Methodenartikel

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

DOI:

10.3791/56265

⸱

5 september 2017

 ,  , 
1Department of Oncologic Sciences, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sterk gecoördineerde DNA repair pathways bestaan om te detecteren, accijnzen en vervanging van beschadigde DNA-basen en coördineren van de reparatie van DNA strand einden. Terwijl moleculaire biologietechnieken hebben verduidelijkt structuur, enzymatische functies en kinetiek van reparatie eiwitten, is er nog steeds een noodzaak om te begrijpen hoe reparatie wordt gecoördineerd binnen de kern. Laser-micro-bestraling biedt een krachtig hulpmiddel voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de werving van reparatie eiwitten. Inductie van DNA-schade door laser-micro-bestraling kan optreden met een reeks van golflengtes en gebruikers op betrouwbare wijze kunnen veroorzaken enkele streng pauzes, basis laesies en dubbele strand einden met een aantal doses. Hier, laser-micro-bestraling wordt gebruikt om te onderzoeken van de reparatie van enkele en dubbele streng einden geïnduceerd door twee gemeenschappelijke confocale laser golflengten, 355 nm en 405 nm. Verdere, juiste karakterisering van de toegepaste laser dosis voor specifieke schade mengsels inducerende wordt beschreven, zodat gebruikers reproducibly laser micro-bestraling data-acquisitie en analyse uitvoeren kunnen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescent microscopie heeft ontpopt als een krachtige techniek voor het visualiseren van cellulaire het platform, onderzoeken lokalisatie van eiwit en eiwit-eiwit en eiwit-DNA interacties. Met behulp van fluorescentie microscopie te bestuderen van DNA schade reacties na de toepassing van mondiale DNA beschadigen van agenten, zoals ultraviolet (UV) licht, heeft ioniserende straling, chemische oxidatie of alkylerend agentia, en/of chemotherapeutica nieuw inzicht in de inleiding, signalering en aanwerving van DNA herstellen eiwitten naar sites voor DNA schade1,2. Echter, deze mondiale en asynchrone gebeurtenissen schadelijk zijn beperken, als gedetailleerde informatie over de werving order, de kinetiek van de vereniging of dissociatie, en de relaties tussen belangrijke DNA reparatie eiwitten worden gezocht. Gelukkig, vooruitgang in laser confocal microscopen scannen, bredere beschikbaarheid van schade-inducerende laser golflengten en verbeteringen in fluorescente proteïnen ten opzichte van de afgelopen 25 jaar hebben verstrekt onderzoekers met verbeterde hulpmiddelen voor de behandeling van deze aspecten van DNA herstellen, door middel van gerichte DNA schade inductie.

Bestraling van cellen met laser microbeams te bestuderen van cellulaire en subcellular functies is een gevestigde hulpmiddel in cel en straling biologie3. Toepassing van deze techniek op de studie van DNA-herstel is verschenen toen Cremer en medewerkers een zeer gerichte UV gebruikt (257 nm) laser microbeam systeem voor het opwekken van DNA-beschadiging over een 0,5 µm plek in Chinese hamster ovary (CHO)4 cellen en de inductie van gevestigde De photolesions van DNA door dit systeem5. Terwijl biedt aanzienlijke verbeteringen over UV microbeam methoden op het moment, de aanneming van dit systeem schadelijk was beperkt als gevolg van haar gespecialiseerde instellen en haar onvermogen om te genereren breekt dubbele streng (DSBs)6. Daaropvolgend onderzoek van een verscheidenheid van UV-B (290-320 nm) en UV-een golflengten (320-400 nm) door een aantal fracties geopenbaard dat UV-photoproducts, oxidatieve laesies baseren, enkele streng breekt (SSBs), en DSBs afhankelijk van de golflengte van de laser kan worden geïnduceerd en macht toegepast4,7,8,9,10 (herzien in 3). Verder, combinaties van deze UV-B en UV-A golflengte met sensibiliserende stoffen, zoals psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) en Hoechst kleurstoffen, werden ook gevonden voor het opwekken van DNA-schade afhankelijk van golflengte, kracht en duur van de blootstelling, hoewel de kracht nodig om te veroorzaken schade is vaak verlaagd in de aanwezigheid van deze agenten11,12,13,14,15. Deze vorderingen uitgebreid het gebruik van micro-bestraling, al waren er nog technische hindernissen voor bredere toepassing van deze methoden worden aangepakt.

Cremer en medewerkers schoven aanzienlijk het gebied van micro-bestraling van juist gericht de UV microbeam om toe te passen significante schadelijke energie over een uiterst gelokaliseerde gebied in de cel. Zoals confocal microscopen en microdissection lasersystemen geavanceerde, was strak gericht licht meer in het algemeen toegankelijk zijn; echter gepresenteerd UV bronnen koppelen aan scopes en het omgaan met de chromatische aberraties die ze nog geïnduceerde belangrijke uitdagingen voor de meeste gebruikers3,-6,16. UV kleurstoffen steeg in populariteit gedurende de jaren 1990, optica staat van zich te concentreren en vastleggen UV-opgewonden fluorescentie werd breder beschikbaar16en verbeteringen in laser scannen aangeboden gebruikers de mogelijkheid te maken zeer gericht UV excitatie plekken binnen cellen6,17. Het was echter niet tot de vroege 2000s dat de werkelijke impact van deze combinatie van strak gerichte balken met hogere intensiteit lasers was voelde, toen talrijke rapporten naar voren waaruit blijkt gekomen dat DNA strand einden kon worden opgewekt met en zonder allergenen in de UV-A bereik6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, en zelfs in de meer zichtbare golflengten zoals 488 nm27. Deze vorderingen mogen voor meer wijdverspreide goedkeuring van de techniek van de micro-bestraling op een aantal commerciële systemen. Parallel aan deze ontwikkelingen, twee-foton technieken ook naar voren gekomen waardoor nauwkeurige inductie van DNA-schade; Hoewel deze vooruitgang zal niet hier worden besproken, zijn er een aantal artikelen van de beoordeling over deze methodologieën9,28,29,30.

Met de huidige toegankelijkheid van confocal microscopen geschikt voor het leveren van zeer gerichte UV-licht en de wijdverspreide beschikbaarheid van fluorescente proteïnen toe real-time tracking van DNA reparatie eiwitten, micro-bestraling technieken uitgegroeid tot krachtige hulpmiddelen voor de behandeling van DNA schade reactie en reparatie trajecten. Nochtans, moeten de gebruikers zich bewust zijn dat de generatie van DNA-schade sterk afhankelijk van de golflengte van de laser en de kracht toegepast op het sub nucleair gebied is. Gebruik van UV-C (~ 260 nm) golflengten kunnen directe DNA excitatie en hoge selectiviteit voor de inductie van UV photoproducts7,8. UV-B en UV-A golflengte produceren mengsels van DNA-schade (base laesie, SSBs en DSBs), afhankelijk van de toegepaste kracht en de cellulaire achtergrond gebruikt7. Endogene photosensitizers en anti-oxydant niveaus in de gerichte cellen kunnen beïnvloeden de DNA schade mengsels geproduceerd door deze golflengten. Bovendien is het gebruik van exogene photosensitizers (BrdU, enz.) kan bijstaan bij het verlagen van de energie die nodig is voor de inductie van DNA-schade. Echter deze agenten DNA schade kunnen veroorzaken door zichzelf, en ze kunnen het wijzigen van de celcyclus en de structuur van de chromatine, zodat het gebruik ervan kan leiden tot ongewenste effecten die moeten worden genomen door de gebruiker. Daarom is zorgvuldige afweging van het DNA-reparatie-traject van belang, de golflengten beschikbaar voor gebruik, en het DNA schade mengsel gemaakt voorafgaand aan het gebruiken van micro-bestraling DNA schade reactie en reparatie te studeren, vereist.

Hier, laser-micro-bestraling wordt uitgevoerd op twee gangbare golflengten, 355 nm en 405 nm, zonder sensibilisatoren om aan te tonen van de mengsels van DNA-schade veroorzaakt door deze golflengtes en de invloeden die deze schade mengsels hebben op het onderzoek van de reparatie vanSSBs en DSBs. de gebruikers moeten zich ervan bewust dat deze golflengten Maak geen een enkele soorten strand einden of base laesies. Om te discrimineren tussen DNA-reparatie-trajecten, moeten gebruikers zorgvuldig controle van de toegepaste kracht over een bepaalde regio van de kern en karakteriseren van de veroorzaakte schade gebruik van meerdere strand break markeringen en DNA laesie antilichamen. Indien goed toegepast en gekenmerkt, kan laser-micro-bestraling verrijken sommige soorten DNA-beschadiging, toestaand gebruikers om te beoordelen van reparatie van base laesies en SSBs of DSBs, met sommige specificiteit. Daarom hebben wij een methode waardoor gebruikers kunnen reproducibly uitvoeren van laser-micro-bestraling, karakteriseren de DNA schade mengsels geïnduceerd door de toegepaste laser dosis en gegevensanalyses uitvoeren verstrekt.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. celkweek en generatie van stabiele cellen

  1. groeien CHO-K1 cellen in minimaal essentiële medium aangevuld met 10% foetale runderserum. Handhaven van cellen in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C.
  2. Transfect CHO-K1 cellen met 1 µg plasmide DNA met menselijke XRCC1 met een C-terminal groen fluorescente proteïne (GFP) tag met behulp van een commerciële transfectiereagens na de fabrikant ' s instructies.
  3. Selecteer CHO-K1 cellen stabiel uiting van de menselijke XRCC1-GFP fusie met behulp van 800 µg/mL geneticin en verrijken van de XRCC1-GFP waarin bevolking met behulp van fluorescentie bijgestaan cell sorting (FACS).
  4. Plaat cellen worden micro-bestraalde in kweekvaten met een dekglaasje bodem, zodat ze ongeveer 75% of meer confluentie op de volgende dag bereiken. Sommige ruimten tussen de cellen zijn wenselijk, met name als registratie gebruikt om terug te keren naar hetzelfde beeld veld (beschreven in sectie 3.2).

2. Microscoop set-up

  1. Selecteer het scannen van een laser confocal microscoop uitgerust met geschikte lasers en optica en controlesoftware voor micro-bestraling/photostimulation. Gepresenteerd experimenten gebruik een laser confocal microscoop die heeft zijn gewijzigd om een 355 nm laser, vezel-gekoppeld aan een galvanometer photoactivation miniscanner scannen en gecontroleerd met behulp van de fabrikant ' s controle en analyse software. Dit systeem kan uitvoeren micro-bestraling in een gebruiker-aangewezen regio van belang (ROI) met behulp van de photoactivation miniscanner (355 nm laser) of de standaard confocal galvanometer (405 nm laser).
  2. Selecteer de golflengte worden gebruikt voor micro-bestraling, ervoor te zorgen dat alle optische componenten in de micro-bestraling lightpath geschikt voor de gekozen golflengte zijn.
    Opmerking: Het voorgestelde systeem maakt gebruik van een C-Apochromat (numerieke diafragma (nvt) 1.2) 40 × doelstelling voor olie-immersie samen met een UV filter kubus voor 355 nm micro-bestraling, en een 20 × C-Apochromat (NA 0,75) droge doelstelling met behulp van de standaard confocal lightpath voor 405 nm micro-bestraling. De 20 × doelstelling gebruikt bij de instelling is niet compatibel met de 355 nm golflengte; Daarom hebben we de 40 × gebruikt voor 355 nm alleen. Met behulp van de droge doelstelling voor schadelijk immunofluorescentie protocollen stroomafwaarts worden toegepast kunt zonder op te schonen van immersie-olie, dat is waarom we gebruik maken van deze doelstelling wanneer mogelijk.
  3. Configureren de Microscoop voor het experiment micro-bestraling. Om redenen van consistentie tussen experimenten, wijst u een gestandaardiseerde configuratie van de Microscoop componenten moet worden gebruikt voor elk type van micro-bestraling. Deze instellingen opslaan als een voorinstelling binnen de Microscoop ' s besturingssoftware, indien mogelijk.
    Opmerking: In het voorgestelde systeem, cellen zijn micro-bestraalde en beeld met behulp van unidirectionele scannen, een scanresolutie van 1024 x 1024 pixels met 1 x scan zoom, met een beeldsnelheid van 8 beelden per seconde (fps), en met de pinhole ingesteld op ongeveer 4 luchtige eenheden (AU), als voor de 488 nm laser (69 µm) bepaald. Deze open pinhole instelling werd gekozen om te maximaliseren van de hoeveelheid licht opgenomen in elke afbeelding, waardoor het gebruik van lagere imaging laser bevoegdheden en het verminderen van photobleaching.

3. Laser micro-bestraling

  1. plaats het voorbereide cultuur schotel, met cellen van belang, op het stadium van de Microscoop en de vergrendeling stevig op zijn plaats.
    1. Indien beschikbaar, chambered dia in een incubator fase-top plaatsen en onderhouden bij 37 ° C met 5% CO 2 tijdens de inductie van de schade. Deze stap is heel belangrijk voor live-cel timelapse imaging of lang imaging sessies. Anders plaats cellen op de Microscoop stagen en uitvoeren van bestraling bij kamertemperatuur (~ 25 ˚C), en dan snel terug cellen naar een incubator bij 37 ° C met 5% CO 2.
  2. Registreren afbeeldingsvelden om de onderzoeker om terug te keren naar dezelfde locatie na het uitvoeren van fixatie, kleuring of andere procedures. Registratie van beschadigde velden met behulp van een gecodeerde, geautomatiseerde Microscoop stadium uitvoeren of cel dekglaasje kweekvat met een gegraveerde of gelabelde raster van XY-locaties.
    1. Als met behulp van software beeldregistratie, selecteer een herkenbare kenmerk van de cultuur vaartuig (dat wil zeggen, de hoek van het dekglaasje of barrière tussen putten), verzamelen een afbeelding en de XY-locatie opnemen. Dit zal zorgen voor uitlijning en registratie van de XY-locaties van geselecteerde velden na bereiding van de monsters.
    2. Als met behulp van handmatige registratie, raster of geëtst locaties voor elk veld handmatig opnemen, voorzichtig om te registreren de afdrukstand en positie van de schotel in het werkgebied.
    3. Als geen identificerende functies voor de cel kweekvat beschikbaar, zijn beschadigde velden kunnen identificeren door visueel onderzoek van de cel morfologie en dichtheid. Zorg om te selecteren van de velden met voldoende verschillende functies als herkenbare tijdens later imaging.
      Opmerking: Dit kan tijdrovend om uit te voeren, tenzij de richting en het gebied van de cultuur-schip is strak beperkt.
  3. Selecteert u een veld voor micro-bestraling en richten van het monster. Voor cellen uiten van fluorescently geëtiketteerde eiwitten, selecteert u het brandvlak met de maximale nucleaire doorsnede in het fluorescerende kanaal van belang. Voor de cellen niet uiten aangeduid met eiwitten, of voor mensen zonder duidelijke nucleaire localisatie, fase contrast of differentiële interferentie contrast (DIC) imaging kan worden gebruikt voor het vinden van de juiste brandvlak.
    ​ Opmerking: een nuttige functie van fase contrast en DIC imaging is het feit dat naarmate het brandvlak door middel van het monster, dezelfde functie licht of donker is afhankelijk van de relatieve brandvlak kan verschijnen.
    1. Selecteer een duidelijke functie binnen de kern, zoals een nucleolus, en het brandvlak omhoog en omlaag met inachtneming van deze wijziging in verschijning. Het ware brandvlak zal liggen op de overgang van licht naar donker. Om het monster, selecteer het brandvlak waarin de geselecteerde functie de scherpste contrast heeft.
  4. Registreren van de positie van het veld van belang. Een vierkant 3 x 3 pixel ROI binnen de Microscoop software maken, plaatst u deze ROI op de kern van een cel worden beschadigd en instellen van deze ROI als de schade ROI.
  5. Verzamelen een pre schade-beeld, met inbegrip van de positie van de schade ROI.
    1. Voor experimenten die geen gebruikmaken van fluorescente proteïnen, verwerven een fase contrast of differentieel interferentie contrast (DIC) helderveld afbeelding te identificeren en registreren van de kernen voor schade.
    2. Voor live-cel experimenten met behulp van fluorescente proteïnen, met helderveld en de fluorescentie-kanaal voor de proteïne van belang (dat wil zeggen, laser lijn 488 nm voor excitatie van GFP, laser lijn 561 nm voor excitatie van RFP) afbeeldingen inlezen. In experimenten met behulp van de CHO-K1 XRCC1-GFP, fluorescentie opgewonden door de 488 nm laser lijn voor het gelijktijdig met het verzonden DIC helderveld kanaal werd verzameld.
  6. Geïnitieerde laser schade.
    1. In het voorgestelde systeem, controle de dosis van de laser door de totale tijd bezig geweest met het scannen van de schade ROI. Omdat de galvanometer voor de 355 nm laser op een vaste scanfrequentie opereert, laser dosis wordt gecontroleerd door de tijd herhaaldelijk scannen de geselecteerde schade ROI: in de gegevens gepresenteerd hier, micro-bestraling bij 355 nm wordt uitgevoerd voor 2 en 10 seconden.
    2. Daarentegen de 405 nm laser dosis bepalen door het moduleren van de scan rate en uitvoeren van een scan van de geselecteerde schade ROI. In de p-gegevens8 en 0.5 fps resented hier, gebruiken voor micro-bestraling bij 405 nm. Een scan tarief van 8 fps levert een lagere dosis van de laser dan 0.5 fps, omdat de laser minder tijd aan elke pixel tijdens de scan besteedt. Beide lasers worden geëxploiteerd op 100% kracht. Zie sectie 3.7 voor instructies over het meten van de kracht van de laser rechtstreeks.
      Opmerking: Elke individuele Microscoop systeem kan verschillen in hoe laser macht wordt geleverd aan een aangewezen ROI, vergelijkbaar met hoe de 355 nm en 405 nm verschillen in het voorgestelde systeem. Gebruikers zullen moeten bepalen deze procedure voor hun Microscoop-systeem en het verslag van deze parameters binnen hun methoden secties.
    3. Voor levende cellen imaging, verrichten timelapse Beeldacquisitie kanalen met helderveld en fluorescentie. Duur en frequentie van timelapse voor het optimaliseren van de gegevensverzameling, idealiter het vastleggen van de accumulatie van de fluorescente proteïne over de schade ROI en de dissociatie in de tijdsverloop van het experiment aanpassen. Experimenten met behulp van XRCC1-GFP verzameld beelden elke 30 seconden gedurende 20 minuten.
      ​ Opmerking: de frequentie van de timelapse beeldvorming kan worden beperkt door photobleaching van de fluorophore, analyses van de accumulatie en dissociatie complicerende. Photobleaching kan worden geëvalueerd door het observeren van onbeschadigde cellen tijdens de timelapse en algemene inkoopvoorwaarden te minimaliseren fluorescent signaalverlies in deze onbeschadigde cellen aan te passen. Sommige photobleaching wellicht onvermijdelijk, zodat gebruikers voor het signaalverlies compenseren kunnen door het normaliseren van de fluorescerende intensiteiten van de beschadigde cellen aan die van de onbeschadigde cellen in elk frame van de timelapse.
      1. Nadat het tijdsverloop is voltooid, selecteert u een nieuw veld van cellen voor schade of repareren van beschadigde cellen voor verdere analyse, zoals beschreven in sectie 4.
      2. Doorgaan micro-bestraling en timelapse imaging totdat het gewenste aantal beschadigde cellen is bereikt.
        ​ Opmerking: We raden beschadiging van een totaal van 10-25 cellen per geselecteerde voorwaarde teneinde de heterogeniteit van de cel-naar-cel in reactie op de veroorzaakte schade. Hoewel meest confocal systemen gebruikers meer dan één cel beschadigen tijdens elk micro-bestraling kunnen, introduceert dit gespreid schade inleiding, die analyse van aanwerving piekuren over een groot aantal cellen kan bemoeilijken of dissociatie keer voor snelle evenementen. In sommige systemen, gelijktijdige schade inductie over verschillende ROIs kan het verminderen van de dosis van de laser ontvangen door elke onafhankelijke ROI. Daarom, tenzij deze timing/power kwesties worden direct behandeld door de gebruiker, wordt aanbevolen dat de cellen individueel worden beschadigd.
    4. Voor analyse door immunofluorescentie (IF), uitvoeren van schade en hetzij onmiddellijk monteren van cellen, zoals beschreven sectie 4, of toestaan dat cellen te herstellen voor geselecteerde stappen van tijd (bijvoorbeeld 1, 5, 10 of 20 min). Na de gewenste tijd verstrijkt, vast en vlekken van de cellen, zoals beschreven in sectie 4.
      1. Te vergroten algemene celaantal voor als '-analyse, extra velden binnen het schip van de cultuur voor het genereren van een meerdere velden tijdsverloop van de reactie na schade schade. Record de XY-locatie van elk veld en het tijdstip waarop de schade zich heeft voorgedaan. Na de gewenste totale herstel tijd is verstreken, vast en vlekken van de cellen als gedetailleerde hieronder.
  7. Na het observeren van eiwit werving bij geselecteerde doses, maatregel en verslag laser macht niveaus na vezel en na doelstelling te karakteriseren en nauwkeurig verslag laser doses. We gebruiken een compacte digitale Energiemeter en twee verschillende fotodiode sensor hoofden; een gekoppeld rechtstreeks aan de fiber laser voor het meten na vezel vermogen, en anderzijds in het werkgebied van de Microscoop te meten post-objective uitvoer geplaatst.
    1. Voor het meten van de kracht van de laser, plaats de sensor in de gewenste configuratie (na fiber of post-objective) en het uitvoeren van micro-bestraling zoals hierboven beschreven, tijdens het opnemen van de metingen, verricht door de Energiemeter. Let erop dat de bemonsteringsfrequentie van de Energiemeter mogelijk niet snel genoeg om gebeurtenissen zeer snelle micro-bestraling, zodat kan het noodzakelijk voor stormloop meerdere iteraties van het experiment om ervoor te zorgen dat de Energiemeter nauwkeurig de toegepaste dosis detecteert.
      Opmerking: Voor de 355 nm laser, we een gemiddelde piekvermogen van ongeveer 5 mW na glasvezel en ongeveer 19 μW na doelstelling gemeten. Voor de 405 nm laser, micro-bestraling werd uitgevoerd in de lusjes van 30 herhalingen te overwinnen de 0,01 s maximale sampling rate van de Energiemeter en gemiddelde piek bevoegdheden van 1,5 mW en 2.4 mW werden gemeten met behulp van scan snelheden van 8 en 0.5 frames per seconde , respectievelijk. Elke Energiemeter is anders. Gebruikers zullen moeten bepalen de operationele golflengtes en samplingfrequenties voor hun individuele Energiemeter.

4. Immunofluorescentie kleuring procedures

  1. analyseren strand break inductie door als kleuring.
    1. Fix cellen met 3,7% formaldehyde (voorzichtig) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor 10 min. Aspirate formaldehyde oplossing en wassen 3 keer met PBS. Het protocol kan hier worden tegengehouden door PBS terug brengen in de cellen, en de cellen kunnen worden achtergelaten bij 4 ˚C voor maximaal 1 week.
      Let op: Formaldehyde is giftig en kankerverwekkend. De juiste persoonlijke beschermingsmiddelen dragen en de afzet van de giftige stof als geïnstrueerd door institutionele procedures voor milieu en gezondheid.
    2. Cellen met behulp van 0,25% permeabilize Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) en daarna wassen 3 keer met PBS.
    3. Blok niet-specifieke antilichamen bindende door incubatie gedurende 30 min. in PBS met 1% bovien serumalbumine (BSA) op RT.
    4. Incubate met primaire monoclonal antibody tegen γH2AX en primaire polyclonal antilichaam tegen 53BP-1 beide 1:750 in PBS met 1% BSA voor 1 h bij RT wordt verdund en vervolgens 3 keer wassen met PBS.
    5. Incubate cellen met Alexa 488 geit anti-muis en Alexa 546 geit anti-konijn zowel 1:2000 in PBS met 1% BSA voor 1 h bij RT wordt verdund en vervolgens 3 keer wassen met PBS.
    6. Vlek nucleair DNA met een oplossing van 10 mg/mL van de DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Let op) verdund tot 1:5000 in PBS voor 5 min, of gebruik vergelijkbare nucleaire kleurstof en vervolgens wassen 3 keer met PBS.
      Let op: DAPI is giftig en mutageen. Dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en de verwijdering van de giftige stof, zoals geïnstrueerdg door institutionele procedures voor milieu en gezondheid.
    7. Plaats PBS of PBS + 0,1% natriumazide (voorzichtig) terug op de gekleurde cellen. Protocol kan hier worden gestopt en cellen opgeslagen op 4 ˚C voor meerdere dagen, of ga naar image aquisition in sectie 5.
      ​ Let op: natriumazide is giftig. Dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en de verwijdering van de giftige stoffen zoals geïnstrueerdg door institutionele procedures voor milieu en gezondheid.
  2. Analyseren inductie van base laesies of DNA adducten door als kleuring.
    1. Fix en permeabilize cellen in ijskoude methanol (voorzichtig) gedurende 20 minuten bij -20 ° C.
      Let op: Methanol is giftig en brandbaar. Dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en de verwijdering van de giftige stof, zoals geïnstrueerdg door institutionele procedures voor milieu en gezondheid.
    2. Gecombineerd de methanol en laat het monster drogen volledig voor 15 min. Protocol kan hier worden gestopt en cellen opgeslagen bij-20 ˚C tot 3 dagen drogen.
    3. De cellen in PBS voor 15 min. hydrateren
    4. Denature DNA met behulp van 2 N HCl (voorzichtig) voor 45 min op RT en wassen 3 keer met PBS.
      Let op: HCl is corrosief. Goede persoonlijke beschermingsmiddelen dragen en vervreemden van de bijtende stof, zoals geïnstrueerdg door institutionele procedures voor milieu en gezondheid.
    5. Neutraliseren in 50 mM Tris-HCl pH 8,8 gedurende 5 minuten gevolgd door 3 wasbeurten met PBS.
    6. Incubate cellen in de blokkeerbuffer gemaakt met 5% normale geit serum en 0,1% Triton X-100 in PBS voor 1 h op RT.
    7. Incubate met primaire antilichamen voor de 8-oxo-2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1:400) of cyclobutaan pyrimidine dimeer (CPD, 1:1, 000) in de geit serum buffer met blokkerend gedurende 1 uur bij RT en daarna wassen 3 keer met PBS.
    8. Cellen met Alexa 488 geit anti-muis met een verhouding van de 1:2000 in de geit serum buffer met blokkerend gedurende 1 uur bij RT broeden, en 3 keer wassen met PBS.
    9. Vlek nucleair DNA met behulp van 1:5000 DAPI (10 mg/mL) in PBS voor 5 min, en 3 keer wassen met PBS.
    10. Als met behulp van chambered dekglaasje, plaatst u PBS of PBS + 0,1% natriumazide terug op de gekleurde cellen. Protocol kan hier worden gestopt en cellen opgeslagen op 4 ˚C voor meerdere dagen, of ga naar image aquisition in sectie 5.
    11. Mount anderzijds cellen in voorkeur montage medium, als een extra dekglaasje kan worden geplaatst op de top van het vaartuig van de cultuur. Na uitharden, gekoppelde cellen kunnen worden achtergelaten bij 4 ˚C voor lange perioden.

5. Afbeelding van acquisitie voor immunofluorescentie experimenten

  1. schoon dekglaasje onderin het schip van de cultuur met ethanol en plaats deze terug op het podium van de confocal microscoop. Zorg dat de afdrukstand en positie van het schip in het werkgebied correspondeert met de oriëntatie en standpunt opgenomen wanneer de schade werd veroorzaakt. Beveiligen van het vaartuig van de cultuur om te zorgen voor optimale registratie en beeldvorming.
  2. Zoeken eerder beeld velden met behulp van de registratie-techniek geselecteerd (beschreven in 3.2).
    1. Voor handmatige registratie met behulp van een dekglaasje een geëtste raster wilt uitlijnen, brengen de grid focus en identificeren van merken vinden. Vervolgens gebruik opgeslagen XY-coördinaten om beschadigde cellen te zoeken.
    2. Voor beeld-gebaseerde geautomatiseerde registratie, zoek de structurele functie gebruikt als verwijzing in stap 3.2.1 en vervolgens het uitlijnen van de huidige weergave van de live Microscoop zo dicht op de opgenomen afbeelding mogelijk. Zodra zijn uitgelijnd, meten van de huidige XY Microscoop fase locatie en vergelijk deze met de XY-locatie van het referentiebeeld. De lineaire afstand tussen de twee locaties definieert de X- en Y-verschuiving. Deze offset toepassen op elke opgenomen XY-locatie te identificeren van de velden van de afbeelding met de bestraalde cel. Deze offset functie kan worden in de software van de controle van de Microscoop geautomatiseerd of handmatig uitgevoerd.
    3. Als geen passende registratiepunten kon worden geïdentificeerd, handmatig opzoeken van cellen door het scannen van de dia en lokaliseren van de functies van de eerder geïdentificeerde cel.
  3. Verwerven van beelden met behulp van juiste Microscoop instellingen voor het verzamelen van alle gebeitst streefcijfers, met inbegrip van een helderveld beeld (instellen in sectie 2.3 en zich te concentreren in punt 3.3). In de gepresenteerde experimenten, meerkanaals beelden werden verzameld met behulp van de volgende excitatie laserlijnen en fluorophores: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 en overdraagbare DIC helderveld) en 561 nm (Alexa 546). Alle lasers passeren een akoestisch-optische afstembare Enkelfilter controle op de overdracht van zowel de golflengte van de laser en de macht.

6. Live cell beeldanalyse van de aanwerving van fluorescente proteïnen naar micro-bestraalde sites

  1. Open verworven beelden in een afbeelding analyse toepassing (dat wil zeggen, elementen van de NIS of ImageJ). Indien nodig, combineren de pre bestraling afbeelding met timelapse beelden voor het genereren van een enkel beeld opeenvolging van pre- en post schade inductie. Gebruikers kunnen Toon werving door het meten van veranderingen in fluorescerende intensiteit over het bestraalde gebied ten opzichte van de intensiteit van de fluorescentie te meten over de hele kern (Zie vertegenwoordiger resultaten Figuur 1 B. ).
  2. Voor elke cel worden gemeten, eerst genereren een verwijzing ROI waarmee de kern. Gebruik van een algoritme drempelmethode op het fluorescent signaal dat de pixels waaruit de kern bevat, en vervolgens dit gebied te converteren naar een ROI. Indien nodig, kan de ROI handmatig worden getrokken bij het gebruik van de helderveld als referentie. De ROI pas in de tijdsverloop om ervoor te zorgen het nucleaire gebied nauwkeurig wordt bestreken door de ROI en verslag van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van het fluorescerende signaal binnen deze ROI voor elk frame.
  3. Maak een 6 x 6 pixel ROI voor elke cel te meten en plaats deze over de schade ROI voor elk frame van het tijdsverloop. Deze grotere ROI is nu de schade ROI voor analyse. Verslag van de gemiddelde ROI fluorescentie intensiteit voor elk frame.
    Opmerking: De meeste commerciële software van de analyse van de afbeelding bevat modules voor het volgen van het 2D-object, en er zijn een aantal gebruiker ontwikkelde macro's voor ImageJ of FIJI die vergemakkelijken sneller workflow en hogere doorvoer (zie https://imagej.nih.gov/ij/plugins/).
  4. Normaliseren de gemiddelde schade ROI fluorescentie intensiteit aan die van een overeenkomstige verwijzing ROI in elk frame van de timelapse. Hier, de gemiddelde nucleaire fluorescentie-intensiteit wordt gebruikt als referentie ROI (Zie vertegenwoordiger resultaten Figuur 1). normalisatie kan worden uitgevoerd door de gemiddelde referentie ROI fluorescentie intensiteit van het gemiddelde af te trekken ROI fluorescentie intensiteit beschadigen, of door het verdelen van het gemiddelde schade ROI fluorescentie intensiteit door de gemiddelde referentie ROI fluorescentie intensiteit.
    Opmerking: Normalisatie per divisie kan onvoorspelbare resultaten opleveren, als gebruikt in situaties met zeer lage intensiteit referentiewaarden.
  5. Voor alle beschadigde cellen, alsook voor ten minste twee controle, onbeschadigde cellen herhalen Controleresultaten cel kunnen worden gebruikt voor verdere normalisatie, desgewenst.
  6. Grafiek genormaliseerd intensiteitswaarden na verloop van tijd aan wijzigingen in werving dynamics weergeven als een functie van experimentele behandeling.

7. Afbeelding van de analyse van eiwit werving gedetecteerd door immunofluorescentie

  1. Open pre-en post schade beelden in een afbeelding analyse toepassing. De pre schade beelden bevatten de schade ROI(s) voor micro-bestraling gebruikt. De ROI(s) Kopieer en plak in de beelden na schade gerichte cellen opsporen.
  2. Genereren van een 6 x 6 pixel ROI voor analyse van eiwit werving en plaats deze ROI op de locatie van de schade ROI. Deze grotere ROI is nu de schade ROI voor analyse. Verslag van de gemiddelde schade ROI fluorescentie intensiteit.
  3. Normaliseren de gemiddelde schade ROI fluorescentie intensiteit aan die van een overeenkomstige verwijzing ROI. Hier, de gemiddelde nucleaire fluorescentie-intensiteit van de beschadigde cel wordt gebruikt als referentie ROI (Zie vertegenwoordiger resultaten Figuur 1). De verwijzing ROI genereren met behulp van een algoritme drempelmethode op het signaal van de DAPI te definiëren van de kern, en dit gebied vervolgens omzetten in een ROI. Verslag van de gemiddelde referentie ROI fluorescentie intensiteit. Normalisatie kan worden uitgevoerd door de gemiddelde referentie ROI fluorescentie intensiteit uit de gemiddelde schade ROI fluorescentie intensiteit af te trekken, of door het verdelen van de gemiddelde schade ROI fluorescentie intensiteit door de gemiddelde referentie ROI fluorescentie intensiteit.
    Opmerking: Normalisatie per divisie kan onvoorspelbare resultaten opleveren, als gebruikt in situaties met zeer lage intensiteit referentiewaarden.
  4. Herhaal voor alle beschadigde cellen en dezelfde analyse uitvoeren op ten minste twee cellen, zoals hierboven beschreven.
  5. Grafiek genormaliseerd intensiteitswaarden voor elk micro-bestraling gebeurtenis afgemeten aan tijd om veranderingen in eiwit aanwerving of soort DNA schade weergeven als een functie van experimentele behandeling.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karakterisering van geïnduceerde DNA-schade
Inductie van base laesies en strand einden is afhankelijk van de dosis van de laser toegepast op het geselecteerde gebied van de nucleaire en de mobiele communicatie van de cel model7gebruikt. Fluorescente proteïnen gesmolten om te herstellen van eiwitten, zoals XRCC1, 53BP1, Ku70 of Rad51, voorzien van nuttige single en dubbele strand einde markeringen voor het vaststellen van de minimale energie die nodig is om te zien van accumulatie van een fluorescente proteïne binnen een schade ROI boven de achtergrond fluorescentie9,19,31. Zodra voorwaarden die een antwoord induceren worden gevonden, is het essentieel te karakteriseren van het mengsel van de schade veroorzaakt door die specifieke golflengte en dosis. Demping van de dosis en de duur bij de gebruikte golflengte kunt de gebruiker toestaan te minimaliseren van de vorming van complexe schade mengsels. Hebben aangetoond dat lage laser doses in het bereik van de UV-A produceren voornamelijk SSBs en een kleine hoeveelheid base laesies, geschikt voor het bestuderen van SSBR en BER trajecten10,28. Verhoging van de dosis leidt tot meer complexe basis laesies, oxidatieve en UV geïnduceerde en induceert meer grote aantallen DSBs7,10. Hoewel de inductie van een enkele soorten DNA-beschadiging wenselijk voor behandeling van specifieke DNA-reparatie-studierichtingen is, is het waarschijnlijker dat gebruikers een mengsel van DNA laesies, met een specifieke laesie zoals SSBs wordt veel vaker dan base laesies of DSBs zijn inducerende. Dit is gelijkaardig aan DNA schade mengsels geïnduceerd door chemische agentia zoals waterstof peroxide (H2O2) of een methyl methanesulfonate (MMS)32. Gebruikers moeten zich bewust zijn wanneer zij rapporteert resultaten die schade toebrengen aan mengsels kunnen optreden, en zorgvuldige karakterisering van de dosis en de letsels op de site van de veroorzaakte schade zijn noodzakelijk om ervoor te zorgen de reproduceerbaarheid en de vergelijkbaarheid van de resultaten.

Micro-bestraling studies, wordt XRCC1-GFP vaak gebruikt als een marker voor de inductie van base laesies en SSBs9,28. XRCC1 is een steiger-eiwit dat een belangrijke rol in SSB reparatie (SSBR speelt) en base excision herstellen (BER), en neemt ook deel aan andere reparatie-trajecten, zoals nucleotide excisie reparatie (NER)33,34,35 . Het speelt een belangrijke coördinerende rol in DNA-herstel, interactie met een aantal belangrijke eiwitten, met inbegrip van poly(ADP-ribose) polymerase van DNA Taq β 1 (PARP-1), (Pol β), en DNA ligase III. We gebruikt XRCC1-GFP stabiel uitgedrukt in CHO-K1 cellen om te bepalen van de laser doses vereist voor het genereren van SSBs en DSBs. We voor het eerst geïdentificeerd de minimale dosis die nodig is voor het opwekken van een waarneembare werving van XRCC1-GFP voor elke golflengte (Figuur 1). Voor de 355 nm golflengte, een 2 s Nadruktijd over de gedefinieerde schade ROI gegenereerd een verhoogde fluorescent signaal binnen dat ROI, met vermelding van de inductie van DNA schade, die aantoonbaar werd op de achtergrond (Figuur 1A). Voor 405 nm, een tarief van 8 fps scan nodig was voor het genereren van een waarneembare werving de schade ROI(Figuur 1). De dosis werd vervolgens verhoogd (10 s voor 355 nm en 0.5 fps voor 405 nm) maken een meer intense schade ROI(Figuur 1).

Werving en behoud van XRCC1-GFP op de site van geïnduceerde schade werd vervolgens gecontroleerd door timelapse imaging. Retentie van het eiwit op de site van DNA-beschadiging kan geven gaande DNA-herstel, terwijl de dissociatie van het eiwit van de site van geïnduceerde schade wordt vaak beschouwd als een marker voor voltooiing van BER of SSBR. Er is echter geen duidelijk bewijs koppelen de dissociatie van XRCC1 van laser-geïnduceerde DNA schade sites met de voltooiing van de reparatie. Werving van het eiwit op de site van schade wordt gemeten door de gemiddelde intensiteit van de fluorescentie signaal binnen de beschadigde ROI rapportage over het gemiddelde fluorescent signaal gemeten voor de gehele kern (Figuur 1B). Dit soort normalisatie helpt adres intensiteit schommelingen in het nucleaire signaal, hoewel andere normalisatie technieken kunnen worden gebruikt afhankelijk van de cellulaire verdeling van de proteïne van belang. Hier, is XRCC1 gelokaliseerd in de nucleaire compartiment, zodat normalisatie op nucleair gebied de herverdeling van het signaal naar de schade ROI maatregelen. De gemiddelde TL intensiteit ROI wordt vervolgens geregistreerd voor elke afbeelding in de timelapse, met inbegrip van de pre schade afbeelding, en opgenomen in een grafiek als een functie van de tijd (Figuur 1C).

Wij vervolgens verder gekenmerkt met de schade veroorzaakt door de twee geselecteerde laser doses te bestuderen van de vorming van DNA basis laesies. Vorming van BPR, een omvangrijk UV-geïnduceerde laesie, was eerst, door immunofluorescentie gesondeerd als merkstof voor NER type laesies(Figuur 2). Vervolgens werd de oxidatively geïnduceerde basis lesion8-oxodG gesondeerd als merkstof voor BER type laesies (Figuur 2B). Geen significante toename van de CPD laesies werden waargenomen bij de lage dosis blootstelling voor beide golflengten (2 s voor 355 nm en 8 bps voor 405 nm), terwijl de hoge dosis behandeling bij beide golflengten (10 s voor 355 nm en 0.5 fps voor 405 nm) vertoonde een aanzienlijke stijging in TL het signaal wordt waargenomen binnen de schade ROI(Figuur 2). Een scatterplot van de CPD ROI betekenen intensiteit voor elke beschadigde cel toont heterogeniteit in de vorming van de schade en opsporing bij zowel golflengtes en doses, die aangeeft dat een laag niveau van CPD laesies aanwezig bij de lagere doses kan zijn, maar de belasting niet aanzienlijk kan worden gedetecteerd tot een hogere dosis wordt toegepast. De scatterplot suggereert ook dat inefficiëntie in de opsporing van antilichamen die nauwkeurige kwantificering van de mengsels van de schade kan beperken.

Dit is verder benadrukt in de opsporing van oxidatively geïnduceerde DNA-beschadigingen door de marker 8-oxodG. Geen duidelijke stijging fluorescent signaal binnen de schade ROI werd waargenomen voor 8-oxodG op de golflengte van de laser of dosis gebruikt (Figuur 2B). Het antilichaam gebruikt voor dit werk is in overeenstemming met eerdere publicaties9,10,36; echter, opgemerkt moet worden dat er beperkingen in het observeren van de vorming van 8-oxodG met antilichamen37,38kan zijn. Bevestiging van het ontbreken van oxidatively geïnduceerde letsels wordt ook aanbevolen door een tweede markeerdraad, zoals werving van 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), het enzym verantwoordelijk voor de verwijdering van 8-oxodG van de DNA-10. We deden niet observeren OGG1 werving aan onze DNA schade plaatsen; worden echter, de vorming van lage niveaus van oxidatively geïnduceerde DNA-schade kan niet uitgesloten volledig.

Ten slotte, onderzochten we de vorming van DSBs met behulp van twee markeringen, γH2AX en 53BP-1, bij de selected laser doses met immunofluorescentie (Figuur 3 & 4). ΓH2AX wordt vaak gebruikt als een strand break marker, maar zijn specificiteit voor DSBs heeft gesteld in een aantal verslagen39,40. Bovendien is het een fosforylatie evenement dat zich van de strand vakantie site, voortplant zodat de lokalisatie van het signaal naar een strand vakantie kan worden beperkt als gevolg van het doorgeven van dit signaal. Daarom zorgt combineren γH2AX met 53BP-1 voor een nauwkeurigere beoordeling van DSB formatie in het schade ROI.

De reactie van γH2AX en 53BP-1 op micro-bestraling is zowel golflengte en dosis afhankelijk. De lage dosis (2 s) stimulatie op 355 nm ontlokt geen reactie op de 5 en 20 min, en een zwak en variabele reactie 10 min post bestraling (Figuur 3A) voor beide markeerders. De hoge dosis (10 s) van 355 nm micro-bestraling induceert een verhoogde fluorescent signaal binnen de schade ROI op 5, 10 en 20 min post bestraling die op 40 min (Figuur 3B) wordt verminderd. Deze resultaten wijzen erop dat zorgvuldige titratie van de 355 nm dosis is vereist om te minimaliseren van de Kruis-stimulatie van reparatie trajecten, zoals aangetoond door de verminderde detectie van de dubbele strand break markering γH2AX in de vroege tijd punten (< 20 min) bij de lage dosis toegepast.

Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd met behulp van zowel de lage (8 bps) en de hoge dosis (0.5 fps) 405 nm laser stimulatie (Figuur 4). Bij deze golflengte werd aanzienlijke accumulatie van fluorescerende intensiteit binnen de schade ROI waargenomen voor zowel 53BP-1 en γH2AX ongeacht de toegepaste dosis, die aangeeft dat deze doses bijna een complex mengsel van enkele en dubbele streng pauzes genereren direct na de inductie van DNA-schade (Figuur 4). Bovendien, de hoge doses van 405 nm show een toename van de pan-nucleaire γH2AX kleuring binnen 10 min van schade inductie (Figuur 4B, bodem) dat maakt detectie van de schade ROI moeilijk verslag, terwijl de accumulatie van de 53BP-1 is meer deel uitmaakt van de schade ROI.

Deze resultaten tonen duidelijk aan dat de 405 nm micro-bestraling niet geschikt is voor SSBR of BER toezicht, en dat meerdere markeringen voor DNA adducten en strand einden moeten worden aangewend om te volledig karakteriseren de geïnduceerde laesies en DNA repair reacties.

Dosis-afhankelijke wijziging in de werving en het behoud van XRCC1-GFP
Zodra de geïnduceerde DNA-schade heeft gekenmerkt, kunnen laser-micro-bestraling een ideaal platform voor het bestuderen van de dynamiek van DNA reparatie eiwitten. De retentie en dissociatie kinetiek van de XRCC1-GFP toont een dosis afhankelijkheid (Figuur 1), die niet onverwacht de inductie van mengsels van verschillende schade die elke golflengte is. De hoogste dosis van de bestraling (10 s en 0,5 bps) tonen een hogere intensiteit aanwerving van XRCC1-GFP ten opzichte van de lagere doses en langere bewaring van de XRCC1-GFP op de site van schade in de 20 min tijdsverloop (Figuur 1C). Dit geeft aan dat de DNA-beschadiging gemaakt bij hogere doseringen voor zowel 355 en 405 nm is waarschijnlijk niet opgelost in de loop van het experiment, dat met het uiterlijk en de retentie van DSB markeringen, γH2AX en 53BP-1 strookt (figuren 3 & 4 ).

Interessant is dat Toon de lagere doses van de schade (2 s en 8 bps) snelle aanwerving van XRCC1-GFP naar de sites van de schade en de dissociatie van XRCC1-GFP in de tijdsverloop van de experimentele aan de pre bestraling niveaus (Figuur 1C). Zonder de volledige karakterisering van de schade-mengsel, kan dit leiden tot de conclusie dat de SSBs en base letsels volledig opgelost met behulp van deze schadelijke voorwaarden. Echter de aanwezigheid van γH2AX en 53BP-1 op 40 minuten voor 355 nm en op 5 min voor de 405 nm tot verschillende interpretaties kan leiden. Voor de 355 nm 2 s dosis, kan het mengsel van de schade worden voornamelijk SSBs, zodat het uiterlijk van DSB markers op 40 min erop duiden kan dat bepaalde herstelde laesies tot DSBs leiden kunnen of dat DSBs gegenereerd door deze energie op een langere tijdschaal worden gerepareerd. Schaal tijdverschillen tussen SSBR en DSB reparatie geweest eerder gemelde28,41,42. Ook de 405 nm lage dosis (8 bps) dissociatie kan duiden op een laag niveau van SSBs of een clustering van SSBs die snel worden omgezet in DSBs, die is vastgesteld voor hoge schade micro-bestraling en andere DNA beschadigen agenten eerder43, 44 , 45.

Samen deze resultaten benadrukken het belang van het karakteriseren van de veroorzaakte schade mengsels en eiwitten met behulp van meerdere DNA repair en markeringen voor het interpreteren van de werving en het behoud van DNA herstellen eiwitten op sites van veroorzaakte schade.

figure-results-1
Figuur 1 . Laser-micro-bestraling induceert aanwerving van XRCC1-GFP. 
(A) de CHO-K1 cellen uiten stabiel XRCC1-GFP waren bestraald en beeld vóór en meteen na de inductie van de schade. Pijlen geven aan waar micro-bestraling dosis en schaal bar is 10 µm. (B) Recruitment wordt gemeten door bepaling van de gemiddelde TL intensiteit binnen de schade ROI en normaliseren tot de gemiddelde TL intensiteit van de gehele kern. (C) de dynamiek van werving kan worden gemeten voor elke afbeelding timelapse. Grafieken zijn vertegenwoordiger van twee onafhankelijke experimenten met foutbalken vertegenwoordigen de SEM (n = 24). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 . Laser-micro-bestraling induceert nucleotide schade. 
CHO-K1 cellen waren onderworpen aan laser micro-bestraling en vaste onmiddellijk na schade inductie. Immunofluorescentie werd uitgevoerd om te detecteren CPD en 8-oxodG adducten. (A) boven, scatterplot van de ROI gemiddelde fluorescentie intensiteiten waargenomen in beschadigde cellen na CPD kleuring. Bodem, representatieve beelden van CPD kleuring. Pijlen geven aan waar micro-bestraling en de schaal bar is 10 µm (n = 12). (B) de vertegenwoordiger beelden voor 8-oxodG kleuring. Pijlenaangeven van de locatie van micro-bestraling en de schaal bar is 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3 . DNA dubbele strand break merkers reageren op 355 nm micro-bestraling op een dosis-afhankelijke wijze. 
CHO-K1 cellen waren onderworpen aan micro-bestraling en vastgesteld op de tijd punten aangegeven na stimulatie. Immunofluorescentietest voor de DSB markeringen γH2AX en 53BP-1 werd uitgevoerd. (A) scatter plot van genormaliseerde schade ROI fluorescentie intensiteiten gemeten voor onbeschadigde en beschadigde cellen betekenen. Foutbalken zijn representatief voor de SEM (n = 12). (B) de vertegenwoordiger beelden voor γH2AX en 53BP-1 kleuring. Pijlen geven aan waar micro-bestraling en de schaal bar is 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4. DNA dubbele strand break merkers krachtig reageren op 405 nm micro-bestraling.
CHO-K1 cellen waren onderworpen aan micro-bestraling en vaste op het tijd punten aangegeven post stimuleren. Immunofluorescentietest voor de DSB markeringen γH2AX en 53BP-1. (A) scatter plot van genormaliseerde schade ROI fluorescentie intensiteiten gemeten voor onbeschadigde en beschadigde cellen betekenen. Foutbalken zijn representatief voor de SEM (n = 12). (B) de vertegenwoordiger beelden voor γH2AX en 53BP-1 kleuring. Pijlen geven aan waar micro-bestraling en de schaal bar is 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de voorwaarden beschreven hier, kan elke confocal microscoop met een UV-A of 405 nm laser, geïntegreerd door de fabrikant of toegevoegd door de eindgebruiker, veroorzaken schade van DNA binnen de kern van een cel en laat de aanwerving van DNA reparatie eiwitten op de site van geïnduceerde DNA-schade te worden gevolgd. Echter, zoals vermeld in het protocol en de representatieve resultaten, golflengte selectie, toegepast macht, en karakterisering van de schade zijn alle belangrijke kwesties die eerst door de gebruiker moeten worden aangepakt om te bestuderen van een specifieke DNA herstel traject. Daarnaast zijn er andere overwegingen in experimenteel design die ook door gebruikers moet worden beschouwd.

Om te kunnen volgen van een proteïne gedrag in levende cellen post micro-bestraling, een fluorescently geëtiketteerde eiwit moet worden gemaakt. De beschikbaarheid van een breed scala van fluorescente proteïnen die spectraal kunnen worden gescheiden biedt tools voor het maken van eiwit fusies die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van cellulaire reacties op de inductie van DNA-schade. Voorbijgaande Transfectie van fluorescente proteïnen van belang zorgt voor snelle screening van schadelijke voorwaarden, mutaties of zelfs remmers, terwijl stabiel transfected cellen bieden meer controle over expressie niveaus en voorzien in andere biochemische karakterisaties moet worden uitgevoerd, micro-bestraling resultaten te valideren. Spectraal verschillende fluorescente proteïnen kunnen ook worden gebruikt in dezelfde cel te controleren van de interacties tussen eiwitten binnen de zelfde pathway of in verschillende trajecten. Fluorescerende eiwitten ook elimineren de noodzaak voor specifieke antilichamen tegen elke proteïne van belang en toestaan dat levende cel monitoring van eiwit gedrag voor langere tijd na de inductie van schade.

Het gebruik van fluorescente proteïnen heeft echter ook nadelen. Zonder genetische achtergronden tekort aan de expressie gebrachte eiwitten van belang, zal endogene eiwitten concurreren met de fluorescently tagged eiwitten. Vervoeging van de TL-tag aan de N- of C-terminus van het eiwit kan veranderen vouwing van eiwitten, belangrijkste eiwit-eiwitinteractie belemmeren of blokkeren van de translocatie signalen; veranderen van functie en potentieel beïnvloeden werving dynamiek. Deze effecten zijn aangetoond in een aantal verslagen waar immunefluorescentie kleuring aangetoond drastisch verschillende werving en retentietijden voor endogene eiwitten op de schade site28. Gebruik van voorbijgaande transfectie of stabiele klonen kan ook de respons waargenomen, meestal door variaties in eiwitniveaus expressie wijzigen. Verder, het gebruik van meerdere TL eiwitten in een enkele experiment in te stellen, de dynamiek van werving, ook kan wijzigen als eiwitniveaus niet goed zijn geëquilibreerd of als werving van het grotere fluorescently-tagged eiwit de aanwerving van andere eiwitten blokkeert . Ten slotte, fluorescente proteïnen kunnen fungeren als zwakke sensibilisatie agenten, verhoging van de vorming van reactieve zuurstof soorten en potentieel het wijzigen van de DNA schade mengsels geïnduceerde46,47. Ondanks deze nadelen bieden fluorescente proteïnen een aantal duidelijke voordelen in studeren DNA herstellen met micro-bestraling en als gebruikers passende besturingselementen, zoals de karakterisering van de schade hier beschreven nemen, kan zij nieuw inzicht in schade respons en eiwit-eiwit interacties3.

Als levende cel imaging niet vereist is, kan immunofluorescentie worden gebruikt om te controleren de reactie veroorzaakte schade. Post schade inductie en kleuring met antilichamen specifiek voor eiwitten en letsels van belang, statische momentopnamen van de inductie van de schade en de werving en retentie van reparatie eiwitten kunnen worden gebouwd door de vaststelling van cellen op specifieke tijden. Antilichamen kunnen worden gebruikt om te controleren de aanwerving van meerdere proteïnen van belang en/of posttranslationele modificaties veroorzaakt door de reactie van DNA schade. Gebruik van immunofluorescentie elimineert de noodzaak van fluorescente proteïnen, en zorgt voor de endogene eiwit gedrag worden onderzocht. Echter, deze methode heeft ook nadelen. Zeer specifieke antilichamen nodig zijn, en permeabilization en blokkerende procedures moeten worden geoptimaliseerd zodat voor detectie van werving met voldoende signaalsterkte. Fixing procedures zijn niet onmiddellijk, en deze fysieke beperking beperkt de temporele resolutie van deze aanpak. De site van de inductie van de schade in kaart brengen, zodat de cellen zich kunnen bevinden opnieuw na kleuring kan ook presenteren belangrijke uitdagingen. De confocal microscoop gebruikt in dit werk zorgt voor beeld-gebaseerde registratie zoals hierboven beschreven, zodat beschadigde cellen kunnen worden verplaatst met hoge precisie. Als fase registratie of geëtst dekglaasje niet beschikbaar, de tijd die investeringen betrokken is bij kunnen verhuizen cellen zonder podium registratie, gekoppeld aan de inherente vertraging tussen schade inductie en de verbeelde werving, immunofluorescentie maken onaantrekkelijk aan sommige gebruikers. De meest nauwkeurige en volledige micro-bestraling van de experimentele designs zal echter dit soort benaderingen in parallel met het gebruik van fluorescente proteïnen, opnemen, zoals beschreven in het voorgestelde protocol.

Hier, wordt zowel levende cel beeldvorming en immunofluorescentie gebruikt om aan te tonen het nut van micro-laser-bestraling. Immunefluorescentie kleuring laat ons toe om het mengsel van DNA-schade gemaakt nauwkeurig te onderzoeken en de aanwerving van eiwitten geïnduceerd door elke laser macht, die ons in staat beter te stellen interpreteren de waargenomen veranderingen in de werving en het behoud van XRCC1-GFP. Op basis van deze resultaten, moet het gebruik van 405 nm lasers worden beperkt voor onderzoek van BER en SSBR eiwitten. Verder, de optimale proefopzet macht metingen zou omvatten na de doelstelling, een karakterisering van het mengsel van de volledige schade voor elke regel van de cel gebruikt en validatie van de werving en retentie waargenomen fluorescently gecodeerde eiwitten met immunofluorescentie. Uiteraard, apparatuur, tijd en kosten-overwegingen kunnen maken deze optimale experimentele designs onmogelijk voor sommige gebruikers. Echter het belang van elk van deze elementen blijkt hier, en gebruikers moeten deze overwegingen in gedachten houden bij het begin van micro-bestraling experimenten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedank Dr. Samuel H. Wilson op het National Institute of Environmental Health Sciences voor de cellijnen in dit werk gebruikt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscopeNikon
NIS Elements softwareNikon
355 nm laserPicoQuant VisUVRadiatiebron
Galvanometer fotoactiveringsminiscannerBruker
Microscoopglas fotodiode vermogenssensorTHORLabsS170C
Vezel fotodiode vermogenssensorTHORLabsS150C
Digitaal handoptisch vermogen en energiemeterTHORLabsPM100D
CHO-K1Van Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimaal essentiële mediaHycloneSH3026501
Foetaal bovien serumAtlanta biologicalsS11550
XRCC1-GFPOrigeneRG204952
JetprimePolyplus transfectie11407
GeneticinThermoFisher10131035
4 kamerige dekglasThermoFisher155382
8 kamerige dekglasThermoFisher155409
Anti 53BP-1NovusNB100304
Anti-fosfo-histone H2AX Millipore05-636-I
Anti cyclobutaan pyrimidine dimeerCosmo Bio cloneCAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine Trevigen4354-MC-050
Alexa 488 geit anti-muisThermoFisherA11029
Alexa 546 geit anti-konijnThermoFisherA11010
4’,6-Diamidino-2-Fenylindole (DAPI)ThermoFisherR37606Let op giftig!
Fosfaat gebufferd zoutwaterThermoFisher0780
Normaal geit serumThermoFisher31873
Bovien serum albumine (BSA)Jackson Immuno Research001-000-162
37% FormaldehydeThermoFisher9311Let op giftig!
EthanolDecon Labs2716
MethanolVWRBDH1135Let op giftig!
HClFisherSA49
Natrium azideSigma-AldrichS2002Let op giftig!
Tris HydrochlorideAmrescoO234
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
  2. Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
  3. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  4. Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
  5. Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
  6. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).
  7. Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
  8. Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
  9. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).
  10. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  11. Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
  12. Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
  13. Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
  14. Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
  15. Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
  16. Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
  17. Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
  18. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
  19. Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
  20. Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301(2012).
  21. Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
  22. Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
  23. Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
  24. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  25. Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
  26. Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
  27. Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
  28. Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
  29. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
  30. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135(2013).
  31. Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).
  32. Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
  33. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
  34. London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
  35. Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
  36. Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
  37. Cooke, M. S., Lunec, J. Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , World Scientific. 275-293 (2003).
  38. Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
  39. Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
  40. Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
  41. Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
  42. Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
  43. Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
  44. Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).
  45. Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
  46. Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).
  47. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Inductie van DNA schadeDNA reparatie eiwittenconfocale microscopieenkelstrengsbreukendubbelstrengsbreukenXRCC1 GFP rekrutering355 nanometer laser405 nanometer lasertime lapse beeldvorming

Gerelateerde artikelen