Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen kan zichzelf vernieuwen en onderscheid maken in meerdere celtypes van het lichaam. De pluripotente cellen zijn dus begeerde voor onderzoek in de regeneratieve geneeskunde en zijn momenteel in klinische proeven voor oogziekten, diabetes, hart-en vaatziekten en andere aandoeningen. Het potentieel om te differentiëren tot gespecialiseerde celtypen in combinatie met de recente vooruitgang in genoom bewerken van technologieën met inbegrip van de CRISPR/Cas systeem bieden extra mogelijkheden voor het afstemmen van het genoom van iPSC voor gevarieerde toepassingen met inbegrip van ziekte modellering, gentherapie, en vertekenende trajecten van differentiatie, om enkelen te noemen. Onder de beschikbare bewerken technologieën, heeft de CRISPR/Cas9 van Streptococcus pyogenes ontpopt als een instrument van keuze voor specifieke bewerking van het eukaryotische genoom. De CRISPRs zijn gemakkelijk te bereiken, goedkope en zeer efficiënte in de techniek gerichte bewerkingen. Het systeem vereist een nuclease Cas9 en een reeks van de gids (20-mer) specifieke aan de genomic doelgroep een 3-nucleotide "NGG" protospacer-aangrenzende-motief (PAM) voor het targeten van Cas9 naar de gewenste genomic locus, naast een universele Cas9 bindende tracer RNA (aangrenzende samen één gids RNA of genoemd sgRNA). Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor efficiënte generatie feeder-onafhankelijke en voetafdruk-vrije iPSC en beschrijven van methoden voor het bewerken van het genoom van iPSC met behulp van de Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexen. Het genoom bewerken protocol is effectief en gemakkelijk kan worden multiplexed door pre-complexvormers sgRNAs voor meer dan één streefniveau met het Cas9 eiwit en tegelijkertijd leveren in de cellen. Ten slotte, beschrijven we een vereenvoudigde benadering voor de identificatie en karakterisering van iPSCs met gewenste bewerkingen. De geschetste strategieën tezamen, verwachting rendering en bewerken van iPSC voor vele toepassingen stroomlijnen.
Inleiding
De herprogrammering van menselijke lichaamscellen aan de pluripotente staat door overexpressie van herprogrammering van factoren heeft een revolutie teweeggebracht in stamcelonderzoek met toepassingen in ziekte modellering, regeneratieve geneeskunde en Geneesmiddelenontwikkeling. Verschillende niet-virale herprogrammering methoden zijn beschikbaar voor levering van herprogrammering factoren en het genereren van iPSCs, maar het proces is arbeid intensieve en niet zeer efficiënte1. De virale methoden, zijn hoewel efficiënt, geassocieerd met problemen van de integratie van het virus en tumorigeniciteit2,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. herprogrammering Protocol
- generatie van menselijke iPSC uit primaire menselijke pancreatic cellen
- vacht een 6-well plaat met 1,5 mg/mL koude collageen en laat het gel bij 37 ° C gedurende 1 h.
- Plaat vroege passage menselijke primaire cellen van de alvleesklier in Prigrow III medium (~ 1-1,5 × 10 5 cellen) op een collageen 6-well plaat gecoat op dag -2 tot ongeveer 2,5 × 10 5 cellen of ten minste 60% confluency per goed op de dag van transductie (dag 0). Plaat voor de eerste studie, ten minste 2-3 putten om één goed met gewenste confluentie op dag 0. Ten minste één goed te gebruiken als besturingse....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wij hebben in deze publicatie, een eenvoudige maar efficiënte protocol gevolgd voor de generatie van iPSC uit menselijke pancreatic cellen met behulp van integratie of voetafdruk-vrije Sendai virus vectoren. Figuur 1A een schematische voorstelling afgebeeld van dit herprogrammering protocol. De menselijke cellen van de alvleesklier werden aangekocht commercieel, gekweekt in medium Prigrow III en getransduceerde met Sendai virus zoals hierboven uitgelegd. Getr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Herprogrammering van menselijke lichaamscellen te iPSCs, heeft een belangrijke impuls aan het gebied van de fundamentele biologie onderzoek, gepersonaliseerde geneeskunde, ziekte modellering, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde16verstrekt. Veel huidige en meest gebruikte methoden van menselijke iPSC generatie vereisen het gebruik van virus met het risico van integratie in het genoom van de host of episomal vectoren met lage herprogrammering van efficiëntie. Hier presenteren we .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
BT is een van de oprichters van renoveren Biosciences Inc.
Dankbetuigingen
Werk in het lab werd ondersteund door de toekenning van de postdoctorale fellowship aan Dr. Anjali Nandal en verkennende subsidie uit Maryland Fonds voor de onderzoek van de stamcel naar BT (TEDCO).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Ontdooi op ijs; S Nr: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0,05%, 100 ml; S Nr: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Gebruik 10 μM; S Nr: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S Nr: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S Nr: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S Nr: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Portie; S Nr: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S Nr: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S Nr: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1.000; S Nr: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S Nr: 11 |
| 0,1% Gelatine-oplossing | STEMCELL Technologies | 7903 | Incuberen bij 37º C gedurende 1 uur; S Nr: 12 |
| SSEA-4-antilichaam | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S Nr: 13 |
| TRA-1-81-antilichaam | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S Nr: 14 |
| OCT4-antilichaam | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1.000; S Nr: 15 |
| Collageen I, rattenstaart | Life Technologies | A10483-01 | Koel bewaren; S Nr: 16 |
| Alexa Fluor-fluorescentie 488/ 568 (secundaire antilichamen) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2.000; S Nr: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S Nr: 18 |
| 100-mm weefselkweekschaaltje | Falcon | 353003 | S Nr: 20 |
| 96-wels weefselkweekplaat | Falcon | 353078 | S Nr: 21 |
| 6-wels weefselkweekplaat | Falcon | 353046 | S Nr: 22 |
| Dissectiescoop | Nikon | SMZ745 | S Nr: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S Nr: 24 |
| 15 ml centrifugeerbuis | Greiner Bio-One | 188271 | S Nr: 25 |
| 50 ml centrifugeerbuis | Greiner Bio-One | 227261 | S Nr: 26 |
| Natriumpyruvaat | Invitrogen | 11360 | S Nr: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S Nr: 29 |
| Prigrow III-medium | ABM | TM003 | S Nr: 31 |
| Countess™ Celteller | Invitrogen | C10227 | S Nr: 32 |
| Faxitron X-ray systeem | Faxitron | CellRad | S Nr: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S Nr: 34 |
| Collageenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S Nr: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S Nr: 36 |
| hESC gekwalificeerd matrigel | BD Biosciences | 354277 | Om te verdunnen, gebruik koud DMEM/F-12; S Nr: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S Nr: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S Nr: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S Nr: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S Nr: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S Nr: 42 |
| Alkaline fosfatase-kit | Stemgent | 00-0055 | S Nr: 43 |
| Cas9-eiwit | PNA Bio | CP01-50 | Ontdooi en portioneer; S Nr: 44 |
| Geiten- of ezelsserum | Sigma | D9663/G9023 | S Nr: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S Nr: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S Nr: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S Nr: 48 |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | S Nr: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S Nr: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S Nr: 51 |
| Mega Shortscript T7-kit | Thermo Scientific | AM1354 | S Nr: 52 |
| Mega Clear-kit | Thermo Scientific | AM1908 | S Nr: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S Nr: 54 |
| Fibronectine | STEMCELL Technologies | 7159 | S Nr: 55 |
| CloneJET-klonering-kit | Thermo Scientific | K1232 | S Nr: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S Nr: 57 | |
| mTeSR1-mediumkit | STEMCELL Technologies | 5850 | Opwarmen tot kamertemperatuur; S Nr: 58 |
| Invriesmedium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S Nr: 59 |
| Invriesmedium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S Nr: 60 |
| MEF's |
Referenties
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
