogramanalyse van worteltypen en bodemdifferentiëring.
Figuur 9: Wortelsegmentatie met behulp van een kleurthreshold.
(A) Handmatig gesegmenteerd wortelstelsel met behulp van een grafisch tablet, (B) gebied met slecht gesegmenteerde oude wortelasjes in de boven- en (C) correct gesegmenteerde jonge assen onderaan de afbeelding, en (D) binair beeld verkregen uit kleurgebaseerde drempelwaardeanalyse. (E) Pixelhistogrammen voor geselecteerde kenmerken van de RGB-afbeelding. Wortels worden weergegeven door de blauwe balken, waarbij verschillende worteltypen zijn aangegeven; bodem wordt weergegeven door de rode balken. Schaalbalken in A en D, 2 cm; schaalbalken in B en C, 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resulterende totale zichtbare wortellengte gekwantificeerd voor de handmatig gesegmenteerde referentieafbeelding is 1534.1 cm, terwijl de geautomatiseerde, op kleur gebaseerde segmentatie een totale wortellengte van 1427.6 cm geeft.

Grijswaardenbeelden verkregen via UV-verlichting bieden in het hier getoonde geval geen voordeel en presteerden slechter in vergelijking met kleur-thresholding (wortellengte: 1679,7 cm). Oude wortels konden niet worden gesegmenteerd en er was meer ruis in het beeld, waarschijnlijk door de lagere lichtintensiteit van de UV-lampen. Echter, in het geval van jonge wortels met een hoge autofluorescentie en een helder achtergrondsubstraat, kan UV-verlichting nog steeds een optie zijn, zoals blijkt uit een beeld verkregen uit een ander experiment waarbij zand als achtergrondsubstraat werd gebruikt (Figuur 10).

Fluorescentiemicroscopie; wortelstructuur; links: blauwgetinte confocale opname, rechts: brightfield-opname.
Figuur 10: UV-verlichting om wortels te visualiseren op een heldere achtergrond.
Voorbeeld van een wortelstelsel van harde tarwe dat groeit in een rhizobox gevuld met kwartszand. De rhizobox is gefotografeerd met verlichting voor (A) UV-licht en (B) fluorescerend (dag)licht. Schaalbalken, 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

HSI-gebaseerde wortelmetingen

Figuur 1 toont de gemiddelde spectra voor drie root ROI's (oude en jonge zijwortels, penwortel) en twee bodem ROI's (boven- en onderkant van de rhizobox).

Grafiek van de spectrale analyse van de wortel, genormaliseerde reflectantie versus golflengte, vergelijkingen tussen bodem en wortel.
Figuur 11: Gemiddelde spectra van wortel en bodem.
Spectra van interessegebieden (ROIs) op de wortel (drie worteltypen) en in de bodem (boven- en onderkant van de rhizobox). De ROI's zijn geselecteerd om een optimaal segmentatiecriterium tussen wortel en bodem te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het is duidelijk dat de penwortel en jonge zijwortels aanzienlijk verschillen van de achtergrond in de intensiteit van de meeste spectrale banden. Voor de oude zijwortels zijn de intensiteitsverschillen veel kleiner. Een kenmerk dat visueel kan worden afgeleid, is de verschillende helling van het spectrum rond het waterabsorptiegebied (1450 nm). Hier is de helling van de wortelspectra hoger in vergelijking met de bodemspectra. Bovendien kan een verandering in de spectra van de penwortel en jonge zijwortels worden geïdentificeerd in het gebied rond 10 nm, die niet voorkomt bij de oude zijwortels.

Figuur 12A toont het resultaat van het zoekalgoritme dat een spectrale ratio met het sterkste contrast tussen voorgrond en achtergrond identificeert. De ratio van spectra bij 1476 nm ten opzichte van 1076 nm biedt de beste scheiding tussen wortels en bodem. Het resulterende histogram van wortelvoorgrond- en bodemachtergrondpixels is weergegeven in Figuur 12B>. Hoewel er enige overlap is, zijn de meeste pixels duidelijk gescheiden van de bodemachtergrond. Door een bimodale Gaussische curve door het histogram te fitten en de afstand van Bhattacharyya voor kwantificering te gebruiken, wordt een waarde van 7,80 verkregen. Een waarde hoger dan 3,0 duidt op een sterk beeldcontrast, waardoor een betrouwbare scheiding mogelijk is28.

Spectrale heatmap en histogram voor analyse van golflengte-intensiteit; analyse van optische emissiegegevens.
Figuur 12: Verschil in reflectie tussen de wortel op de voorgrond en de bodem op de achtergrond voor verschillende spectrale bandverhoudingen en pixelhistogram bij de spectrale verhouding die is gebruikt voor segmentatie.
(A) Helle kleuren (geel) tonen een hoog contrast tussen voorgrond en achtergrond, donkere kleuren (blauw) tonen een laag contrast. De eerste 15 banden zijn verwijderd vanwege ruis. De rode lijnen geven de bandratio aan met het hoogste contrast. (B) Pixelhistogram van wortels (blauw) en bodem (rood) bij de spectrale ratio voor segmentatie. Blauwe balken representeren de wortel en rode balken de bodem. De intensiteitswaarde komt overeen met de ratio van spectrale band 160 ten opzichte van spectrale band 49. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het binaire beeld (Figuur 13) is gemaakt door een globale intensiteitsdrempel toe te passen op de geïdentificeerde spectrale ratio met een waarde van 1,08, berekend op basis van de histogramafstand27. Analyse van de wortellengte van dit beeld geeft een totale lengte van 1557,3 cm, wat een fout van slechts 1,5% vertegenwoordigt in vergelijking met het handmatig gevolgde referentiebeeld.

Diagram van de neurale netwerkstructuur; dendritische boom; microscopiebeeld; visualisatie van neuronale connectiviteit.
Figuur 13: Binair beeld van het wortelstelsel van suikerbietcultivar Ferrara.
De afbeelding is verkregen door een globale spectrale drempelwaarde toe te passen. Schaalbalk (linksonder), 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hoewel wortelsegmentatie is verbeterd door het gebruik van spectrale informatie vergeleken met informatie op basis van kleur, is het hoofddoel van HS-beeldvorming de analyse van chemometrische beeldeigenschappen. Dit wordt geïllustreerd door het in kaart brengen van het watergehalte van een rhizobox-beeld.

Figuur 14A toont de gemiddelde spectra van de compartimenten in de kalibratierhizobox (vgl. Figuur 7) gevuld met bodem met verschillende watergehaltes. De vorm van de spectra is vergelijkbaar tussen de compartimenten; een spectrale ratio biedt hier dus niet noodzakelijkerwijs een stabieler classificatiecriterium. Daarom is de intensiteit bij een enkele spectrale band (1680 nm), waar het gemiddelde verschil tussen aangrenzende watergehaltes maximaal is, geïdentificeerd als het beste scheidingscriterium. De resulterende pixelhistogrammen voor deze spectrale golflengte worden getoond in Figuur 14B.

Grafieken van spectrale analyse; (A) absorptiespectra, (B) intensiteitsverdeling voor natte-droge toestanden.
Figuur 14: Spectrale kenmerken voor kalibratie van het watergehalte.
(A) Gemiddelde spectra van negen watercompartimenten uit de kalibratierhizobox met verschillende watergehalten; (B) Pixelhistogrammen voor de watercompartimenten bij band 216, waar de gemiddelde afstand tussen naburige compartimenten maximaal is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De relatie tussen de gemiddelde pixelintensiteit bij 1680 nm en het gemeten watergehalte wordt getoond in Figuur 15.

Grafiek van bodemvochtigheid; exponentiële, lineaire fit. Watergehalte versus reflectie; veldcapaciteit, verwelkingspunt.
Figuur 15: Relatie tussen spectrale reflectie en volumetrisch watergehalte.
De figuur toont dataparen van het gemeten watergehalte en de spectrale reflectie, met empirische curven (lineair en exponentieel) die zijn aangepast aan de gegevens met uitzondering van de hoogste watergehaltes (rode driehoeken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het onderscheid tussen hogere watergehaltes op basis van spectrale intensiteit wordt moeilijk. Een significante regressie (lineair of exponentieel) met een hoge R2 kan worden gefit voor watergehaltes tot ongeveer 0,30 cm3 cm-3. Nattere bodemcondities kunnen niet betrouwbaar worden voorspeld aan de hand van de intensiteitswaarde. Vergelijkbaar gedrag van een exponentiële relatie tussen reflectiviteit en watergehalte, met een afnemende respons bij watergehaltes hoger dan 0,30 cm3 cm-3, werd ook in andere studies gevonden30.

Een afbeelding van een rhizobox met een gedetailleerde mapping van het watergehalte is weergegeven in Figuur 16. Vier aspecten dienen te worden opgemerkt. Ten eerste is een gebied met een lager watergehalte zichtbaar in de bewortelde delen van de rhizobox. Ten tweede is de sterkste uitputting geconcentreerd in de nabijheid van individuele wortelasen. Ten derde komen uitputtingszones ook voor waar geen wortelasen aan het oppervlak zichtbaar zijn, wat wijst op gebieden waar wortels in de bodem verborgen zijn. Ten vierde resulteert watermapping zonder verdere beeldbewerking in een vlekkerig uiterlijk als gevolg van de geaggregeerde bodem. Dit kan duiden op een inhomogene watergehalteverdeling op aggregaatschaal, maar ook op het effect van de oppervlaktemorfologie op de beeldkwaliteit. Chemometrische beeldbewerkingstechnieken zijn een optie om dergelijke morfologische effecten in spectrale beelden te overwinnen31, maar zijn tot nu toe niet geïmplementeerd in de hier gebruikte Matlab-scripts.

Diagram van de neuronstructuur; detail van dendritische vertakkingen bij neurale netwerkanalyse.
Figuur 16: Watergehaltekaarten van een rhizobox.
De donkerblauwe kleuren vertegenwoordigen gebieden met een hoog watergehalte, groen tot rode gebieden tonen gebieden met een laag watergehalte. De plantenwortel is in het zwart over de afbeelding geplaatst. Schaalbalk (linksonder), 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toepassingsvoorbeelden

Figuur 17 relateert kwantitatieve worteleigenschappen uit beeldanalyse aan bovengrondse metingen.

Analyse van plantgroeidata; grafieken van wortellengte, oppervlakteverhouding, droge stof, stomataire conductantie.
Figuur 17: Typische toepassingsvoorbeelden voor wortelgegevens.
(A) en (B) toon wortelinformatie die wordt gebruikt voor de karakterisering van bovengrondse en ondergrondse plantonderdelen in een fenotyperingscontext. (A) stelt de wortelgroei voor van de suikerbietcultivar Ferrara, (B) vergelijkt zes in rhizoboxen gekweekte suikerbietcultivars met behulp van de blad-worteloppervlakteverhouding (gegevens van één replica). (C) en (D) zijn functionele relaties tussen kenmerken zoals aangetroffen in fysiologisch plantonderzoek. (C) toont de invloed van de blad-worteloppervlakteverhouding op de productie van droge stof en (D) de relatie tussen het worteloppervlak en de stomatale conductantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 17A en 17B zijn relevant voor fenotypering gericht op een uitgebreide karakterisering van de plant boven- en ondergronds. Figuur 17A toont de wortelgroei van suikerbietcultivar Ferrara (cf. Figuur 8 voor afbeeldingen). De expansie van het wortelstelsel geeft de capaciteit van een cultivar aan om het bodemvolume te exploiteren binnen een bepaalde tijdsspanne van de vegetatieperiode. Figuur 17B toont de verhouding tussen blad- en worteloppervlak van zes suikerbietcultivars, wat een descriptor vormt voor de balans tussen het aanbod van de plant (wortel) en de vraag (blad).

Figuren 17C en 17D geven voorbeelden van functionele relaties die relevant zijn in fysiologisch onderzoek. In Figuur 17C is de ratio van het bladoppervlak ten opzichte van het worteloppervlak gerelateerd aan de droge stof die tijdens het experiment is gevormd, wat wijst op de overheersende rol van het assimilerende oppervlak als beperkende factor voor de accumulatie van droge stof. Het gebrek aan significantie, ondanks een relatief hoge R2, is te wijten aan het lage aantal gepaarde gegevens (n=6) dat hier is gebruikt. Figuur 17D laat zien dat cultivars met een groter worteloppervlak (verbeterde opname) gedurende het experiment een gemiddeld hogere stomatale conductantie vertonen. Het grotere worteloppervlak ondersteunt blijkbaar de waterextractie, waardoor de opening van de huidmondjes wordt verlengd.

Discussie

De protocollen bieden twee complementaire benaderingen voor grond gekweekte wortelsysteem imaging. Een cruciale stap voor betrouwbare experimentele resultaten is het invullen van de rhizoboxes die moet zorgen voor een zelfs en homogene substraat laag op het front glas bieden strakke wortel-bodem contactpersoon bij het kijkvenster en voorkomen van de luchtspleet. Dit is de belangrijkste reden voor het gebruik relatief fijne gezeefde bodem van < 2 mm: grotere aggregaten resulteren in hogere oppervlakte morfologie bij het kijkvenster met leegtes tussen aggregaten. Naast een hoger risico van wortel tip uitdroging vereist dit ook complexere afbeelding verwerkingstechnieken voor water toewijzing31.

Wijzigingen van het protocol is daarom gericht op verbeterde en snel vullen van rhizoboxes. Momenteel vullen tijd is ongeveer 30 minuten per doos. Bovendien gebruik van rhizoboxes met twee glazen ramen voor beeldvorming van de beide zijden en wijzigingen aan het optimaliseren van de homogeniteit van de verlichting voor betere RGB-afbeeldingen worden getest. Verdere uitbreiding van de hardware zou ook integratie van vlakke optodes32 , alsmede precisiecapaciteit imaging33 in het rhizobox-systeem kunnen overwegen. Dit valt echter buiten de huidige upgraden activiteiten.

Software wijzigingen gericht op automatische beeldregistratie fuse boven en beneden RBG beelden34. Hyperspectrale benadert beeldvorming geavanceerde functie van ongecontroleerde winning28 evenals gevoeliger gecontroleerde doel detectiemethoden zoals SVMs35 worden getest. Waardoor maakt de hyperspectrale gegevens mogelijk voor de beoordeling van meerdere bodem, rhizosfeer en wortel eigenschappen36. Bovendien is bedoeld voor het ontwikkelen van een (semi) geautomatiseerde software voor rhizobox wortel afbeeldingen op basis van een gewijzigde versie van het wortelsysteem Analyzer37 te kwantificeren morfologische (diameter, lengte, oppervlak) en architecturale kenmerken (vertakkende frequentie, vertakking van de hoeken).

De belangrijkste beperking van het protocol in vergelijking met 3D imaging benaderingen is de beperking tot de oppervlakte zichtbaar wortel en de eigenschappen van de rhizosfeer. Toch is gebleken dat de zichtbare wortel trekken een betrouwbare proxy voor de hele root systeem21 zijn. De rhizobox-techniek is gemakkelijk gecombineerd met traditionele destructieve bemonstering (wassen) aan het einde van de dynamische groei imaging om te valideren van de relatie van zichtbare vs. totale wortelsysteem eigenschappen. Zoals deze relatie tussen soorten21 variëren kan, wordt destructieve bemonstering aanbevolen om een betrouwbare afleiding van de zichtbare eigenschappen voor elke nieuwe fenotypering series met een ander gewas soorten.

Het belangrijkste voordeel van het hier gepresenteerde protocol is de combinatie van realistische groeiomstandigheden (bodem), relatief hoge potentiële doorvoer voor stoffelijk opgelost RGB beeldvorming en gevolgtrekking op basis functionaliteit (bijvoorbeeld de opname van water) via de chemometric wortel en rhizosfeer gegevens van Hyperspectrale beeldvorming. Waardoor de methoden overwint gevolgtrekking beperkingen in hoge-doorvoer zaailing en niet-bodem wortel imaging methoden14, terwijl hierdoor gedeeltelijk diepe fenotypering inzicht in functionele processen met minder experimentele complexiteit en hogere doorvoer in vergelijking met geavanceerde 3D methoden15.

In de aankomende experimenten het protocol worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van mycorrhiza wortelsysteem ontwikkeling en functionaliteit van peulvruchten, ook wat betreft fenotypering wortel kenmerken in verband met de bodemstructuur, stikstof en koolstof soorten cover gewas fietsen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen financiering uit de Oostenrijkse wetenschap Fonds FWF via het Project nummer P 25190-B16 (de wortels van de droogte resistentie). Oprichting van de Hyperspectrale beeldvorming infrastructuur werd financieel ondersteund door de federale regering van Neder-Oostenrijk (Niederösterreich Land) via het project K3-F-282/001-2012. Aanvullende financiering voor de suikerbieten experiment van AGRANA onderzoek werd ontvangen & Innovation Center GmbH (ARIC). De auteurs bedanken Craig Jackson voor technische ondersteuning tijdens het experiment en de Engelse correctie van het manuscript. Wij erkennen ook Markus Freudhofmaier die hebben bijgedragen aan de vestiging de RGB-imaging setup en Josef Schodl voor bouw van de montage van de rhizobox.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RhizoboxTechnisches Büro für BodenkulturExperimentele bouwer
LED Lamps ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Fluorescent light tube HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
UV light tube Eurolite 45cm slim 15 WConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Extended Version 12.0 x 32Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR cameraXenicsXEN-000105
Spectrograph Imspector N25ESpecim
Hyperspectral imaging scannerCarinthian Tech Research AGExperimentele bouwerOntwerp en assemblage van Hyperspectral Imaging Scanner en software
Matlab R2106aMathworksMet inbegrip van Toolboxes voor Beeldverwerking, Signaalverwerking en Statistiek en Machine Learning
AP4 PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C Area MeterLI-COR
BASF Styradur polystyreen platenObi Baumarkt9706318Verschillende soorten polystyreen platen of ander materiaal dat verschillend bevochtigde grond kan scheiden

Referenties

  1. Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. , DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
  2. Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
  3. Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
  4. MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
  5. Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. Global water resources: vulnerability from climate change and population growth. Science. 289, 284(2000).
  6. Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes. Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).
  7. Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat. Agron. J. 93, 290-298 (2001).
  8. Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environ. Res. Lett. 9 (10), 105011(2014).
  9. Lynch, J. P. Roots of the second green revolution. Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).
  10. Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front. Plant Sci. 4, 442(2013).
  11. Metcalfe, D. B., et al. A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy. New Phytol. 174, 697-703 (2007).
  12. Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues. , DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).
  13. Gioia, T., et al. GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply. Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).
  14. Watt, M., et al. A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites. Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).
  15. Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
  16. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
  17. Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).
  18. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
  19. Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis. Plant Methods. 10, 1(2014).
  20. Bengough, A. G., et al. Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings. Plant Soil. 262, 63-70 (2004).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).
  22. Price, A. H., et al. Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status. Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).
  23. Vadez, V. Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation. Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).
  24. Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods. Dane, J. H., Topp, G. C. , SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).
  25. Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics. J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).
  26. Passioura, J. B. The perils of pot experiments. Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).
  27. Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. Tutorial: Time series hyperspectral image analysis. J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).
  28. Kim, D. M., et al. Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis. Scie rep. 5, (2015).
  29. Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review. Plant Methods. 11, 29(2015).
  30. Lobell, D. B., Asner, G. P. Moisture effects on soil reflectance. Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).
  31. Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments. Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).
  32. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).
  33. Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize. Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Automatic panoramic image stitching using invariant features. Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).
  35. Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging. Scientific Reports. 6, 35679(2016).
  36. Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).
  37. Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine. Plant Physiol. 164 (1), 24-35 (2014).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Hyperspectrale beeldvormingRGB beeldvormingrhizobox opstellingmapping van watergehaltewortelsegmentatiespectrale analysebodemachtergrondbeeldbewerking
RGB- en spectrale Root Imaging voor Plant fenotypering en fysiologisch onderzoek: experimentele opzet en Imaging protocollen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.