Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56260

⸱

8 november 2017

 ,  , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, 3NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, 4RenOVAte Biosciences Inc

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Samenvatting

Embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen kan zichzelf vernieuwen en onderscheid maken in meerdere celtypes van het lichaam. De pluripotente cellen zijn dus begeerde voor onderzoek in de regeneratieve geneeskunde en zijn momenteel in klinische proeven voor oogziekten, diabetes, hart-en vaatziekten en andere aandoeningen. Het potentieel om te differentiëren tot gespecialiseerde celtypen in combinatie met de recente vooruitgang in genoom bewerken van technologieën met inbegrip van de CRISPR/Cas systeem bieden extra mogelijkheden voor het afstemmen van het genoom van iPSC voor gevarieerde toepassingen met inbegrip van ziekte modellering, gentherapie, en vertekenende trajecten van differentiatie, om enkelen te noemen. Onder de beschikbare bewerken technologieën, heeft de CRISPR/Cas9 van Streptococcus pyogenes ontpopt als een instrument van keuze voor specifieke bewerking van het eukaryotische genoom. De CRISPRs zijn gemakkelijk te bereiken, goedkope en zeer efficiënte in de techniek gerichte bewerkingen. Het systeem vereist een nuclease Cas9 en een reeks van de gids (20-mer) specifieke aan de genomic doelgroep een 3-nucleotide "NGG" protospacer-aangrenzende-motief (PAM) voor het targeten van Cas9 naar de gewenste genomic locus, naast een universele Cas9 bindende tracer RNA (aangrenzende samen één gids RNA of genoemd sgRNA). Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor efficiënte generatie feeder-onafhankelijke en voetafdruk-vrije iPSC en beschrijven van methoden voor het bewerken van het genoom van iPSC met behulp van de Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexen. Het genoom bewerken protocol is effectief en gemakkelijk kan worden multiplexed door pre-complexvormers sgRNAs voor meer dan één streefniveau met het Cas9 eiwit en tegelijkertijd leveren in de cellen. Ten slotte, beschrijven we een vereenvoudigde benadering voor de identificatie en karakterisering van iPSCs met gewenste bewerkingen. De geschetste strategieën tezamen, verwachting rendering en bewerken van iPSC voor vele toepassingen stroomlijnen.

Inleiding

De herprogrammering van menselijke lichaamscellen aan de pluripotente staat door overexpressie van herprogrammering van factoren heeft een revolutie teweeggebracht in stamcelonderzoek met toepassingen in ziekte modellering, regeneratieve geneeskunde en Geneesmiddelenontwikkeling. Verschillende niet-virale herprogrammering methoden zijn beschikbaar voor levering van herprogrammering factoren en het genereren van iPSCs, maar het proces is arbeid intensieve en niet zeer efficiënte1. De virale methoden, zijn hoewel efficiënt, geassocieerd met problemen van de integratie van het virus en tumorigeniciteit2,3,4. In dit manuscript rapporteren we het gebruik van cytoplasmatische Sendai virus voor leveren herprogrammering van factoren en tot oprichting van iPSC voetafdruk-vrije lijnen dat het gebrek aan integratie van alle virale vector sequenties in hun genoom5. Sendai virus is een RNA-virus dat na infectie uit cel cytoplasma ~ 10 passages wordt verdund en produceert herprogrammering factoren in overvloed, wat leidt tot snelle en efficiënte herprogrammering van6,7. De gevestigde iPSCs kunnen dan gemakkelijk worden overgestapt naar feeder-gratis medium om te voorkomen dat het gebruik van muis embryonale fibroblasten (MEFs) als feeder cellen8.

In deze publicatie, naast het overzicht van het virus van de Sendai gemedieerde herprogrammering, beschrijven we ook een verbeterde protocol voor het bewerken van iPSCs, die het potentieel heeft om het verstrekken van onbeperkt menselijke cellen met de gewenste genetische modificaties voor onderzoek. Wij hebben CRISPR/Cas9 technologie gebruikt voor de wijziging van de iPSCs, die nu wordt gebruikt voor een breed scala aan toepassingen waaronder knock-ins en uitsparingen, grootschalige genomic deleties, gebundelde bibliotheek screening voor gene discovery, genetische manipulatie van talrijke modelorganismen, en gene therapie9,10,11. Deze techniek gaat de vorming van complexen van Streptococcus pyogenes-afgeleide Cas9 nuclease en 20-mer gids RNAs dat doel erkenning via base-paring met genomic doel opeenvolging grenzend aan 3' nucleotide protospacer aangrenzende bereiken motief (PAM) volgorde. De Cas9 nuclease induceert een dubbele gestrande onderbreking ~ 3 nucleotiden uit de PAM-site, die vervolgens gerepareerde overwegend door niet-homologe einde (NHEJ) traject leidt tot invoegingen of verwijderingen in de open leesraam toetreden, en daardoor functionele Knockout van genen12.

Onze verbeterde protocol bevat de details voor cultuur van menselijke cellen van de alvleesklier, hun herprogrammering op mitotically geïnactiveerd muis embryonale fibroblasten (MEFs) om hogere efficiëntie te herprogrammeren, latere aanpassing aan de feeder-vrije cultuur op Matrigel, karakterisering van gevestigde iPSCs, begeleide CRISPR RNA ontwerp en voorbereiding, levering in iPSCs als RNP complexen, eencellige sorteren als u wilt klonen van bewerkte iPSCs genereren, gemakkelijk screening en identificatie van bewerkingen en karakterisering van eencellige klonen. Genomic verwijderingen werden efficiënt gegenereerd in deze studie door de invoering van Cas9 eiwit en twee CRISPR sgRNA RNP complexen voor het opwekken van dubbele gestrande einden (DSBs) en verwijdering van de tussenliggende segment. Deze methode speelt in op het gebruik van twee gidsen voor het genereren van verwijderingen in de open leesraam, hoog rendement van NHEJ leidt tot lage aantal klonen dat moet worden gekenmerkt en gemakkelijk oriënterende van klonen door het geautomatiseerde capillair elektroforese eenheid, fragment analyzer. Deze effectieve genoom bewerkingsmethoden voor het genereren van ziekten bij de mens stamcel gebaseerde modellen zal binnenkort een standaard en routinematige benadering in elke cel van de stam-laboratorium. Tenslotte precieze genoom bewerken zal het mogelijk maken te gaan dan stamcel ziekte modellering en potentieel kunnen katalyseren van cel-gebaseerde therapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. herprogrammering Protocol

  1. generatie van menselijke iPSC uit primaire menselijke pancreatic cellen
    1. vacht een 6-well plaat met 1,5 mg/mL koude collageen en laat het gel bij 37 ° C gedurende 1 h.
    2. Plaat vroege passage menselijke primaire cellen van de alvleesklier in Prigrow III medium (~ 1-1,5 × 10 5 cellen) op een collageen 6-well plaat gecoat op dag -2 tot ongeveer 2,5 × 10 5 cellen of ten minste 60% confluency per goed op de dag van transductie (dag 0). Plaat voor de eerste studie, ten minste 2-3 putten om één goed met gewenste confluentie op dag 0. Ten minste één goed te gebruiken als besturingselement aan de cellen tellen.
    3. Op de dag van de transductie (dag 0), warm 1 mL van Prigrow III medium in een waterbad voor elk putje te worden getransduceerde. Oogsten van de cellen van het ene besturingselement goed in 1 mL 10% FBS medium 1 mL trypsine/EDTA gebruik gedurende 5 minuten of totdat de cellen los als u wilt uitvoeren een telling van de cel. Om 10% FBS medium voegt DMEM, 10% FBS, 1% L-Glutamine, 1% natrium pyruvaat en 1% niet-essentiële aminozuren.
    4. Tellen en controleren van de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van het prestatiemeteritem cel en berekenen van het volume van elk virus nodig om het streefcijfer op basis van de cel nummer en virus-titer. Gebruik van de veelheid van infectie (MOI) van KOS = 5, hc-Myc = 5 en hKlf4 = 3 voor de alvleesklier cellen.
    5. Dooi één set van Sendai vector buizen in de opslag-80 ° C op ijs en voeg voorzichtig de berekende volumes van elk van de drie Sendai vector buizen tot 1 mL van Prigrow III medium, vooraf opgewarmd tot 37 ° C. Pipet zachtjes aan Meng de oplossing. Een goed in een 6-well-plate is genoeg voor transducing met Sendai virale vectoren voor het genereren van geherprogrammeerde cellen.
    6. Het Prigrow III medium uit de cellen gecombineerd en voeg langzaam de herprogrammering virus mengsel de putjes met de cellen. Incubeer de cellen overnachting in een incubator 37 ° C met een bevochtigde sfeer van 5% CO 2.
    7. Zorgvuldig verwijderen van het virus mengsel op cellen en vervangen door verse Prigrow III medium de volgende dag, 24u na transductie. Cultuur van de cellen voor 5 d en veranderen het medium elke alternatieve dag.
    8. Bereiden op dag 5, MEFs op 0,1% gelatine vooraf gecoat 10 cm cultuur gerechten (1.3 x 10 6 cellen/schotel). Groeien MEFs in T175 kolven tot dag 4 en vervolgens op dag 5, de cellen tot 6.000 rads uit een bron van de γ-straling bloot vóór het zaaien van de cellen 13 of gebruik de commerciële MEF bron.
    9. Op dag 6, gebruik 1 mL van cel detachement oplossing voor 10 min loskoppelen van de getransduceerde cellen, allemaal op MEF gerechten in Prigrow III medium plaat met rots-remmer (5 mM voorraad, 10 µM final) en na een nacht bebroeden in een incubator 37 ° C met een bevochtigde atmosphe Re van 5% CO 2.
    10. Te wijzigen in het medium van de Prigrow III hESC normaal de volgende dag. Voor het maken van 500 mL van hESC medium, toevoegen DMEM/F-12, 20% (v/v) knockout serum vervanging (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 mM l-glutamine; Niet-essentiële aminozuren 100 µM en 100 µM 2-mercaptoethanol. Veranderen van het medium zachtjes elke dag nu.
    11. Observeren de platen regelmatig voor het ontstaan van cel klontjes of kolonies indicatieve geherprogrammeerde cellen. De getransformeerde cellen vormen klonale aggregaten met geplaveide morfologie en grote kern en nucleoli. Mark van de waarschijnlijke ' iPSC ' kolonies en controleer ze regelmatig voor groei.
    12. Bijna vier weken na de signaaltransductie als kolonies klaar voor picken of overdracht zijn, bereiden 24-well MEF platen door plating 1.3 x 10 6 cellen/gelatine vooraf gecoate plaat als voorheen voor de overdracht van enkele kolonies.
      1. Voorbereiden matrix membraan (bv Matrigel) door aliquoting die het gebaseerd op de verdunningsfactor op het certificaat van analyse. Meng één aliquot 25 mL DMEM/F-12 vier 6-well (1 mL/putje) platen en Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 1 uur vóór gebruik. Handmatig kiezen 12-24 kolonies met behulp van een steriele pipet-tip gecombineerd hen en overbrengen naar MEF platen in 500 µL van hESC medium.
      2. Gecombineerd de media in de put voorzichtig verstoren of splitsen van de koloniën. Ook Kies 24-48 kolonies op matrix membraan gecoat 24-Wells-platen. Voor het membraan gecoate platen, gebruik van mTeSR1 (aangevuld met 10 µM rock-remmer) gedurende 24 uur en veranderen elke dag. Binnen 6-10 d van het kiezen van de koloniën, ze zijn klaar om te worden overgedragen aan de nieuwe 24-well en/of 12-well membraan platen om klonen uit te breiden.
    13. Indien nodig, loskoppelen van de kolonies op MEFs met behulp van 1 mg/mL collagenase voor 20 min, wassen tweemaal met hESC/mTeSR1 en transfer naar membraan bedekt 12 - of 24-Wells-platen. Als er voldoende robuuste kolonies groeien op het membraan van de matrix uit stap 1.1.12, bevriezen de kolonies op MEFs met behulp van iPSC bevriezing media volgens de fabrikant ' s richtsnoeren.
    14. Loskoppelen de robuuste kolonies verguld op het membraan in stap 1.1.12 met behulp van 500 µL van dispase voor 20 min en plaat weer op matrix membraan gecoat 12-Wells-platen. Handmatig Schraap van gedifferentieerde cellen en de eventuele contaminerende MEF feeder cellen te verrijken voor pluripotente op het membraan klonen.
    15. Breiden het klonen na 6-8 d door groeien op membraan platen gecoate door distantiëren met dispase oplossing als vóór en 6 - of 12-well plaat plating kleincellige aggregaten op verse membraan gecoat. Wijziging mTeSR1 medium dagelijks. Karakteriseren de geherprogrammeerde klonen door alkalische fosfatase kleuring, immunokleuring voor pluripotent markeringen (OCT3/4 en NANOG), FACS analyse van pluripotente oppervlakte markeringen en differentiatie vitrotests. Groeien en cultuur van de klonen op membraan beklede platen voor alle tests inclusief CRISPR bewerken zoals hierboven uitgelegd, tenzij andere coating oplossing is specifiek vermeld.
  2. Karakterisering van de mens iPSCs
    1. alkalisch fosfatase kleuring
      Opmerking: een commerciële kit hier wordt gebruikt. Zie de tabel van de materialen.
      1. Plaat putatief menselijke iPSCs op 24-well plaat en cultuur voor 4-5 d met dagelijks media verandering.
      2. Start van het protocol van de kleuring, gecombineerd het kweekmedium en wassen van de cellen met 1 mL 1 x PBS met 0,05% Tween-20 (PBST).
      3. Toevoegen van 0,5 mL van de oplossing van de moeilijke situatie in de kit op de cellen en Incubeer bij RT gedurende 2 tot en met 5 min. Aspirate de fix-oplossing en daarna wassen de vaste cellen met PBST. Laat niet de putjes drogen.
      4. Voeg 0,5 mL vers bereide AP substraat oplossing per putje door het mengen van oplossing A, B en C. Incubate de cellen in het donker (verpakt met folie of in een donkere container) bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 15 minuten
        Opmerking: Monitoren van de kleur te veranderen en zet de reactie stop wanneer de kleur helder verandert om te voorkomen dat niet-specifieke kleuring.
      5. Zet de reactie stop door aspirating de AP substraat oplossing en wassen van de putjes tweemaal met 2 mL 1 x PBS.
      6. Observeren van de kolonies onder de Microscoop en de beelden op 4 X of 10 X vergroting helder veld microscoop met een camera vastleggen.
    2. Immunokleuring
      1. menselijke iPSCs in 24-well plaat en cultuur voor 4-5 d plaat met dagelijks media verandering.
      2. Wassen van cellen eenmaal kort met PBS en moeilijke situatie voor 20 min met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.
      3. Wassen drie keer, gedurende 10 min (3 x, 10 min) met PBS op RT.
      4. Saturate aspecifieke sites met 10% normale geit of ezel serum (NS, afhankelijk van de dierlijke secundair antilichaam groeide op in) in PBS voor 40 min op RT. Voor alleen intracellulaire epitopes, inclusief 0.3% TX-100 in PBS (TX/PBS) naar permeabilize.
      5. Wash 3 x 5 min met PBS op RT.
      6. De OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 en SOX17 antilichamen in een verse oplossing van 5% verdunnen NS in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 ° C.
      7. Wassen van 3 x 5 min met PBS op RT.
      8. Verdund passende secundaire Alexa Fluor 488 of 568 antistoffen bij 5% NS/PBS en Incubeer de cellen gedurende 1 uur op RT.
      9. Wassen van 3 x 5 min op RT.
      10. Met DAPI in PBS Incubeer gedurende 10 min en wassen 2 x voor 5 min op RT. gebruik een fluorescente microscoop om te fotograferen.
    3. Fluorescentie-activated Cell Sorting (FACS)
      1. plaat menselijke iPSCs in een 6-well plaat en cultuur tot de kolonies worden 80% heuvels (ten minste 10 5 cellen /sample) met dagelijkse mTeSR1 middellange verandering.
      2. Op de dag van het experiment, het isoleren van de cellen en distantiëren tot de schorsing van een enkele cel, zoals uiteengezet in het protocol. Wassen met 10% FBS medium.
      3. Voor oppervlakte markers, resuspendeer in 0,5-1 mL 10% FBS medium en blijf ice.
      4. Voor intracellulaire markers, resuspendeer in 1 mL 4% PFA/PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen met 10% FBS medium. Resuspendeer in 0,1% TX/PBS en incubeer gedurende 15 minuten op het ijs. Wassen opnieuw met 10% FBS medium. Resuspendeer in 0,5-1 mL 10% FBS medium en blijf ice.
      5. Voeg 50 µL van de celsuspensie aan 50 µL van 10% FBS middellange bevattende aanbevolen hoeveelheid TRA-1-60, TRA-1-81 of SSEA-4 antilichamen en incubeer gedurende 30 min. tot 1 h.
      6. Wassen tweemaal met 10% FBS.
      7. Resuspendeer in 100 µL van 10% FBS opslagmedium met fluorescerende secundaire antilichamen en incubeer gedurende 30 min. Wash tweemaal met 10% FBS en resuspendeer in passende hoeveelheid 10% FBS. De levende cellen kunnen worden onderscheiden van dode cellen door propidium jodide dye toegevoegd aan < 1 µg/mL te schatten cel apoptosis tijdens de.
    4. Tri-bloedlijn differentiatie
      1. zaad van twee 6-Wells-platen met 1,5-2 x 10 6 iPSCs per putje in mTeSR1 medium met 10 µM rock remmer.
      2. De cellen groeien voor 2-3 d met dagelijks mTeSR1 middellange wijzigen totdat de putten 80-90 zijn % confluente toestaan.
      3. Toevoegen voor ectoderm inductie, neurale inductie medium (NIM) volgens de fabrikant ' s instructies in putjes van 2-3 van de 6-Wells-platen.
      4. Het medium omzetten in RPMI met 2% B27 supplement minus insuline en 12 µM CHIR99021 voor mesoderm inductie in 2-3-putten van de platen 14. Enige RPMI toevoegen met 2% B27 supplement minus insuline voor de volgende 24 h. toevoegen 5 µM IWP4 aan het RPMI medium met 2% B27 aanvulling minus insuline gedurende de volgende 24 uur. Na 72 uur vervangen door de media RPMI met 2% B27 supplement leidt tot de generatie van cardiomyocytes in 2-3 overleden te verslaan
      5. Voor endoderm inductie, het wijzigen van het medium in putjes van de 6-Wells-platen aan MCDB 131 aangevuld met 1,5 g/L natrium bicarbonaat, 1 x Glutamax, 10 mM glucose, 0,5% BSA, 100 ng/mL GDF8 en 5µM van CHIR99021 voor 24 h. cultuur in hetzelfde medium zonder CHIR99021 voor 2-3 d 15.
      6. Het protocol van immunokleuring Voer uit stap 2 voor alle drie geslachten en controleer voor de expressie van relevante markers.

2. Genoom bewerken van menselijke iPSC met behulp van CRISPR-Cas9

  1. voorbereiding van Cas9 eiwit en sgRNA
    1. aliquoot Cas9 eiwit in microcentrifuge buizen onder steriele omstandigheden en op te slaan van de aliquots door bevriezing van de buizen op -80 ° C.
    2. Ontwerpen twee gericht op gids RNAs per gen op basis van de software van MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/) of enige andere CRISPR gids ontwerp webtool. Gericht op eerste of tweede exon van het gen (gebaseerd op open leesraam) voor het genereren van uitsparingen. Kies de twee gidsen zodat ze dicht bij elkaar knippen (~ 30-100 bp uit elkaar) en we gemakkelijk het verwijderen met behulp van dezelfde set van het screenen van inleidingen kunt visualiseren. Kies de gidsen van de output van de software op basis van een hogere kwaliteitsscore en lagere aantal af-target sites. Screening inleidingen met behulp van het programma primer blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) te ontwerpen. Screening van inleidingen moet ten minste 100 bp uit de buurt van het Cas9 gesneden plaatsen en de grootte van het PCR-product moet bij voorkeur tussen 400-700 bp voor gemakkelijker versterking door PCR.
    3. Ontwerpen de twee complementaire sgRNA oligo Ani (19-22 nucleotiden in lengte afhankelijk van de volgorde van de gids) met een Bsa1 gesneden website op elk uiteinde. De oligo DNAS-systeem kan worden gesynthetiseerd commercieel en gegloeid om te vormen van dubbele streng DNA. Voor het gloeien, voeg 1 µL van 100 µM gidsen, 25 µL van het gloeien buffer (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) en 23 µL van water. Incubeer in een thermocycler geprogrammeerd om te beginnen bij 95 ° C gedurende 2 min en vervolgens geleidelijk afkoelen tot 25 ° C meer dan 45 min.
    4. Kloon de 2 µL van resulterende fragment in een restrictie-enzym Bsa1 verteerd 1 µL van in-house T7 promotor pCR2.1 vector met een Cas9 binding site met behulp van T4 DNA ligase volgens de fabrikant ' s-protocol.
      5. De gekloonde DNA-fragmenten van de volgorde van de
    5. en als trouw is gevestigd, in vitro transcriberen het klonen met behulp van een T7-kit voor het genereren van één gids RNAs. Zuiveren van de sgRNAs met een commerciële kit en elueer in RNase-gratis water. Controleer de concentratie van RNA.
  2. Transfectie van hiPSCs
    1. hiPSCs in mTeSR1 medium cultuur zoals hierboven beschreven, zolang de cellen niet 40-50% heuvels zijn.
    2. Twee uur voor nucleofection, wordt het medium vervangen door voorverwarmde mTeSR1 medium met 10 µM rock remmer 2 mL.
    3. Een uur later, voorbereiden op bestemming wells nucleofected cellen door zuigen membraan, bereid als hierboven, van 12-well plaat en vervangen met voorverwarmde 1 mL mTeSR1 medium met 10 µM rock Inhibitor van de omwenteling. Houden bij 37 ° C gedurende incubatie.
    4. Voorbereiden nucleofection master mix (schaal op de juiste manier afhankelijk van de monsters) voor elk monster door toe te voegen 16.4 µL van P3 oplaadbare batterij aanvulling; 3.6 µL van Supplement 1 van de nucleofector kit; 0,5 µg Cas9 eiwit en 0,5 µg voor elke sgRNA in 22 µL per reactie volume. pMAX GFP vector was ook nucleofected volgens de fabrikant ' s aanbevelingen in cellen te schatten ongeveer de efficiëntie van iPSC transfectie.
    5. Wassen elk goed met 2 mL RT PBS na aspirating van het medium met rots-remmer de iPSC-putjes. Vervolgens gecombineerd PBS, voeg 1 mL cell detachement oplossing en Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten
    6. Resuspendeer de cellen in 3 mL mTeSR1 voedingsbodem en Pipetteer zachtjes op en neer voor het genereren van een eencellige schorsing. Overdracht losgekoppeld cellen aan een centrifuge 15 mL tube met 5 mL mTeSR1 middellange.
    7. Cellen met cel counter tellen en totale volume vereist voor 0,5 x 10 6 cellen/Transfectie te berekenen. Breng gewenste hoeveelheid cellen in 15 mL centrifugebuis, centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min op RT en gecombineerd supernatant.
    8. Resuspendeer elke eenheid van 0,5 x 10 6 cellen in 22 µL van de transfectie master mix, bereid in stap 4. Breng snel cellen in de centrale kamer van één putje van de strip van een nucleocuvette. Plaatsen van de strip in een nucleofector apparaat en nucleofect cellen gebruikt CB150.
    9. Na nucleofection, Voeg snel 80 µL voorverwarmde mTESR1 medium dat 10 µM rock remmer aan elk putje van de nucleofected cellen. Voorzichtig mengen door omhoog en omlaag pipetteren.
    10. Voorzichtig overbrengen in cellen van de strip putjes van de membraan vooraf gecoate 12-well plaat met mTeSR1 medium met rots-remmer bereid in stap 3.
    11. Na 1 d, omzetten in verse mTeSR1 medium zonder rock-remmer. Oogst cellen 2-3 d na nucleofection voor het sorteren van eencellige.
  3. Eencellige isolatie van gerichte hiPSCs
    1. een dag vóór de sortering, bereiden 96-wells-platen voor MEF door het zaaien van 2 x 10 6 cellen/gelatine-beklede plaat in 10% FBS medium. Ongeveer 70-80% van de klonen overleven na nucleofection en 2-3 MEF platen kunnen worden voorbereid voor elke bewerking experiment.
    2. Na de overnachting incubatie, wijzigen de middellange hESC medium (zoals eerder beschreven) aangevuld met 100 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (remmers toegevoegd aan de media ter verbetering van de levensvatbaarheid van de eencellige), en 5 mg/mL fibronectine ter bevordering van de hechting.
    3. Vervangt het medium op de hiPSCs in de 12-well plaat van mTeSR1 naar mTeSR1 medium aangevuld met 1 x SMC4 voor ten minste 2 uur voordat u sorteert eencellige.
    4. Het medium van hiPSCs gecombineerd en wassen van de cellen zachtjes met PBS. Voeg 500 µL van cel detachement oplossing in elk putje en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten na het aspirating van de PBS. Genereren van de eencellige opschorting door toevoeging van 1 mL mTeSR1 (unsupplemented) aan elk putje en pipetteren zachtjes op en neer meermaals.
    5. Celsuspensie Breng in een conische buis 15 mL en de centrifuge gedurende 5 minuten bij 200 x g bij RT. Aspirate supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL mTeSR1.
    6. Sorteren van de cellen in afzonderlijke cellen met behulp van een cel sorter met 100 mm nozzle onder steriele omstandigheden met één cel in de individuele put van de 96-wells-platen bereid in stap 1.
    7. Vier dagen na sortering, kolonie vorming moet blijken; op dit punt het kweekmedium vervangen met hESC medium aangevuld met 1 x SMC4.
    8. Acht dagen na het sorteren, middellange vervangen door hESC medium en cultuur voor 2 overleden
    9. Loskoppelen van de kolonies met behulp van 1 mg/mL collagenase voor 20 min en deze overbrengen naar 24-well membraan gecoate platen in mTeSR1 met rots-remmer. Laat de eencellige klonen groeien en pakken hun genomic DNA na het dupliceren of het uitbreiden van hen. Gene specifieke primers kunt versterken van doelDNA door PCR.
    10. Gebruik fragment analyzer kit voor de eerste screening van PCR versterkte doel genomic regio van alle klonen door hen uit te voeren door middel van de gel/kleurstof mengen volgens de fabrikant ' s instructies. Schatting van de uiteindelijke grootte van het fragment in de software PROSize door het te vergelijken met de juiste ladder, die is uitgevoerd met de monsters. Volgorde van de verwachte ' bewerkt ' klonen en analyseren het rangschikken gegevens te bevestigen de redactie of verwijderingen.
    11. Voor monoallelic en biallelic klonen te differentiëren, versterken de bewerkte volgorde met PCR en kloon in pJET1.2 vector. Verzenden van minstens 8-10 klonen voor het rangschikken en de volgorde om te bevestigen bewerken in één of beide allelen controleren.
    12. Nadat met succes gerichte iPSC klonen zijn geïdentificeerd door middel van genotypering, bestuderen om te bevestigen dat zij niet pluripotent verloren of opgedaan chromosomale afwijkingen door middel van het proces.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wij hebben in deze publicatie, een eenvoudige maar efficiënte protocol gevolgd voor de generatie van iPSC uit menselijke pancreatic cellen met behulp van integratie of voetafdruk-vrije Sendai virus vectoren. Figuur 1A een schematische voorstelling afgebeeld van dit herprogrammering protocol. De menselijke cellen van de alvleesklier werden aangekocht commercieel, gekweekt in medium Prigrow III en getransduceerde met Sendai virus zoals hierboven uitgelegd. Getr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Herprogrammering van menselijke lichaamscellen te iPSCs, heeft een belangrijke impuls aan het gebied van de fundamentele biologie onderzoek, gepersonaliseerde geneeskunde, ziekte modellering, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde16verstrekt. Veel huidige en meest gebruikte methoden van menselijke iPSC generatie vereisen het gebruik van virus met het risico van integratie in het genoom van de host of episomal vectoren met lage herprogrammering van efficiëntie. Hier presenteren we ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

BT is een van de oprichters van renoveren Biosciences Inc.

Dankbetuigingen

Werk in het lab werd ondersteund door de toekenning van de postdoctorale fellowship aan Dr. Anjali Nandal en verkennende subsidie uit Maryland Fonds voor de onderzoek van de stamcel naar BT (TEDCO).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 KitInvitrogenA16517Ontdooi op ijs; S Nr: 1
Trypsin EDTAGibco Life Tech25300-0540,05%, 100 ml; S Nr: 2
Rock inhibitor (Y-27632)MiliporeSCM075Gebruik 10 μM; S Nr: 3
DMEM/F-12 mediumInvitrogen11330-032S Nr: 4
Serum replacement (KSR)Gibco10828028S Nr: 5
DMEMInvitrogen119600691X; S Nr: 6
Fetal bovine serumThermo ScientificSH30071.03Portie; S Nr: 7
L-glutamine (Glutamax, 100X), liquidThermo Scientific350500611/100; S Nr: 8
Non-Essential Amino AcidsGibco11140-0501/100; S Nr: 9
2-MercaptoethanolGibco2198502355 mM, 1/1.000; S Nr: 10
Hausser HemacytometersHausser Scientific02-671-54S Nr: 11
0,1% Gelatine-oplossingSTEMCELL Technologies7903Incuberen bij 37º C gedurende 1 uur; S Nr: 12
SSEA-4-antilichaamSantacruzsc-217041/100; S Nr: 13
TRA-1-81-antilichaamCell Signaling4745S1/200; S Nr: 14
OCT4-antilichaamSanta Cruzsc-52791/1.000; S Nr: 15
Collageen I, rattenstaartLife TechnologiesA10483-01Koel bewaren; S Nr: 16
Alexa Fluor-fluorescentie 488/ 568 (secundaire antilichamen)InvitrogenA21202/A100421/2.000; S Nr: 17
DPBSHycloneSH30028LS1X; S Nr: 18
100-mm weefselkweekschaaltjeFalcon353003S Nr: 20
96-wels weefselkweekplaatFalcon353078S Nr: 21
6-wels weefselkweekplaatFalcon353046S Nr: 22
Dissectiescoop NikonSMZ745S Nr: 23
Picking hoodNuAireNU-301S Nr: 24
15 ml centrifugeerbuisGreiner Bio-One188271S Nr: 25
50 ml centrifugeerbuisGreiner Bio-One227261S Nr: 26
NatriumpyruvaatInvitrogen11360S Nr: 28
β-mercaptoethanolSigmaM7522S Nr: 29
Prigrow III-mediumABMTM003S Nr: 31
Countess™ CeltellerInvitrogenC10227S Nr: 32
Faxitron X-ray systeemFaxitronCellRadS Nr: 33
AccutaseInnovative cell TechnologiesAT-104S Nr: 34
CollageenaseLife Technologies171040191mg/ml stock; S Nr: 35
DispaseSTEMCELL Technologies7923S Nr: 36
hESC gekwalificeerd matrigelBD Biosciences354277Om te verdunnen, gebruik koud DMEM/F-12; S Nr: 37
bFGFR & D233-FBStock 10 ug/ml; S Nr: 38
ParaformaldehydeEMS157104% stock in PBS; S Nr: 39
TRA-1-60Santa Cruzsc-217051/100; S Nr: 40
NANOGReproCELLRCAB0004P-F1/100; S Nr: 41
Tween 20SigmaP9416-100MLS Nr: 42
Alkaline fosfatase-kitStemgent00-0055S Nr: 43
Cas9-eiwitPNA BioCP01-50Ontdooi en portioneer; S Nr: 44
Geiten- of ezelsserumSigmaD9663/G9023S Nr: 45
Triton X-100SigmaX100-100MLS Nr: 46
DAPIThermo ScientificD1306S Nr: 47
TrisSigma9285-100MLS Nr: 48
NaClSigmaS7653-250GS Nr: 49
EDTASigmaBP2482-500S Nr: 50
T4 DNA ligaseNEBM0202TS Nr: 51
Mega Shortscript T7-kitThermo ScientificAM1354S Nr: 52
Mega Clear-kitThermo ScientificAM1908S Nr: 53
SMC4BD Biosciences354357S Nr: 54
FibronectineSTEMCELL Technologies7159S Nr: 55
CloneJET-klonering-kitThermo ScientificK1232S Nr: 56
Fragment analyzerTMAdvanced AnalyticalS Nr: 57
mTeSR1-mediumkitSTEMCELL Technologies5850Opwarmen tot kamertemperatuur; S Nr: 58
Invriesmedium mFreSR™STEMCELL Technologies5855S Nr: 59
Invriesmedium CryoStor®STEMCELL Technologies7930S Nr: 60
MEF's

Referenties

  1. Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
  5. Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612(2012).
  6. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
  7. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594(2014).
  9. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
  10. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559(2017).
  11. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
  12. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
  13. McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
  15. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
  16. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
  17. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
  18. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CRISPR Cas9 RNPGenoombewerkingsprotocolFootprint vrije iPSCNucleofectiemethodeSingle cell sortingAlkalische fosfatase kleuringImmunofluorescentieanalyseFragment analyzer kit
Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.