Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek

Summary

Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.

Abstract

Het protocol presenteert een facile, efficiënte en veelzijdige methode ter voorbereiding van de chitosan gebaseerde hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. De hydrogel is bereid door oplossingen van glycol chitosan mengen met een gesynthetiseerde benzaldehyde beëindigd polymeer gelator en hydrogels efficiënt in enkele minuten bij kamertemperatuur worden verkregen. Door verschillende verhoudingen tussen glycol chitosan, polymeer gelator en water inhoud, zijn veelzijdige hydrogels met verschillende gelering tijden en stijfheid verkregen. Wanneer beschadigd zijn, kan de hydrogel zijn optredens en modulus, als gevolg van de omkeerbaarheid van de dynamische imine obligaties als crosslinkages terugkrijgen. Deze zelfstandige healable eigenschap kunt de hydrogel als injecteerbare omdat het zichzelf genezen van geperste stukken aan een integraal bulk hydrogel na de injectie proces worden kan. De hydrogel is ook multi inspelen op veel bio-actieve prikkels als gevolg van verschillende evenwichtsinstelling statussen van de dynamische imine obligaties. Deze hydrogel werd bevestigd als bio-compatibel, en L929 muis fibroblast cellen waren ingesloten volgende standaardprocedures en de celproliferatie was gemakkelijk beoordeeld door een kweekproces 3D cel. De hydrogel kan bieden een verstelbare platform voor verschillende onderzoek waar een fysiologische nabootsen van een 3D-omgeving voor cellen is geprofiteerd. Samen met haar multi responsieve, zelf healable en injecteerbare eigenschappen, de hydrogels potentieel toepasbaar als meerdere dragers voor drugs en cellen in toekomstige bio-medische toepassingen.

Introduction

Hydrogels zijn kruisverwijzende polymeermaterialen met grote hoeveelheden water en zachte mechanische eigenschappen, en zij zijn gebruikt in vele toepassingen van de bio-medische^1,2. Hydrogels kan bieden een zachte en natte omgeving, die zeer vergelijkbaar met de fysiologische omgeving voor cellen in vivo is. Daarom, hydrogels uitgegroeid tot een van de meest populaire steigers voor 3D cel cultuur^3,4. Vergeleken met de cultuur van de cel van de petrischaal 2D, 3D-celkweek beschikt over geavanceerde snel om aan te bieden dat een extracellulaire matrix (ECM) geïmiteerd communicatie voor cellen te contacteren en te assembleren voor de proliferatie en differentiatie doeleinden⁵. Daarnaast kon hydrogels die natuurlijke polymeren bevatten bio-compatibel en bevordering van omgevingen voor cellen vermenigvuldigen en onderscheiden³bieden. Hydrogels afgeleid van synthetische polymeren hebben de voorkeur voor hun eenvoudige en duidelijke onderdelen, welke uitsluiten van complexe invloeden zoals eiwitten van dierlijke oorsprong of virussen. Hydrogels die gemakkelijk worden voorbereid en hebben een consistente eigenschap hebben onder alle hydrogel kandidaten voor 3D-celkweek, altijd de voorkeur. De faciliteit aan te passen van de hydrogel eigenschappen aanpassen aan verschillende onderzoek eisen is belangrijk als goed⁶.

Hier introduceren we een facile voorbereiding van een glycol chitosan gebaseerde hydrogel met behulp van dynamische imine chemie, die een veelzijdige hydrogel platform voor 3D cel cultuur⁷wordt. Bij deze methode worden bekende bio-compatibele glycol chitosan gebruikt om frames van de hydrogel van netwerken. De amino groepen zijn reageerde met een polyethyleenglycol benzaldehyde beëindigd als het polymeer gelator dynamische imine obligaties vormen als crosslinkages van hydrogels⁸. Dynamische imine obligaties kunnen vormen en ontleden omkeerbaar en servicegerichte omgeving, waarmee de hydrogels met mechanisch verstelbare kruisverwijzende netwerken^9,10,11. Vanwege de hoge water inhoud, bio-compatibele materialen, en instelbare mechanische krachten, is de hydrogel met succes toegepast als een steiger voor L929 cellen in 3D cel cultuur^12,13. Het protocol hier een overzicht van de procedures, met inbegrip van polymeer gelator synthese, hydrogel voorbereiding cel insluiten en 3D cel kweken.

De hydrogel toont ook verschillende andere functies als gevolg van de dynamische imine-crosslinkages, met inbegrip van haar multi inspelen op verschillende bio-stimuli (zuur/pH, vitamine B6 afgeleide pyridoxal, eiwit papaïne, enz.), wat erop duidt dat de hydrogel kon worden geïnduceerde te ontleden onder fysiologische omstandigheden⁸. De hydrogel is ook zelf healable en injecteerbare, wat betekent de hydrogel kan worden beheerd via een minimaal invasieve injectie-methode en een voordeel in drugs- en cel leveringen^14,15. Door toevoeging van functionele additieven of specifieke vooraf ontworpen polymeer gelators, de hydrogel compatible bij het verkrijgen van specifieke eigenschappen zoals magnetische, temperatuur, pH responsieve, etc.^16,17, die kan voldoen aan een breed scala van onderzoek eisen. Deze eigenschappen onthullen de potentiële capaciteit van de hydrogel als een injectable meerdere vervoerders voor drugs en cellen in zowel in vitro en in vivo biomedisch onderzoek en toepassingen.

Protocol

Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Gebruik de juiste veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van experimenten van de chemie, met inbegrip van het gebruik van een zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, beschermende handschoenen, laboratoriumjas, enz.). Het protocol vereist standaard cel behandeling technieken (steriliseren, herstel van de cel, cel passaging, bevriezing van de cel, cel kleuring, etc.).

1. voorbereiding van de Hydrogels

1. synthese van benzaldehyde beëindigd di-matiemaatschappij polyethyleenglycol (PEG DF)
   1. pre desiccation PEG polymeer
      1. Weeg 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol) Breng dit in een kolf met ronde bodem (250 mL), en het toevoegen van tolueen (100 mL).
         Opmerking: Andere pinnen met verschillende molecuulgewichten kan werken voor de hydrogel vorming maar zal leiden tot verschillende stijfheid.
      2. Verwarm de oplossing door een warmte-pistool (of een warmhoudplaat ongeveer 40 ° C) mild om te helpen met het oplossen van alle de polymeren. Nadat alle de polymeren ontbinden, gebruiken een verdamper te verwijderen van alle de oplosmiddelen. Herhaal deze los en droog proces tweemaal om de gedroogde PEG polymeren.
         Let op: Dit moet worden uitgevoerd in een zuurkast met uiterste zorg. Tolueen is ontvlambaar.
   2. Benzaldehyde beëindiging reactie van PEG
      1. een magneetroerder en tetrahydrofuraan (THF, 100 mL) Voeg aan de maatkolf en ontbinden van PEG met behulp van een roerder. 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6,0 mmol) en 4-dimethylaminopyridine (0.07 g, 0,6 mmol) opeenvolgend toevoegen aan de oplossingen voor alle de lichamen volledig ontbinden.
      2. Toevoegen N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) aan de oplossing, en een droogrek buis dat gevuld is met watervrij CaCl ₂ aan de maatkolf toe te voegen. De reactie onder roeren houden bij kamertemperatuur (~ 20 ° C) voor ongeveer 12 h.
   3. Na reactie proces
      1. uitfilteren van de wit-lichamen in de oplossing door vacuüm gegenereerd nadat de reactie is voltooid. Giet de oplossing in koude diethylether (500 mL) onder roeren om het neerslaan van de witte lichamen. Verzamelen van alle de witte lichamen door filter en droog de lichamen in een zuurkast.
      2. De witte lichamen in THF weer los, uitfilteren van eventuele onoplosbare witte vaste stoffen, giet de oplossing in verse koude diethylether neerslaan van de witte lichamen en droog het. Herhaal dit proces twee tot drie keer, en plaats dan de witte lichamen in een vacuüm drogen oven (20 ° C, 0.1 mbar) hen volledig drogen. Het witte poeder als het eindproduct verzamelen: benzaldehyde beëindigd DF PEG.
2. Voorbereiding van hydrogels
   1. wegen van verschillende hoeveelheden DF PEG (0.11 g, 0.028 mmol 0,22 g, 0.055 mmol; 0.44 g, 0.110 mmol) in een buis (10 mL), Voeg gedeïoniseerd water (5,0 mL) en een vortex of magneetroerder gebruiken om te helpen Los van het polymeer.
   2. Los glycol chitosan (0.495 g, 6.18 x 10 ^-3 mmol) in gedeïoniseerd water (15,0 mL) in een buis (50 mL), en een draaikolk voor een paar minuten kunt meng de chitosan oplossing (3 wt %).
   3. Voeg de glycol chitosan oplossing (0,2 mL, 3 wt %) en DF PEG oplossingen (0,2 mL) opeenvolgend in een buis (2,0 mL). Gebruik een draaikolk te mengen de oplossingen homogeen voor formulier hydrogels in enkele minuten. Volg de ratio's in tabel 1 te maken van verschillende mechanische voordelen hydrogels.
      Opmerking: Gebruik de buis-inverterende methode om te bepalen of de hydrogel reeds heeft gevormd.
3. Reologie analyses
   1. reologie analyses op een roterende rheometer met een parallelle staalplaat uitvoeren (diameter: 20 mm). Verspreid voor de gelering test, glycol chitosan oplossing (0,2 mL, 3 wt %) op een lagere plaat. Vervolgens Voeg DF PEG waterige oplossingen (0,2 mL, 2 wt %) ontkleuring gelijkmatig over het oppervlak van de oplossing chitosan en meng met een pipet snel. Lager naar beneden de bovenste plaat en beginnen te test
   2. Voor hydrogel ' s stijfheid test, snijd een hydrogel in een cirkel (diameter: 20 mm) en het meten van de opslag-modulus (G ') waarden versus frequentie analyses op 1% belasting. Typische G ' waarden op 6.3 rad s ^{− 1} zijn vermeld in tabel 1.
      Opmerking: De reologie analyses van de hydrogel 0.5 h uitvoeren na de vorming van de hydrogel om dynamische binding stabilisatie van de hydrogel.
   3. Voor de hydrogel ' s zelf healable eigenschap testen, een hydrogel in stukken gehakt en de stukken bij elkaar komen om te self-heal naar een integraal stuk. Knip het stuk hydrogel zodat een cirkel (diameter: 20 mm) en zet het op de rheometer voor het uitvoeren van de analyse van de reologie.

2. 3D cel teelt in Hydrogels

1. voorbereiding van hydrogel gelering oplossingen
   1. wegen DF PEG (0.44 g, 0.11 mmol) in een steriele buis (4,0 mL), toevoegen in cel voedingsbodems (RPMI-1640, 2.0 mL), en met een vortex of roerder helpen ontbinden van het polymeer om te verkrijgen van de polymeeroplossing (20% van de wt). Laden van de oplossing in een injectiespuit (10,0 mL) en vervolgens het steriliseren door het passeren van een micron bacteriën-nulspanningsveilig filter (0,22 µm).
   2. Wegen de glycol chitosan (0.165 g, 2.06 x 10 ^-3 mmol) in een steriele buis (15,0 mL), Voeg in cel kweekmedia (RPMI-1640, 4,0 mL) en vortex te helpen oplossen van het polymeer om te verkrijgen van de glycol chitosan oplossing (4.0 wt %). Laden van de oplossing in een injectiespuit (10,0 mL) en filteren met een bacteriën-nulspanningsveilig filter van 0,22 µm.
2. Cel teelt in hydrogels
   Let op: voeren alle celopmaak verwante procedures in de kap van een weefselkweek. Basiskennis van steriele techniek wordt verwacht.
   1. Voorbereiding van celsuspensie
      1. cultuur L929 cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, 5% penicilline (10 mL) in een Petri schotel (diameter 10 cm), en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO ₂. Het medium veranderen elke dag vóór gebruik.
      2. Oogst de L929 cellen met PBS met trypsine (0,025 w/v %) en EDTA (0,01% w/v), vervolgens centrifugeren (70 x g, 5 min) en resuspendeer de cellen in het RPMI-1640 medium (1,0 mL). De cel tellen met behulp van de standaardwerking van bloed-tellen van bestuur uitvoeren Resuspendeer de cellen zo aanpassen van de concentratie van de cel op ~ 3,75 × 10 ⁶ cellen/mL.
   2. Cel inkapseling in hydrogels
      1. de L929 cel schorsingen (0.4 mL, 3,75 x 10 ⁶ cellen mL ^-1) mengen met glycol chitosan oplossing (0.4 mL) in een buis (4,0 mL) door vortex. Pipetteer van de L929/glycol chitosan oplossing (0,8 mL) in het midden van een confocal petrischaal (diameter 2,0 cm). Pipetteer de DF PEG oplossingen (0,2 mL) in de dezelfde schotel, en zachtjes Pipetteer Meng de oplossing te induceren hydrogel vorming.
         Opmerking: De hydrogel vorming beoordelen door het kantelen van de petrischaal.
      2. Voor directe celcultuur, voegt u extra hoeveelheden RPMI-1640 voedingsbodems (1,0 mL) op de top van de hydrogel. Zet de cel ingesloten hydrogels (1,0 mL 1.5 wt % glycol chitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 ⁶ cellen mL ^-1) in een incubator (37 ° C, 5% CO ₂) en het medium veranderen elke dag. Voorbereiden van cel imaging op dag 1, 3, 5 en 7 na cel inkapseling.
   3. Voor de 3D na celcultuur in hydrogels na injectie, bereiden cel geladen hydrogel (1,0 mL, zie stap 2.2.2) in een injectiespuit (10,0 mL, 48 G naald). Na de hydrogel vormen, injecteren de hydrogel langzaam in een petrischaal voor confocal imaging. Voeg een extra bedrag van voedingsbodems (1,0 mL) op de top van de hydrogel en wijzig het elke dag. Zet de petrischaal in een incubator (37 ° C, 5% CO ₂) en voor te bereiden voor imaging daarna.
      Let op: Controleer en volg het protocol inzake werking van een injectiespuit.
3. Cel rentabiliteit
   1. Confocal observatie
      1. Spoel de hydrogels met PBS (1,0 mL) voor twee keer. Vlek de hydrogels met fluoresceïne DIACETAAT (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) en propidium jodide (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) oplossingen voor 15 min. Na kleuring, het verwijderen van alle de oplosmiddelen.
      2. Observeren de hydrogels met behulp van een confocal microscoop onder excitatie golflengten van 488 nm en 543 nm te visualiseren levende en dode cellen, respectievelijk. Z-stacks via elke 2 µm-diepte van de hydrogels voor het valideren van een gelijkmatige verdeling van de cellen in de hele nemen.
         Opmerking: FDA vlekken levende cellen terwijl PI dode cellen vlekken.
   2. Degraderen de hydrogel (1,0 mL) met azijnzuur (HAc, 3% van de v, 1,0 mL) voor 5 min en Pipetteer in een buis (4,0 mL). Verzamelen van cellen door centrifuge (70 x g, 5 min) en resuspendeer de cellen in het kweekmedium cel van RPMI-1640 (1,0 mL). Uitvoeren van cel tellen met behulp van een bloed tellen bestuur.

Results

In Figuur 1is een schematische presentatie van dit protocol betreffende hydrogel voorbereiding en het gebruik ervan als 3D-celkweek aangeboden. Informatie van de inhoud en de ratio's bereid met verschillende mechanische sterkte van de hydrogel is samengevat in tabel 1. De hydrogel's zelf healable en reologie eigenschap presenteert de hydrogel van stijfheid van opslag modulus versus frequentie test in Figuur 2. De confocal beelden van de cel en d...

Discussion

De hydrogel gepresenteerd in dit protocol (Figuur 1) bestaat uit twee hoofdonderdelen: de natuurlijke polymeer glycol chitosan en een synthetische benzaldehyde beëindigd polymeer gelator DF PEG, die beide biocompatibel materiaal. Synthese van DF PEG wordt gepresenteerd met behulp van een one-step wijziging reactie. PEG met molecuulgewicht 4.000 werd gekozen in dit protocol in de zorgen van de oplosbaarheid, wijziging efficiëntie, evenals hydrogel stijfheid. Een aantal hydrogels met verschill...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycol chitosan	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% deacetyleringsgraad
4-Carboxybenzaldehyde	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	619-66-9	99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	538-75-0	99%
Calcium chloride anhydrous	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	10043-52-4	96%
4-dimethylamiopryidine	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	1122-58	99%
Polyethyleneglycol	Sino-pharm Chemical Reagent	5254-43-7	99%
Tetrahydrofuran	Sino-pharm Chemical Reagent	109-99-9	99%
Tolueen	Sino-pharm Chemical Reagent	108-88-3	99%
Ethyl ether	Sino-pharm Chemical Reagent	60-29-7	99%
Azijnzuur	Sino-pharm Chemical Reagent	64-19-7	99%
Watervrij CaCl2	Sino-pharm Chemical Reagent	10043-52-4	99%
Fluoresceïnediacetaat	Sigma	596-09-8	99%
Propidiumjodide	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 kweekmedium	Gibco
Foetaal bovien serum	Gibco
Trypsin-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
Penicilline-streptomycine-oplossing	Hyclone		10.000 U/ml
Reometer	TA Instrument		AR-G2
Confocale microscoop	Zeiss		710-3kanaals
L929-cellen	ATCC		NCTC clone 929; L cell, L929, afgeleid van Strain L
Verdamper	EYELA		N-1100
48-gauge naald	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		48-gauge
Microscoop	Leica		DM3000 B
Microscoopsoftware	Imaris
Warmtepistool	Confu		KF-5843
Petrischaal	NEST