In Vivo Bijhouden van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen in een Rat knie artrose Model met fluorescerende lipofiele membraan kleurstof

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een efficiënte manier om te controleren de cel persistentie en ook menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) door far-red fluorescentie labeling in een rat knie artrose (KOA) model via intra-articulaire (IA) injectie.

Samenvatting

Ter ondersteuning van de klinische toepassing van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSC) therapie voor knie artrose (KOA), onderzochten we de werkzaamheid van cel persistentie en ook van haMSCs in diermodellen. We toonden een methode om de celmembraan van haMSCs met lipofiele fluorescente kleurstof van een label. Intra-articulaire injectie van de gelabelde cellen bij ratten met chirurgisch geïnduceerde KOA werd vervolgens dynamisch gecontroleerd door een in vivo imaging systeem. We gebruikt de lipofiele carbocyanines deed (DilC₁₈ (5)), een far-red analoge tuners fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) en die een rode laser gebruikt Voorkom excitatie van de natuurlijke groene autofluorescence uit de omliggende weefsels. Voorts de rood-verschoven emissie spectra van toegestaan diep-weefsel beeldvorming in levende dieren en de labeling procedure veroorzaakt geen cytotoxische effecten of functionele schade aan haMSCs. Deze aanpak is aangetoond dat een efficiënte tracking methode voor haMSCs in een rat KOA model. De toepassing van deze methode kan ook worden gebruikt om te bepalen van de optimale administratie route en de dosering van MSCs uit andere bronnen in de pre-klinische studies.

Inleiding

Knie artrose (KOA) is een degeneratieve aandoening als gevolg van verlies van de articulaire kraakbeen en progressieve ontsteking, die uitgegroeid een grote chronische ziekte bij ouderen rond de wereld^{1 tot is}. Huidige therapieën met anti-inflammatoire geneesmiddelen, fysieke supplementen en chirurgische procedures kunnen echter alleen tijdelijke verlichting voor symptomatische pijn².

Menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) geworden een veelbelovende regeneratieve remedie tegen artrose van de knie, als gevolg van hun multipotente differentiatie mogelijkheden voor regeneratie van het kraakbeen en immunomodulerende eigenschappen^{3, 4}. Vergeleken met farmacologische routes naar mechanismen van actie in vivoonderzoeken, is het bijhouden van levende haMSCs in kleine KOA diermodellen momenteel leerzaam om vast te stellen van de redenen voor en de haalbaarheid van haMSC therapie voorafgaand aan klinische toepassing. Voor preklinische testen, destabiliseert mediale meniscectomy (MM) de mechanische belasting van het gewricht te bewegen KOA in ratten, waarmee een relatief haalbaar model met consistente reproduceerbaarheid⁵. Het begin van de KOA geïnduceerd door MM is lager dan voorste cruciate ligament transect alleen of in combinatie met gedeeltelijke mediale meniscectomy⁶. De langdurige interacties tussen ingespoten haMSCs met de pathologische communicatie van KOA worden daarom vaak bij ratten geïnduceerd door MM^7,8beoordeeld.

De therapeutische werking van haMSCs is uitgebreid gerapporteerd, relevante kennis op wel de in vivo persistentie van geïmplanteerde haMSCs via intra-articulaire (IA) injectie schaars^9,10. Vandaar, diverse cellulaire labeling methoden zijn ontwikkeld, met inbegrip van de immunohistology¹¹, luciferase¹², groen fluorescent proteïne¹³ transfectie, ijzeroxide labeling voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI)¹⁴ , en talrijke fluorescerende cel kleurstoffen^8,15,16. Vergeleken met de arbeidsintensieve histologie analyses, in vivo niet-invasieve imaging maakt gebruik van optische apparaten te detecteren de real-time verdeling en dynamiek van cellen die zijn gelabeld met de fluorescerende signalen^10,17. Voor functionele levende cel imaging is cytocompatible TL labeling een geavanceerd radioactieve-gratis tracking techniek te onthullen van cellulaire activiteiten na stamcel transplantatie¹⁸. Multicolor fluorescente lipofiele kleurstoffen bezitten bovendien voordelen ten opzichte van amino-reactieve hydrofiele kleurstoffen of fluorescerende eiwitten, met inbegrip van hun verbeterde cel permeabiliteit en verbeterde fluorescentie quantum opbrengsten¹⁹.

Dus de hier opgenomen protocollen gebruiken een rode laser te prikkelen van cellen die zijn gemarkeerd met de lipofiele carbocyanines deed (DilC,₁₈lid 5), die is een far-red fluorescerende Dil (dialkylcarbocyanines) analoge²⁰. De rood-verschoven excitatie en emissie spectra van vermijdt autofluorescent interferentie en diep-weefsel imaging gedurende een lange periode van tijd in levende dieren⁸staat. Deze methode van tracking cellen in vivo aangeduid met deed is geldig voor de controle van de getransplanteerde cellen van de stam, zoals haMSCs, in diermodellen, die is essentieel om te begrijpen en te verbeteren huidige regeneratieve therapie van de stamcel.

Protocol

procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de lokale institutionele Animal Care en ethisch comité, met een poging om te minimaliseren van dierenleed. Het volgende protocol goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) bij mensen van de negende van de Shanghai ’ s ziekenhuis bij Shanghai JiaoTong University School of Medicine met het protocol aangesloten nummer [2017] 063.

1. oprichting van een Surgically-Induced Rat knie artrose Model

1. voor deze chirurgische procedure gebruik 8-12 weken oude mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten met een lichaamsgewicht tussen 250 en 300 g.
2. Anesthetize van de dieren met 40 mg/kg tiletamine en 40 mg/kg zolazepam via intramusculaire injectie.
3. Plaats het dier in een laterale linkerpositie in een verwarmde werkgebied. De rechterknie grondig scheren met een scheermes. Ontsmetten van het chirurgische gebied met 10% providone-jodiumoplossing gevolgd door 70% ethanol, herhaal twee meer tijden dan verf met 10% providone-jodiumoplossing en de niet-chirurgische oppervlakte met een chirurgische zeem.
4. Met behulp van een chirurgische scalpel, het maken van een incisie van 2 cm zijwaarts langs de Patellaire pees blootstellen van de jointcapsules.
5. Kunt een chirurgische scalpel transect van het mediale collaterale ligament. Weerspiegelen de meniscus naar het dijbeen.
6. Steriel 0,9% natriumchlorideoplossing op het oppervlak van de articulaire kraakbeen druppelen tijdens de operatie om te voorkomen dat het kraakbeen uitdrogen.
7. Pak van de mediale meniscus met een tang en snijden door de meniscus op het smalste punt van de tibiale bijlage met een scalpel ( figuur 1A). Voorkomen verwonden het kraakbeen.
8. Sluit de gezamenlijke capsule met een 4-0 absorbeerbare hechtdraad.
9. Volgen de chirurgische rats totdat ze bewustzijn herwinnen.
10. 20 mg/kg gentamicine om te voorkomen dat infectie en 0,05 mg/kg buprenorfine via een intramusculaire route voor het verlichten van pijn na de operatie injecteren.
11. Handhaven de ratten in een temperatuurgevoelig dier faciliteit onder een 12u licht/donker cyclus 3-8 weken tot begin KOA. Dieren blijven ontvangen van pijn medicatie, met inbegrip van maar niet beperkt tot buprenorfine (0,05 mg/kg, i.m.) en gentamicine (20 mg/kg, i.m.), als de pijn symptomen aanhouden.

2. Histologie beoordeling van Rat KOA Model

1. offeren de ratten met buitensporige CO ₂ inademing (Add een opvulling tarief van ongeveer 30% van het volume van de kamer per minuut met kooldioxide aan de bestaande lucht in de kamer om de dierlijke bewusteloosheid binnen 2-3 min. handhaven CO2-stroom voor een minimum van 1 min na ademhaling vervalt.) op aangegeven tijdstippen (vertegenwoordiger van de resultaten worden weergegeven op de 8 weken KOA inductie variërend van 3 tot 8 weken) na de chirurgie.
2. ontleden van de huid en de spieren rond de knie gewrichten en afgesneden van de gewrichten van de knie met een scalpel.
Voor 3 dagen bij kamertemperatuur vast
3. de gewrichten van de knie in 4% paraformaldehyde (PFA). Daarna, decalcify van de monsters in de 20% ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) voor ongeveer 4 weken bij 4 ° C, en de EDTA elke 3 dagen wijzigen.
   Let op: Paraformaldehyde is giftig, het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals handschoenen en bril.
4. Uitdrogen de monsters met behulp van een automatische weefsel processor. Het menu start een flush cyclus als volgt instellen: 70% ethanol voor 1 h; dan 80% ethanol en 95% ethanol voor 1 h respectievelijk; gevolgd door 2 cycli van 100% ethanol voor 1 h; vervolgens, xyleen tweemaal voor 1 h telkens en telkens 3 keer bij 58 ° C gedurende 1 h paraffine.
   Let op: Xyleen is giftig, dus draag passende PPE, zoals handschoenen en bril.
   Opmerking: Gebruik eventueel Coplin potten voor handmatige uitdroging met de dezelfde opzet als de automatische weefsel processor.
5. Plaats van het mediale aspect van het intact gezamenlijke gezicht naar beneden en insluiten in het blok paraffine met weefsel ingebed in het midden.
   Opmerking: Gebruik eventueel pincet inbedden van de monsters in de paraffine blok handmatig.
6. Beginnen te snijden 5 µm Sagittaal secties uit de mediale marge van het gewricht voor 30 µm intervallen met 2 seriële secties door rotary microtome.
7. Secties op glas dia's monteren en deparaffinize van de dia's in xyleen. Tussen de 2 seriële gedeelten, vlekken één dia met haematoxyline & eosine (H & E) kleuring: 0,1% Haematoxyline gedurende 15 minuten, 1% azijnzuur oplossing voor 10 s en 0,5% eosine gedurende 10 minuten. En de andere dia met Safranine O/Fast Green kleuring vlekken: 0,1% Haematoxyline gedurende 15 minuten, 0,02% snel groen voor 3 min, 1% azijnzuur oplossing voor 10 s en 0,1% Safranine O voor 3 min.
   Let op: Xyleen is giftig, passende PPE, zoals handschoenen, bril dragen.
8. Score van de gekleurde dia's met behulp van artrose Research Society International (OARSI) histopathologisch onderzoek beoordelingssysteem in ratten ⁶.

3. Etikettering van menselijke mesenchymale stamcellen met de fluorescerende kleurstof deed

1. cel-labeling oplossing bereiden deed in 100% ethanol bij een concentratie van 1 mM. De cel-labeling oplossing beschermen tegen licht en op te slaan bij kamertemperatuur voor 6 maanden.
2. HaMSCs met standaard cel cultuur procedures in Dulbecco groeien ' s bewerkt Eagle ' s medium (DMEM), aangevuld met 1% penicilline en streptomycine en 10% foetaal kalfsserum (FCS) in een petrischaal 10 cm.
3. HaMSCs met 2 mL 0,25% trypsine met 1 mM EDTA voorafgaand aan ongeveer 80% samenvloeiing loskoppelen.
4. Neutraliseren trypsine met 4 mL gestolde voedingsbodem en draaien de cellen bij 800 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
5. Schorten de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 ⁶ cellen/mL in serumvrij cultuurmedium 5 mL.
6. Het label van de cellen door toevoeging van 50 µL deed cel-labeling oplossing in 5 mL serumvrij cultuurmedium bij 37 ° C gedurende 50 minuten
7. De gelabelde cellen bij 800 x g gedurende 3 min. spin
8. De cellen twee keer wassen met 5 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) bij 800 x g gedurende 3 minuten elk.
9. Check de gelabelde haMSCs met een fluorescente microscoop met een Cy5 filter set.
10. Cellen met trypan blauw kleuring tellen en verkrijgen van 2.5 x 10 ⁶ levensvatbare cellen in 100 µL PBS voor injectie.

4. In Vivo Fluorescerende Imaging Track haMSCs

1. acht weken na de operatie (stap 1), anesthetize de KOA ratten door intramusculaire injectie van 25 mg/kg tiletamine en 25 mg/kg zolazepam.
De rechterknie wordt grondig door
2. scheren met een scheermes om het gemeenschappelijke gebied bloot te stellen. Desinfecteren van de gezamenlijke ruimte met 70% ethanol.
3. Met behulp van een naald van de spuit 26 G injecteren 2.5 x 10 ⁶ label cellen gesuspendeerd in 100 µL PBS in het midden van het gebied van de driehoek gevormd door de mediale zijde van de Patellaire ligament, de mediale femur condyle, en de mediale tibiale condyle ( figuur 1B).
4. De imaging software niet openen en de Bioluminescentie in vivo imaging systeem initialiseren.
5. Positie ratten in de liggende positie in de centrale fase van de imaging systeem en sluit de deur van de kamer.
6. Controleren de " fluorescerende " checkbox en selecteer fluorescerende filter sets van 640 nm voor excitatie en 680 nm voor emissie ( figuur 2A).
7. Selecteer gezichtsveld naar D. instellen pixel weggooien op gemiddeld (8), F/Stop naar 2 en blootstelling tijd op automatisch. Handhaven van de optimale belichtingstijd consistente vergelijkbare resultaten te verkrijgen over de gehele studie ( figuur 2A).
8. Verwijderen het dier uit de fase en de monitor voor het herstel van anesthesie.
   Opmerking: Plaats dier op een verwarming pad bedekt met 2-3 lagen van breedbank.
9. Kies de eenheden van de stralende efficiëntie voor de meting van de fluorescentie ( figuur 2B). Selecteer regio's van belang (ROI) voor analyse en kwantificeren van fluorescerende signalen van elke afbeelding ( figuur 2C).
10. Herhaal de procedure voor in vivo imaging voor elke rat opeenvolgend te bestuderen van de longitudinale retentie van de haMSCs in het gewricht.
    Opmerking: Wij stellen voor dat de dieren imaging ' fluorescerende signalen door in vivo imaging systeem eenmaal om de twee dagen voor de eerste week na de injectie en eenmaal per week totdat het signaal kan niet zitten speurder.

Resultaten

Om te induceren KOA model, werd MM uitgevoerd in het gewricht van de rechterknie van SD ratten (Figuur 3). Acht weken na de operatie, ratten werden opgeofferd en de seriële secties van de gewrichten van knie werden geëvalueerd met beide H & E en Safranine O/snel groen kleuring (Figuur 4). Voor H & E kleuring, het oppervlak van de articulaire kraakbeen tentoongesteld ruwer grenzen in de chirurgie knieën dan het normale gew...

Discussie

Veiligheidsnormen en ook studies van stamcel therapie zijn dringend nodig voordat we regeneratieve stamcel behandeling voor KOA van de Bank aan het bed brengen kunnen. Echter, het pathologische milieu van ziekte speelt een belangrijke rol in de persistentie en ook van getransplanteerde haMSCs¹⁰. Onlangs, heeft onze fractie aangetoond dat intra-articulaire injectie van haMSCs bleef langer in een pathologische KOA omgeving dan injecties onder normale omstandigheden⁸deed. Het ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Matrx VMR dierdieranesthesiesysteem	Midmark	VIP3000
4-0 hechtdraad	Shanghai Jinhuan	KC439
Scheermesje	Pritech	LD-9987
Gentamicine	Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.	Geen
0,9% natriumchloride-oplossing	Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	H43020455
Penicilline	Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.	Geen
Buprenorfine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd.	Geen
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Verdun tot een uiteindelijke concentratie van 10% in PBS
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Verdun tot een uiteindelijke concentratie van 20% in PBS
0,1% Hematoxyline-oplossing, Mayer’s	Sigma-Aldrich	MHS16
0,5% Eosine Y-oplossing, alcoholisch	Sigma-Aldrich	HT110116
Safranine O	Sigma-Aldrich	S8884
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258
Shandon Excelsior ESTM weefselprocessor	Thermo Fisher	A78400006
Shandon Histocentre™ 3 weefselinbeddingscentrum	Thermo Fisher	B64100010
Volledig geautomatiseerde roterende microtoom	Leica	RM2255
DiD	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
D-MEM Hoge glucose	Sigma-Aldrich	D5648
PBS	GIBCO, Life Technologies	14190-144
0,25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-114
10 cm petrischaal	Corning	V118877
Centrifuge	Beckman	Optima MAX-TL
Fluorescentiemicroscoop	Olympus	BX53
0,4% Trypanblauwoplossing	Sigma-Aldrich	93595
Titetamme	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Zolazepam	Virbac (Zoletil 50)	1000000188
Steriele hyposermische spuit voor eenmalig gebruik 26G	Shanghai Misawa Medical Industry	Geen
IVIS Spectrum In Vivo Beeldvormingssysteem	PerkinElmer	124262
Living Imaging 4.0 software	PerkinElmer	Geen