Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56255

⸱

28 november 2017

 ,  ,  , 
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is dat voor de opsporing van in vivo antigeen-specifieke doden van een cel in een lymfkliertest model.

Samenvatting

Huidige methoden voor het doden van antigeen-specifieke zijn beperkt tot in vitro gebruik of gebruikt in modellen van besmettelijke ziekten. Er is echter niet een protocol dat specifiek bestemd voor de meting van antigeen-specifieke doden zonder een infectie. Dit protocol is ontworpen en een beschrijving van de methoden om deze beperkingen te overwinnen doordat voor de opsporing van antigeen-specifieke doden van een doelcel door CD8+ T cellen in vivo. Dit wordt bereikt door het samenvoegen van een vaccinatie-model met een traditionele CFSE-geëtiketteerden doel assay doden. Deze combinatie zorgt ervoor dat de onderzoeker te beoordelen van het potentieel van antigeen-specifieke CTL direct en snel als de test niet afhankelijk van de tumorgroei of een infectie is. Bovendien, de uitlezing is gebaseerd op stroom cytometry en dus moet gemakkelijk toegankelijk zijn voor de meeste onderzoekers. De belangrijkste beperking van de studie is het identificeren van de tijdlijn in vivo die past bij de hypothese wordt getest. Variaties in de sterkte van het antigeen en mutaties in de T-cellen die leiden differentiële cytolytische functie tot kunnen moeten zorgvuldig worden beoordeeld om te bepalen van de optimale tijd voor de oogst van de cel en beoordeling. De juiste concentratie van peptide voor vaccinatie is geoptimaliseerd voor hgp10025-33 en eicellen257-264, maar verdere validatie nodig zou zijn voor andere peptiden die meer geschikt voor een bepaalde studie wellicht. Globaal, is dit protocol maakt een snelle evaluatie van het doden van functie in vivo en kan worden aangepast aan een bepaald antigeen.

Inleiding

Er zijn meerdere protocollen om te kunnen beoordelen cytolytische (CTL) of een CD8+ of CD4+ T-cel. Deze beoordeling kan gemakkelijk worden gedaan in vitro onder gecontroleerde omstandigheden1,2,3. Daarnaast infectieziekte modellen, zoals LCMV, klassiek CTL functie met behulp van differentieel CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl ester) label doelcellen hebben onderzocht waar de CFSEhi-gelabelde cellen zijn Pulsed met een peptide en CFSElo-gelabelde target cellen zitten unpulsed. De cellen vervolgens geïnjecteerd in een 1:1 verhouding en beoordeeld voor verlies van de CFSEhi-label gepulseerde doelstellingen door stroom cytometry4. Vaccin en afwijzing modellen hebben ook soortgelijke strategieën gebruikt voor beoordeling van het in vivo doden door beide CD8+ en CD4+ T cellen evenals NK cellen5,6. Dit is een krachtige test, maar vereist het gebruik van besmettelijke agentia die prime het immuunsysteem voorafgaand aan target injectie.

Dit protocol, aan de andere kant, vereist geen voorafgaande infectie van de gastheer en in plaats daarvan maakt gebruik van een vaccinatiestrategie te prime het immuunsysteem voorafgaand aan target injectie. Deze vaccinatie bestaat uit een watergedragen formulering van peptide vaccin waarvoor bepaling van een immunostimulerende cocktail genaamd covax7, bestaande uit een Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist (imiquimod crème), een agonistic anti-interactie CD40 antilichaam en interleukin-2 (IL-2) leidt tot synergetische combinatie van immunostimulerende agenten voor de verdieping van peptide-specifieke priming en robuuste immuunrespons. Als zodanig biedt deze test een snelle uitlezing van CTL functie zoals het vaccin wordt toegediend samen met de cellen voor de beoordeling van de functie slechts drie dagen vóór injectie van de doelcellen. Bovendien, is de covax-priming sterk genoeg dat de capaciteit van de doden van de primer antigeen-specifieke T cel worden tussen 4 en 24 uur na de injectie gezien kan.

De belangrijkste beperking van dit protocol is het identificeren van de tijdlijn in vivo voor de detectie van doel doden die geschikt is om zowel het antigeen en de hypothese wordt getest. Zorgvuldige beoordeling moet worden uitgevoerd, als variaties in antigeen sterkte, alsmede genetische wijzigingen wordt getest in T-cellen kan leiden tot differentiële CTL-functie die een andere timing detectie van het doden van de doelgroep vereisen zou. Bovendien, terwijl de juiste concentratie van peptide voor vaccinatie is geoptimaliseerd voor menselijke melanoom antigeen glycopeptide 100 (hgp10025-33) en ovoalbumine257-264 (eicellen257-264)8,9 , gebruik van een ander model van het antigeen die meer geschikt voor een bepaalde studie wellicht zou vereisen verdere validatie. Vanwege verwachte verschillen in een doel antigenen capaciteit ter stimulering van CTL effector functie in combinatie met de covax als adjuvans, kan optimalisatie van IL-2 dosis concentratie en dosis frequentie zijn essentieel om het gewenste doel te bereiken. Globaal, is dit protocol voorziet in een snelle beoordeling van het doden van functie in vivo en kan worden aangepast aan een bepaald antigeen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de University of Texas MD Anderson Cancer Center.

1. voorbereiding van Peptide van het vaccin

  1. Los van het gelyofiliseerd peptide met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om de juiste concentratie en vortex voor 30 s.
    Opmerking: Voor hgp10025-33, de eindconcentratie is 1 mg/mL en voor eicellen257-264, de eindconcentratie is 0,5 mg/mL. Peptide vóór injectie te reconstrueren. Bewaar niet na reconstitutie.

2. isolatie van Splenocytes van transgene muis

Opmerking: Cel los van de milt moet worden uitgevoerd in een steriele wijze.

  1. De OT-1 transgene muis met behulp van de goedgekeurde CO2 verstikking methode euthanaseren en verwijderen van de milt.
    Opmerking: Passende transgene muis wordt gebruikt in deze stap specifiek voor de peptide van keuze.
    1. Leg de muis op de rechterkant. Spray de linkerzijde van de muis met 70% ethanol (EtOH). Trek de huid met behulp van Tang en knippen van de huid met behulp van chirurgische schaar; de milt zullen zichtbaar zijn binnen de peritoneale holte. Voorzichtig opengesneden de peritoneale holte voor toegang tot de milt. Het verwijderen van de milt met pincet.
  2. De milt gedesag door te plaatsen het in een 70 µm filter in een petrischaal met 2 mL medium A (PBS met 1% foetale runderserum (FBS)) en smashing de milt met het einde van een zuiger.
    1. Het verzamelen van de splenocytes van de petrischaal en de plaats in een conische tube van 50 mL. Wassen van de petrischaal met 5 mL medium A tweemaal om te verzamelen van alle cellen. Medium een up toevoegen aan 25 mL en de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 475 x g centrifugeren.
  3. De cellen gecombineerd en resuspendeer in 1 mL / per milt rode bloedcellen (RBC) lysis-buffermengsel. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Voeg toe 10 mL medium A centrifuge bij kamertemperatuur op 475 x g. resuspendeer de pellet in 10 mL medium A en verwijderen van vuil door het filteren van de celsuspensie door een 70 µm filter in een schone 50 mL kegelvormig.
  4. Cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer tellen. Resuspendeer de cellen in PBS om een eindconcentratie van 106 - 1006 cellen/mL. Voor eicellen257-doden,264 specifieke resuspendeer bij 106 cellen/mL en voor hgp10025-33 specifieke doden, resuspendeer bij 1006 cellen/mL.
    1. Draai de resterende cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 475 x g. gecombineerd het supernatant en resuspendeer in 15 mL koude PBS te wassen van de cellen. Herhaal de wassen stap nog eens. Draai de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 475 x g. gecombineerd het supernatant en resuspendeer in koude PBS volgens het eindvolume bepaald in stap 2.4.
    2. Enkele celsuspensie overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en houd op ijs tot injectie in ontvangende C57/BL6 muis.

3. injectie van Splenocytes van transgene muizen

  1. Plaats de ontvanger C57/BL6 muis in een afdekking met de dorsale zijde omhoog. Spray injectie tail basisareaal met 70% isopropyl alcohol. 100 µL van eencellige schorsing (sectie 2) intraveneus beheren in de ader van de staart een 27 G naald met de schuine kant naar boven.

4. Covax-administratie

Opmerking: Als de cellen geïnjecteerd in de middag, moet aan covax de volgende ochtend binnen 18 h van cel injectie worden toegediend.

  1. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een duidelijke anesthesie-doos met 1-3% Isofluraan. Nadat muizen zijn volledig verdoofd, de muizen naar de neus kegels gekoppeld aan de variëteit in de anesthesie-zaal overbrengen. Muizen terughoudend met de dorsale zijde omhoog houden.
    Opmerking: Afstomping wordt bevestigd door een korte teen snuifje om te controleren of dat een intrekking reactie niet wordt opgewekt. Federale wet beperkt Isofluraan gebruik op voorschrift van een erkende dierenarts.
  2. Spray injectie tail basisareaal met 70% isopropyl alcohol. 100 µL van peptide oplossing (van sectie 1) subcutaan injecteren met behulp van een 27 G naald met de spuit doordringing van 4-5 mm in de staart basis regio, de naald schuine zijde naar boven.
    Opmerking: Muizen zijn ingeënt in Eén flank met subcutane injectie aan de voet van de staart10.
  3. Breng 100 µL anti-interactie CD40 antilichaam (0,5 mg/mL stockoplossing) lateral aan de injectieplaats vaccin.
  4. Breng zorgvuldig imiquimod crème 50 mg/muis op de sites van de vaccinatie. Wrijf imiquimod crème op het oppervlak, totdat de room niet meer zichtbaar is en volledig geabsorbeerd wordt.
  5. Injecteren van 100 µL van 100.000 IE/mL rhIL-2 eiwit intraperitoneally (i.p.) bij de lagere abdominale regio. Observeren muizen gedurende 5 min. nadat ze volledig van anesthesie herstellen.
    Opmerking: Experiment is onderbroken op dit punt voor 3 dagen.

5. isolatie van Target Splenocytes voor het labelen met CFSE

Opmerking: Cel los van de milt moet worden uitgevoerd in een steriele wijze.

  1. De C57BL/6 muizen volgens goedgekeurde CO2 verstikking methode euthanaseren. Verwijderen van spleen(s) zoals in stap 2.1.1. Gedesag van de milt en wassen van splenocytes zoals in stappen 2.2.1 - 2.2.3. Lyse van rode bloedcellen zoals in stap 2.3 - 2.3.2.
  2. Verwijderen van de cellen voor het tellen van de met behulp van een hemocytometer en berekenen voor een eindconcentratie van cellen op 106 cellen/mL in CFSE-labeling oplossing (beschreven in stap 7). Spin resterende cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 475 x g. Aspirate supernatant.

6. peptide pulserende van Target Splenocytes

Opmerking: Peptide pulserende moet worden uitgevoerd in een steriele wijze.

  1. Resuspendeer de cellen bij 106 cellen/mL in volledige media (RPMI 1640 media met 10% FBS, 1% L-glutamine (L-Gln), 1% penicilline/streptomycine (Pen/Strep)). Verdeel de cellen in 2 buizen (15 mL conicals). Label elke buis als gepulseerde of unpulsed.
  2. Peptide aan de buis met het label gepulseerde toevoegen Voor eicellen257-264 pulserende, voeg 1 µg/mL en voor hgp10025-33 pulserende, voeg 2 µg/mL.
    Opmerking: De unpulsed cellen ondergaan de dezelfde incubatie als de gepulste cellen maar wel zonder de toevoeging van de peptide.
    1. Incubeer de cellen + peptide bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  3. Voeg 10 mL van de volledige media (RPMI 1640 media met 10% FBS, 1% L-glutamine (L-Gln), 1% penicilline/streptomycine (Pen/Strep)) aan elke buis te wassen zowel gepulseerde en unpulsed van de doelcellen. Spin resterende cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 475 x g. Aspirate supernatant.

7. bereiding van CFSE voor het labelen van de Target Splenocytes

  1. CFSE-labeling oplossing gedurende de cel wassen in stap 6.3; voorbereiden de gepulste cellen zal worden aangeduid als CFSEHallo en de unpulsed als CFSElo. 1 mL van CFSE-labeling oplossing voorbereiden 106 cellen.
    Opmerking: CFSE is licht gevoelig en moet worden beschermd tegen licht te allen tijde.
    1. Voorbereiden CFSEhi -media labelen door toevoeging van 1 uL/mL CFSE (stockoplossing 5 mM) voor een eindconcentratie van 5 µM/mL in RPMI media 1640 met 2% FBS.
    2. Voorbereiden CFSElo -media labelen door toevoeging van 1 uL/mL CFSE (stockoplossing 0,5 mM) voor een eindconcentratie van 0,5 µM/mL RPMI media 1640 met 2% FBS.

8. etikettering van de Target Splenocytes met CFSE

Opmerking: CFSE etikettering moet worden uitgevoerd in een steriele wijze.

  1. Resuspendeer de gepulste en unpulsed doelcellen (uit stap 6.3) bij 106 cellen/mL CFSE-labeling media. Resuspendeer de gepulste cellen met bereid CFSEhi-media en de unpulsed cellen met benoemen bereid CFSElo-labeling van media.
  2. Mix-cellen en CFSE-labeling media door zachte inversie of zwenken. Meng geen door vortexing. Incubeer de cellen en CFSE-labeling media bij 37 ° C gedurende 15 min. Remix de cellen om 5 min.
  3. Voeg 10 mL van de volledige media aan elke cel schorsing en spin cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 475 x g.
  4. Gecombineerd supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL koude PBS. Spin cellen bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij 475 x g.
  5. Herhaal stap 8.4.
  6. Tellen van de cellen en meng peptide-gepulseerde, CFSEhi-aangeduid met unpulsed, CFSElo-label van cellen op een 1:1 verhouding voor injectie in ontvangende muizen. Houd een aliquoot gedeelte van 1 x 106 gemengde cellen te gebruiken voor een stroom cytometry nulmeting (paragraaf 11).
    Let op: Het eindvolume voor injectie is 100 µL per muis. De laatste cel telling is 10e6 cellen. Verlies van volume in de spuit en de naald moet rekening worden gehouden en moet worden geschat op 500 µL.

9. injectie van doelcellen

Opmerking: Houd CFSE-geëtiketteerden cellen beschermd tegen licht voorafgaand aan en tijdens de injectie zoveel mogelijk.

  1. Plaats de ontvanger C57BL/6 muizen in een afdekking met de dorsale zijde boven. Spray injectie tail basisareaal met 70% isopropyl alcohol. Beheren 100 µL celsuspensie één intraveneus in de ader van de staart met de schuine kant naar boven.

10. opnieuw Isolatievan doelcellen

Opmerking: De timing van deze stap is kritisch en afhankelijk van de cytotoxiciteit CTL en de sterkte van het antigeen voor stimulatie. Voor de beoordeling van het doden van een doelwit264 gepulseerde van eicellen257-, moeten de cellen geoogst 4-6 h na injectie. Aangezien CFSE-geëtiketteerden cellen licht gevoelig, proces milt in het donker zijn.

  1. De ontvangende C57BL/6 muizen volgens de goedgekeurde CO2 verstikking methode euthanaseren.
  2. Verwijderen van spleen(s) zoals in stap 2.1.1. Gedesag van de milt en wassen van splenocytes zoals in stappen 2.2.1 - 2.2.3. Lyse van rode bloedcellen zoals in stap 2.3 - 2.3.2.
  3. Resuspendeer de cellen in 1 mL fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACs) buffer (1% BSA + PBS) voor beoordeling door stroom cytometry.

11. gating logica om te bepalen van CTL activiteit door Stroom Cytometry

  1. Beoordeling van CTL activiteit met behulp van een standaard stroom cytometry protocol uit te voeren. Cellen in het FITC-kanaal op een cytometer van de stroom met een 488 nm laser voor excitatie11te verwerven.
    1. Poort op levende lymfocyten met de voorwaartse scatter (FSC) vs kant scatter (SSC) parameters. Subgate binnen de levende lymfocyt-gate voor de totale bevolking van de CFSE-positieve.
      Opmerking: De ingespoten CFSE-geëtiketteerden cellen zal een kleine ondergroep van de totale lymfocyten aanwezig in de milt make-up. De CSFE-positieve cellen moeten worden weergegeven als twee verschillende populaties op de schaal van het logboek.
    2. Een histogram-indeling gebruiken voor het bepalen van het percentage van de unpulsed (linker peak, CFSElo) en gepulseerde (juiste peak, CFSEHallo) bevolking. Verlies van het CFSEHallo cellen aangeeft antigeen-specifieke CTL activiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vóór injectie van CFSE-label doelcellen, wordt het 1:1 cel mengsel uitgevoerd op een cytometer van de stroom bepalen de frequenties van de basislijn van het CFSEHallo én CFSElo doelcellen. Figuur 1 A toont de gating strategie voor de opsporing van wijzigingen in de CFSE bevolking, een eerste poort is gemaakt met behulp van FSC en SSC parameters. De totale CFSE-positieve cellen zijn vervolgens subgated voorafgaand aan de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel dit protocol eenvoudig is, zijn er een paar essentiële stappen die moeten zorgvuldig worden uitgevoerd. De covax-priming na injectie van de antigeen-specifieke T-cel wordt getest is noodzakelijk om te zien alle doden van de gepulseerde doelstellingen. Hoewel het mogelijk is dat de vaccinatie watergedragen covax een acute inflammatoire aandoening, voor de chronische inflammatoire fase creëert, kan de kortstondige waterbasis formulering te vervangen door een langzaam-antigeen release olie gebaseerde aanpak leiden to...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de NIH onderzoek (A1R03AI120027 (RN) en 1R21AI20012 (RN)), institutionele onderzoek Grant (RN), start-up verlenen (RN) en MD Anderson CIC zaad verlenen (RN).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6 tot 12 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen Charles River027C57 Black 6 muizen
OT-1 6-12 weken oude vrouwelijke muizen Jackson Labs003831
hgp10025–33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257–264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL
Imiquimod crème 5% Fougera51672-4145-6Aldara Cream
CD40-specifiek mAb BioXcellBE0016-2clone FGK4.5
rhIL-2-eiwit Hoffman LaRoche Inc136Recombinant humaan IL-2-eiwit
70% isopropyl alcohol Prep KendallS-17474
PBSLife Technologies10010-023Fosfaat Buffered Saline
FBSLife Technologies26140-079foetaal bovien serum
RBC-lyse buffer Life TechnologiesA10492-01rode bloedcel lyse buffer
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
L-Glutamine Life Technologies25030081
Pen/StrepLife Technologies15140122penicilline/streptomycine
CFSELife TechnologiesC345545-(en 6)-Carboxyfluorescein diacetaat succinimide ester
Bovien serum albumine (BSA)Sigma A4503
1,5 mL MCT gradueleerde natuurlijke Fisher05-408-129microcentrifugebuis
70% ethanolFisherBP8201500EtOH
Trypan blauwe oplossing, 0,4%  Life Technologies15250-061
HemocytometerFisher267110
27 gauge naaldBD305109
1 mL spuitBD309659

Referenties

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627(2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Antigeenspecifieke dodingCFSE-labelingflowcytometriepeptide-pulsingisolatie van splenocytenbeoordeling van CTL-activiteitdoding van doelcellen
In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.