Methodenartikel

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

17.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56279

⸱

20 oktober 2017

 ,  ,  , 
1IFM-Department of Chemistry, Linköping University

In dit artikel

Samenvatting

Amyloïde afzetting is een kenmerk van verschillende ziekten en treft vele verschillende organen. Deze paper beschrijft de toepassing van de fluorescentie van de verlichte geconjugeerd oligothiophene in combinatie met fluorescentie microscopie technieken kleuring. Deze kleuringstechniek vertegenwoordigt een krachtige tool voor de detectie en verkenning van eiwit-aggregaten in zowel klinische en wetenschappelijke opstellingen.

Samenvatting

Eiwitten die als amyloid in weefsels in het lichaam deponeren kunnen de oorzaak of het gevolg van een groot aantal ziekten. Daaronder vinden we neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en Parkinson's ziekte treft voornamelijk het centraal zenuwstelsel en systemische amyloidose waar serum amyloid A, transthyretin en IgG lichte kettingen deponeren als amyloid in lever, carpaal tunnel, milt, nieren, hart en andere perifere weefsels. Amyloid is bekend en bestudeerd voor meer dan een eeuw, vaak met behulp van amyloïde specifieke kleurstoffen zoals Congo rood en Thioflavin T (ThT) of Thioflavin (ThS). In deze paper presenteren we het azijnzuur thiofeen van heptamer-formyl (hFTAA) als een voorbeeld van recent ontwikkelde aanvulling op deze kleurstoffen verlichte geconjugeerd oligothiophenes (LCOs) genoemd. hFTAA is makkelijk te gebruiken en is compatibel met mede kleuring in immunofluorescentie of met andere cellulaire markeringen. Uitgebreid onderzoek heeft bewezen dat hFTAA detecteert een breder scala van ziekte geassocieerde eiwit-aggregaten dan conventionele amyloïde kleurstoffen. Daarnaast kan de hFTAA ook worden toegepast voor optische toewijzing van verschillende geaggregeerde morphotypes dat studies van amyloïde fibril polymorfisme. Terwijl de imaging toegepaste methodologie is optioneel, wij hier tonen Hyperspectrale beeldvorming (ZIS), laser scanning confocal microscopie en fluorescentie levensduur imaging (FLIM). Deze voorbeelden tonen enkele van de beeldvormingstechnieken waar LCOs kunnen worden gebruikt als instrumenten voor meer gedetailleerde kennis van de vorming en structurele eigenschappen van amyloids. Een belangrijke beperking aan de techniek is, wat betreft alle conventionele optische microscopie technieken, de eis voor microscopische grootte van aggregaten om detectie. Bovendien moet het aggregaat een repetitieve β-sheet-structuur te voorzien in bindende hFTAA omvatten. Overmatige blootstelling voor fixatie en/of epitoop die wijzigen de structuur van de statistische of conformatie kan renderen van arme hFTAA bindende en vandaar vormen beperkingen aan nauwkeurige imaging.

Inleiding

Afzetting van amyloid in weefsel is een pathologische kenmerk in een aantal ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, systemische amyloidose en prionziekten. Ondanks de prevalentie van amyloid-gerelateerde ziekten, en het feit dat bijna 40 verschillende eiwitten tot nu toe zijn aangemerkt als amyloïde precursoren in menselijke1, er is weinig bekend over de relatie tussen amyloïde afzetting en ziekte fenotype. Histologie van monsters van menselijke patiënten geweest zowel voor diagnostische en wetenschappelijke doeleinden gebruikt. Een groot aantal dierlijke modellen zijn vastgesteld om de onderzoeken van de correlatie tussen amyloïde last en gedrag, levensduur en een aantal andere fenotypische lezen outs van2,3van de progressie van de ziekte. Ook worden grote inspanningen ondernomen in drugontdekking en design aan de strijd van enkele van onze meest gevreesde wijdverbreide ziekten. De evaluatie van de verbinding tussen het genotype, fenotype, amyloïde plaque belasting en drug administration is echter niet recht vooruit. De hulpmiddelen voor vlekken en beeldvorming van amyloid in weefsel zijn vaak botte en lage resolutie informatie verschaffen over amyloïde formatie en structuur.

Congo rode dubbele breking, ThT en ThS fluorescentie zijn voorbeelden van klassieke methoden voor het opsporen en analyseren van amyloïde last in weefselmonsters van patiënt biopsieën en postmortem monsters en diermodellen voor ziekte4. Deze technieken zijn gebruikt voor decennia (Congo rood sinds de jaren 1920 en ThT en derivaten sinds de jaren 1960), en hoewel de instrumentatie werd verfijnd en voorziet in gedetailleerde analyse, de kleuring procedures en analyse worden nog steeds uitgevoerd op dezelfde wijze als bijna een eeuw geleden.

In dit artikel beschrijven we het gebruik van een hooggevoelige roman amyloïde kleurstof, hFTAA5, waarmee de opsporing van kleine onvolwassen eiwit deposito's met een hoge nauwkeurigheid, evenals de detectie van volwassen amyloid. Vergeleken met conventionele kleurstoffen, is hFTAA bewezen om te ontdekken een breder scala van ziekte geassocieerde eiwit aggregaten5,6,7. Daarnaast kan de hFTAA ook worden toegepast voor optische toewijzing van verschillende geaggregeerde morphotypes8. Hierin beschrijven we hFTAA kleuring en analyse van weefsel van gevestigde diermodellen van prionziekte en Amyloid-β voorloper eiwit (APP) transgene muizen ontworpen na te bootsen plaque ontwikkeling in de ziekte van Alzheimer,9,10 . We tonen ook analyse van diagnostiek en postmortem monsters van patiënten met systemische amyloidose. De LCOs hebben intrinsieke eigenschappen waarmee ze verslag over conformationele verschillen binnen een plaque; en door het combineren van twee LCOs met verschillende eigenschappen met betrekking tot bindende en fluorescentie, het verschil is nog duidelijker11. Een Microscoop epifluorescence uitgerust met lange pass filters en een camerakop hyperspectrale wordt gebruikt om objectieve classificatie van spectrale eigenschappen en opname van microfoto voor spectrale analyse. Confocale fluorescentie microscopie met een afstembare laser als bron excitatie wordt gebruikt ter beoordeling van de drie-dimensionale eigenschappen van een amyloïde plaque in meer detail. De afstembare laser kunt collectie van excitatie spectrum en een stap minder selectie van emissie golflengten op de Microscoop kunt co beeldvorming van LCO fluorescentie en immunofluorescentie bepalen mede lokalisatie van doel eiwit en amyloid. FLIM biedt ongekende gevoeligheid voor conformationele verschillen de LCOs opgelegd en verschillen die niet kunnen worden gedetecteerd op de fluorescentie emissie spectra onthult.

De belangrijkste doelstellingen met de beschreven kleuringstechniek zijn te vergemakkelijken van gevoelige detectie van amyloïde stortingen en te karakteriseren conformationele polymorfisme binnen amyloïde deposito's. Deze kennis is belangrijk voor de basiskennis van eiwit aggregatie ziekten.

Protocol

Opmerking: LCO synthese is verricht in onze laboratoria voor meer dan een decennium. Door protocollen voor elektrofiele aromatische substitutie, palladium-gekatalyseerde Kruis-koppeling, amide koppeling en ester hydrolyse in wezen toe te passen, passen we synthetisch sondes voor verschillende doeleinden 5 , 12. na de synthese, karakterisering en zuivering, het LCO product gelyofiliseerde vorm en bewaard bij kamertemperatuur. Sommige van de sondes (onder hen hFTAA) zijn nu commercieel beschikbaar (Zie Tabel of Materials).

1. LCO kleuring oplossing

Opmerking: Volg de leverancier als hFTAA is gekocht bij een commerciële leverancier, ' s instructies in plaats van sectie 1.

  1. Resuspendeer de gelyofiliseerd hFTAA in 2 mM NaOH te bereiden van een stamoplossing van 1 mg/mL. Houden van de voorraad in een glazen ampul bij 4 ° C. De voorraad kan worden opgeslagen voor eenjarig.
  2. Op de dag van de kleuring, een werkende oplossing te bereiden door verdunning van de voorraad 1:10,000 in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).

2. Voorbereiding van weefselmonsters

Opmerking: vele weefseltypes (HLA) kunnen worden beeld met behulp van hFTAA als een amyloïde marker. Zie afbeelding 1 voor voorbeelden. hFTAA is gevoelig voor statistische bevleesdheid. De kleuring dient dus bij voorkeur worden uitgevoerd op undisrupted aggregaten met geen epitoop blootstelling. Optimale spectrale kwaliteit wordt bereikt als de fixatie van het weefsel tot een minimum is beperkt. Vers ingevroren materiaal, zachtjes opgelost in ethanol ten tijde van de kleuring, is daarom aangewezen. Het is echter mogelijk om te detecteren amyloïde deposito's ook in weefsel dat is bevestigd met bijvoorbeeld formaline. hFTAA dringt het weefsel in het algemeen goed. Selecteer de dikte van een specimen dat compatibel is met de beoogde imaging techniek.

  1. Als formaline vaste, parafinembedded secties worden gebruikt, deparafinize in xyleen over nacht. Dompel de secties in opeenvolgende baden van 99% ethanol, 70% ethanol, dH 2 O en PBS, 10 min in elk. Toestaan dat de weefselsecties te drogen onder de omgevingsomstandigheden.
    Let op: Xyleen wordt altijd afgehandeld in een chemische zuurkast. Xyleen en andere organische oplosmiddelen zijn schadelijk.
    1. Dooi cryosecties bij kamertemperatuur. Los de weefselsecties in 10% formaline 's nachts en hydrateren door dompelen hen in opeenvolgende Thermen van 99% ethanol, 70% ethanol, dH 2 O en PBS, 10 min in elk. Toestaan dat de weefselsecties te drogen onder de omgevingsomstandigheden.
  2. Druppels van de werkoplossing hFTAA (ongeveer 200 µL) toevoegen aan de weefselsecties te bedekken. De druppel moet blijven in plaats van oppervlaktespanning. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor kleuring.
  3. Rinse uit de kleurstofoplossing met 500 µL PBS met behulp van een precisiepipet en vervolgens het onderdompelen van de dia in het bad van de PBS voor 10 min. toestaan de sectie te drogen onder de omgevingsomstandigheden.
  4. Mount met behulp van de fluorescentie montage medium. Toestaan van montage middellange tot 's nachts regelen.
    Opmerking: hFTAA kleuring kan worden uitgevoerd in combinatie met andere kleuring methoden, zoals specifieke markeringen in een cel- of organel, immunofluorescentie, enz. Standaardinteracties mede kleuring, voer uw volledige kleuring protocol van keuze en hFTAA kleuring aan het eind, vanaf stap 2.2 toevoegen. Zie Figuur 2 voor voorbeelden. Selecteer voor immunofluorescentie, bij voorkeur een secundair antilichaam dat is enthousiast op 640 nm of hoger. In dit golflengtegebied, hFTAA doet niet absorberen en vandaar niet opgewonden en niet fluoresceren. Dit zorgt ervoor dat geen afloop-through wordt gezien tussen hFTAA en antilichaam.

3. Microscopie

Opmerking: gebruik een fluorescentie Microscoop uitgerust met lange pass filters. Alle onderstaande instellingen werden gebruikt voor het genereren van de afbeeldingen in Figuur 4. Aanpassingen mogelijk moet worden gemaakt, afhankelijk van het amyloid type en weefsel monster. Hoewel hFTAA gebonden aan amyloid stabiel naar bleken is, is het raadzaam voor zwenking vandoor de lichtbron wanneer het model niet is onderzocht of beeld.

  1. HIS
    Opmerking: het experiment werd uitgevoerd met behulp van een Microscoop epifluorescence met lange pass emissie filters en een camerakop voor zijn (Zie Tabel van materialen).
    1. Gebruik een standaard fluorescentie Microscoop uitgerust met lange pass filters en een hyperspectrale camera. Ervoor te zorgen dat de spectrale camera is gekalibreerd.
    2. In de software, geef het project de naam, selecteert u " spectral image " en start acquisitie.
    3. Selecteer het object van belang door het oculair met behulp van de filter van de 436 nm excitatie en het licht pad verschuiven naar de camera.
    4. In the Case Data Manager (CDM), selecteer het monster type spectrale, label het monster, en het verwerven van de pers. Het overname-venster wordt geopend.
    5. In het venster van de overname " spectrale imaging ", opent het instellingenmenu, selecteer overname eigenschappen en reeks de spectrale tot 460-700, de kwaliteit van de snelheid op maximale snelheid, en de meting typt bij gas/laser/smalle filters. Sluit het dialoogvenster.
    6. In het menu Beeld, selecteer leven volledig. In de bar van de pictogrammen, franjes uit te schakelen. Selecteer of het formaat van een regio naar afbeelding die de piekwaarde van de geheugen onder 800 MB heeft. De blootstellingstijd instellen op een waarde die een totale beeld helderheid tussen 1000 en 3000 geeft. In de bar van de pictogrammen, drukt u op de gekleurde camera. Overname zal beginnen. Wanneer Beeldacquisitie voltooid is, drukt u op opslaan in het " ophaal spectral image " dialoogvenster en " nieuwe cel " in het dialoogvenster beheren aanvraaggegevens.
    7. Van het CDM, open de verzamelde beeld met behulp van de knop start analysis. Het venster gegevens analyse zal openen.
    8. Spectrale informatie kan worden verzameld van elke pixel van de afbeelding door het selecteren van ROIs met behulp van het dialoogvenster spectrale display. Kies " definiëren " en selecteer ROIs in de relevante gebieden van de afbeelding.
    9. De spectrale gegevens opslaan als een tekstbestand met de Lib-knop. De opgeslagen txt-bestand kan worden geïmporteerd in elk analysesoftware van keuze. Het .slb-bestand kan worden gebruikt voor analyse binnen de software van de analyse van de gegevens. De hyperspectrale kubusgegevens afkomstig uit de gehele afbeelding kan ook worden geëxporteerd als een raw-bestand, als " lagen als tif ", of als " lagen in tekstindeling " voor gegevens en de beeld analyse applicaties met behulp van externe software.
  2. Confocale microscopie
    Opmerking: de confocal microscoop is uitgerust met een afstembare laser als bron excitatie. Voor alle fluorescentie emissie experimenten, stelt u de intensiteit van de laser tot 0,2% (overeenkomend met een gemiddeld vermogen van 3 μW), het gaatje naar 1 luchtige eenheid, de framegrootte tot 1024 px x 1,024 px, de snelheid van de scan als 7 en gemiddeld meer dan 16 scans, en de bitdiepte als 8 bit (zie < s Trong > tabel van materialen). Deze instellingen moeten worden aangepast voor elke individuele confocal systeem, laserbron en monster type.
    1. Voor het emissiespectrum, verzamelen de gegevens met behulp van lambda-modus en de excitatie met behulp van argon laser ingesteld op 488 nm. Verzamelen emissie tussen de 503 en 687 nm 22 kanalen met de 32 kanaal GASP detector. De winst plaatste aan 755.
    2. Tot één kanaal afbeeldingen, gebruik de smart optie instellen. Voor FITC (groen filter), de winst op 750 ingesteld en Alexa 535 (rood filter) Stel de winst op 845.
    3. Voor het verzamelen van de excitatie-spectrum met de afstembare laser, gebruik excitatie met 1 nm stappen tussen 490 en 545 nm terwijl het verzamelen van emissie tussen 551 en 586 nm. De laser-intensiteit ingesteld op 2% (overeenkomend met een gemiddelde kracht van 30 μW) en de winst voor de 774.
    4. Voor het verzamelen van Z-stack in de spectrale modus scannen door de diepte van de sectie in stappen van 0.96 µm. Dezelfde excitatie en emissie instellingen zoals in stap 3.2.1 kunnen worden gebruikt, maar de winst ingesteld op 730.
  3. FLIM
    Opmerking: de confocal microscoop is voorzien van een FLIM eenheid (Zie Tabel van materialen).
    1. De volgende parameters voor de confocal microscoop instellen: Pinhole, 20; excitatie golflengte, 490 nm; laser intensiteit, 0,5% (overeenkomend met een gemiddeld vermogen van 7,5 μW). Gebruik van gepulste lasers op 40 MHz.
    2. In the FLIM software, instellen van foton tellen meer dan 550 nm. In het venster Eigenschappen voor beeldscherm-parameters volgen het foton tellen totdat de Max telling ongeveer 4.000 foton graven is.
    3. Het bestand opslaan en exporteren als afbeelding van de SPC.
    4. Passen de gegevens aan een exponentiële afname van 2-componenten in de software van de FLIM. Een pasvorm die een χ 2 geeft < 2 is goed. De waarde op de y-as is het aantal graven voor de opgegeven levensduur.
    5. Selecteer een drempel voor graven op te nemen, bijvoorbeeld 100. Kleur code door T1 en levensduur bereik selecteren. Het verval is afhankelijk van de amyloïde structuur waar de hFTAA is gebonden. De levensduur van de fluorescentie tussen 300 en 1000 ps zijn waargenomen. Sla het bestand op.
    6. De onbewerkte gegevens exporteren met behulp van de exportopties en sla de gewenste gegevens in een nieuwe map.

Resultaten

Gevoelige en selectieve kleuring van amyloïde deposito's van een groot aantal proteïnen in vele verschillende weefseltypes (HLA) van zowel de menselijke patiënten als de proefdieren is essentieel voor de klinische diagnostiek zo goed zoals in wetenschappelijk onderzoek. In deze paper, we laten zien hoe dit kan worden bereikt met behulp van LCOs, wordt geïllustreerd door de hFTAA, voor de kleuring en multimodale beeldvorming van amyloid uit een selectie van weefseltypes (HLA). Sinds de eerste publicatie van amyloïde liganden thiofeen gebaseerde meer dan tien jaar geleden13, amyloid deposito's bestaat uit een breed scala van eiwitten in een verscheidenheid van weefsels hebben zijn beeld met behulp van LCOs6,7,11, 14,,15,16 (Figuur 1). In combinatie met antilichamen of andere histologische markeringen bieden de LCOs uitstekende hulpprogramma's voor zowel de wetenschappelijke als de diagnostische doeleinden (Figuur 1a, Figuur 2). Met een juiste selectie van fluorescente markeringen, kan verschillende fluorophores beeld worden op dezelfde sectie (Figuur 1a, hFTAA en DAPI, Figuur 2a hFTAA in immunofluorescentie setup). Het is ook mogelijk om opeenvolgende secties gebruiken voor kleuring met helderveld en fluorescentie (Figuur 2b, hFTAA en DAB antilichaam kleuring). Onlangs, hFTAA heeft bewezen een zeer veelbelovende aanvulling op Congo rode vlekken in klinische diagnostiek7,15 (Figuur 3).

Ontwikkeling van beeldvormingstechnieken in de afgelopen decennia is de behoefte van amyloïde kleurstoffen die onderscheid tussen minuut, maar op de dezelfde tijd diepgaande verschillen in amyloïde deposito's op een kwantitatieve manier maken kan toegenomen. Het geconjugeerd systeem binnen de LCO biedt het een unieke mogelijkheid om te rapporteren over variatie in haar wijze van bindend. Verdraaien van het molecuul kan leiden tot verstoring in de bindende hoeken in het geconjugeerd systeem en belemmeren het vervoer van elektronen (figuur 4a). Dit weerspiegelt op zijn beurt op de fluorescerende eigenschappen van het LCO zowel in golflengte van excitatie en emissie uitstoot levensduur. Wij gebruiken zijn in een rechtop fluorescentie Microscoop uitgerust met lange pass filters voor emissie. Voor excitatie en emissie spectra in confocale microscopie en FLIM gebruiken we een LSM780 met de gepulste laser. Om te illustreren de verschillende technieken, beeld wij één object (de bèta amyloid (Aβ) plaque in een APP transgene muis) (figuur 4b-e). Hyperspectrale fluorescentie spectra (figuur 4b) zorgt voor de evaluatie van spectrale verschuivingen en intensiteit variatie in verschillende regio's van de plaque. Excitatie spectrum in confocale microscopie (Figuur 4 c) kan worden gebruikt om te bepalen van de optimale excitatie golflengte voor downstream experimenten, bijvoorbeeld, combinatie met verschillende fluorophores kleuring. Deze methode kan ook nuttig zijn voor de detectie van conformationele verschillen in de wijze van de binding van het LCO. Emissiespectrum in confocale modus kan worden gebruikt voor het bepalen van de fluorescentie emissie-eigenschappen van hFTAA of van een combinatie van verschillende fluorophores te evalueren van colocalization in combinatie met verschillende LCOs of LCO en immunofluorescentie experimenten combinaties. De levensduur van de fluorescentie van hFTAA is sterk beïnvloed door kleine variaties in de bindende wijze van hFTAA. Vandaar is FLIM een krachtig hulpmiddel in het onderscheid tussen de verschillen hFTAA opgelegd door de bindende doelstelling (Figuur 4 d). Dit kan bijvoorbeeld worden gebruikt in de discriminatie tussen verschillende prion stammen8. Confocale beeldvormings- en Z-stacks verwerking tot driedimensionale beelden is een nuttig instrument voor het verkennen van de algehele vorm van een amyloïde aggregaat (figuur 4e). Nogmaals, het gebruik van extra fluorophores kan helpen bij het begrijpen van de samenstelling van een storting.

figure-results-1
Figuur 1: verschillende weefsel typen en eiwitten aggregaten weergegeven: h-ALCA kleuring van: (een) Mallory-Denk organen bestaande uit keratine aggregaten in een lever (counterstained met DAPI), (b) p62-positieve r inclusies in sporadische integratie-lichaam myositis (s-IBM) spierweefsel, (c) Amyloid van islet amyloïde polypeptide in menselijke alvleesklier, (d) Amyloid van immunoglobuline lichtketting in de menselijke darm, (e) schapen scrapie (prionen) in muis hersenen, (f ) Chronische ziekte (prionen) in muis hersenen, (g) Aβ plaques in APP23 muis hersenen, verspillen (h) Aβ pathologie in APP/PS1 muis hersenen, en (ik) vet biopsie uitstrijkjes van diagnostische monsters van transthyretin amyloid in menselijke patiënten 1-4 volgens standaard Congo rood (CR) scoren ingedeeld. Gele gebieden Toon hFTAA gekleurd amyloïde deposito's en blauw is autofluorescence uit vetweefsel. De lengte van de balk schaal wordt opgegeven in elk deelvenster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: voorbeelden van co kleuring met antilichamen. (een) mede kleuring met anti-amyloïde serumeiwit A (AA) immunofluorescentie en hFTAA van menselijke AA amyloid op dezelfde sectie. Linksboven: AA antilichaam emissie 640 nm; hogere juiste hFTAA op 488 nm; onderste paneel overlay afbeelding weergegeven: colocalization in geel. (b) antilichaam kleuring en hFTAA fluorescentie op opeenvolgende secties. BOVENPANEEL: AA antilichaam DAB kleuring, onderste paneel: hFTAA beeld met een longpass emissie filter. Schaal bar: 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: Fluorescentie vergelijken met korte pass filters op transthyretin amyloid in het menselijke hart gekleurd met Mayers Haematoxyline/Congo rood (een-d) en Mayers Haematoxyline/hFTAA (e). (een) helderveld beeld, (b) helderveld, fluorescentie, (c) helderveld + gekruiste polarisatoren, (d) helderveld fluorescentie + gekruiste polarisatoren, (e) hFTAA fluorescentie in 405nm + 480 nm excitatie (opeenvolgende secties naar een-d). Schaal bar: 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4: hetzelfde object gekleurd met hFTAA en beeld met verschillende technieken wordt aangetoond door middel van één Aβ plaque in een leeftijd APP23 muis. (een) de fluorescentie eigenschappen van hFTAA is ingegeven door de conformationele staat. Structuur van de hFTAA in vlakke en gedraaide staat wordt weergegeven. (b) Hyperspectrale beeldvorming voor evaluatie van continu emissie spectrum. Spectra in het onderste deelvenster zijn kleur gecodeerd volgens boxed regio's van belang in de afbeelding. (c) (i) Confocal imaging voor excitatie beeldvorming en (ii en iii) spectrum en emissie beeldvorming in de filtermodus is geopend of (iv) spectrale modus. (d) fluorescentie levensduur imaging voor detectie van conformationele verschillen in de amyloid, kortere levensduur zijn gevonden in de periferie van de plaquette Aβ waarbij het leven keer langer zijn in het midden van de plaque. Histogram in het onderste deelvenster toont distributie leven vaak voor de gehele plaque. Het beeld is gekleurd volgens de schaal onder het histogram. (e) Confocal Z-stack verzameld in de filtermodus is geopend om de driedimensionale structuur van objecten weer te geven. De lengte van de balk schaal wordt opgegeven in elk deelvenster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Afzetting van aberrantly gevouwen eiwitten in amyloid is een belangrijke gebeurtenis van vele ziekteprocessen. Extracellulaire amyloïde plaques samengesteld uit Aβ peptiden en intracellulaire neurofibrillary klitten gevormd door hyperphosphorylated tau zijn te vinden in de hersenen van Alzheimer-patiënten. Een assortiment van verschillende eiwitten, bijvoorbeeld, transthyretin (TTR), Serum Amyloid A component (SAO), en IgG lichtketting misfold en manifest als amyloïde deposito's in weefsels buiten de CNS. Hoewel amyloid deposito's zijn bekend en studeerde voor meer dan een eeuw, we nog steeds niet over gedetailleerde kennis van hoe amyloïde wordt afzetting gestart op moleculair niveau en wat kan worden gedaan om te voorkomen dat dit proces. Voor Alzheimer's disease is het noodzakelijk om te bevestigen hoe het proces van amyloidose neurodegeneratie gekoppeld is. Één belangrijke zoektocht op de missie voor de behandeling van amyloidose is verfijnd om roman tools voor de monitoring van amyloïde initiatie, progressie en regressie; Vandaar is gerichte amyloïde detectie de sleutel. Op de lange termijn, zullen klinische diagnostiek profiteren van het verhogen van de gevoeligheid en selectiviteit van amyloïde kleuring methoden7,15. Huidige uitdagingen in dit opzicht zijn enorm en is een zeer actief onderzoeksgebied. Een hoofdthema voor klinische ontwikkeling en proeven is prognostische diagnose. Deze ziekten waarschijnlijk starten goed voordat de symptomen verschijnen, maar om te beginnen met de behandeling er moet identificatie van de ziekte. Gevoeligheid is hierin een belangrijk aspect voor nieuwe methoden. Bovendien, deze kwestie is nog complexer omdat sommige eiwit-aggregaten giftig zijn, sommige beschermende zijn, en sommige neutraal zijn. Vandaar is de mogelijkheid om te controleren op specifieke geaggregeerde morphotypes essentieel aangezien het bestaan van verschillende geaggregeerde soorten om uit te leggen het heterogene fenotype gemeld voor een verscheidenheid van neurodegeneratieve eiwit aggregatie ziekten heeft gesuggereerd. Bijvoorbeeld, is het prion-eiwit een klassiek voorbeeld van hoe een identieke primaire opeenvolging van aminozuren kan voorkomen in verschillende statistische morphotypes, die aanleiding tot specifieke prion stammen geven. Soortgelijke polymorfisme is ook gemeld voor Aβ peptide, α-synuclein, en tau. In dit verband LCOs gebleken te zijn uitstekende tools voor optische toewijzing van verschillende geaggregeerde morphotypes. Prion-stam-specifieke eiwit-aggregaten, eiwit deposito's gevonden in verschillende soorten systemische amyloidose, evenals polymorfe Aβ en tau aggregaten hebben is onderscheiden als gevolg van de conformationally geïnduceerde optisch fenomeen waargenomen vanaf de LCOs.

Amyloïde afzetting is een evenement dat in de weefsels die moeilijk plaatsvindt te penetreren met biochemische of biofysische methodes van moleculaire precisie. De mogelijkheid om te sonderen gebeurtenissen ex vivo, in vivoen in vitro met behulp van de dezelfde LCO moleculen stelt het podium ontrafeling gebeurtenissen die zich in vivo met technieken die alleen mogelijk toe te passen op ex vivo of voordoen zijn in vitro monsters11,17. Een onlangs gerapporteerde hoge resolutie structurele model toont aan dat de pentameric LCO ALCA (pFTAA) in een holte gevormd door uitgelijnde zijketens parallel met de as van de fibril verspreid over 6 in-register bèta-samengebonden18 bindt, waaruit blijkt dat het mogelijke atomaire resolutie kennis over de entiteiten van het LCO doel te krijgen. De bindende Holte en bindende wijze van pFTAA is in wezen vergelijkbaar met Congo rood19, ingegeven door een groef bekleed met repetitieve positief geladen Lys-zijketens. De affiniteit van LCOs lijken te worden beter in vergelijking met Congo red waarschijnlijk te wijten aan de flexibiliteit van de keten en sterke van der Waals interacties van de zwavel atomen van de thiofeen ringen naar de hydrofobe holte. De opsporing van prefibrillar soorten (vóór ThT reageert)5,20 verschijnt afhankelijk van repetitieve β bladen, samengesteld uit parallel-bèta-strengen van de in-registreren, die voor hFTAA worden twee thiofeen eenheden langer dan pFTAA zou overschrijding van de maximaal 8 bèta-strengen beslaan.

De kleuring protocol vereist aandacht te besteden aan opsporen van storingen bij de volgende stappen uit: (i) fixatie: uitgebreide fixatie van weefselmonsters kan verstoren de amyloïde structuur en beperken de mogelijkheid om te detecteren variatie in fluorescentie spectra geïnduceerd door conformationele vervorming van het hFTAA molecuul. Milde fixatie van cryosecties van vers bevroren materiaal heeft de voorkeur om optimale spectrale resolutie. Echter zal de hFTAA vlek en lichten amyloid in vaste weefsel maar met verminderde werkzaamheid en minder spectrale variatie. (ii) epitoop blootstelling: voorbehandeling van weefsel tot epitoop blootstelling voor antilichaam-bindende af en toe de mogelijkheid voor hFTAA om te binden beperken misschien omdat verstoord amyloïde structuur. Als dit een probleem is en epitoop blootstelling een cruciale stap in het antilichaam kleuring protocol is, met behulp van opeenvolgende secties voor antilichaam en hFTAA, kunnen respectievelijk worden beschouwd. (iii) overstaining: hFTAA is uiterst gevoelig. Werkoplossing dient te worden bewaard bij lage nM concentratie. Vermindert de concentratie van hFTAA indien achtergrondkleuring een probleem is. Als elementen die hFTAA binden schaars in het weefsel zijn, kan een overmaat van hFTAA statistische en zich ophopen in het medium van de montage. Dit wordt erkend als de fluorescentie die niet in het vlak van de focus van het weefsel zelf. Als dit wordt weergegeven, dompel u de gekoppelde dia in PBS totdat u de slip van de cover van de sectie kan worden geschoven, wassen met PBS en remount met verse montage medium en een nieuwe cover slip. (iv) filter gebaseerd beeldvorming: dit Witboek beschrijft meestal spectraal opgelost fluorescentie geschikt zijn met behulp van lange pass filters of meerdere detectie kanalen. hFTAA kunnen ook worden gecontroleerd met behulp van korte pass filters. Wees u ervan bewust dat dit zal het contrast verminderen en afschaffing van de mogelijkheden voor het detecteren van meerdere kleuren.

De laatste jaren is het geworden duidelijk dat als onderzoekinstrumenten te, TL LCOs en in het bijzonder hFTAA zeer veelbelovende eigenschappen weergeven. Resultaten voor een grote verscheidenheid van eiwitten en ziekte staten, variërend van hFTAA detectie van aggregaten binnen cellen (tau, integratie lichaam myositis), systemische amyloid van serum amyloid A, transthyretin, Immunoglobulin lichte kettingen hebben aangetoond (kappa en Lambda) seminogelin 1, prion-eiwit (met inbegrip van klinische monsters)21Islet amyloïde polypeptide en insuline7,15. Een beperkende factor voor de uitvoering van hFTAA als een diagnostisch hulpprogramma is dat fluorescentie microscopie wordt niet uitgebreid gebruikt in routine amyloïde pathologie labs. Bovendien is zijn niet beschikbaar in de kliniek. Echter hFTAA amyloïde kleuring en fluorescentie microscopie in klinische laboratoria in een filter op basis van de fluorescentie Microscoop zijn gebruikt en moetenworden beschouwd als een gratis diagnostische methode. Dit werd onlangs aangetoond op carpaal tunnel biopsieën met transthyretin amyloidose met behulp van de basisinstellingen voor fluorescentie in een geautomatiseerde wijze22.

Verder naast verschillende eiwitten, hFTAA fluorescentie herkent een grote verscheidenheid van fibril soorten en vooraf fibrillar amyloïde aggregaten, bijvoorbeeld, traject fibrillar soorten hebben gevonden en gekenmerkt. In deze publicatie laten we één LCO op verschillende typen van de monster met behulp van drie microscopie technieken. Het gebruik van gecontroleerde synthese heeft ook toegestaan voor de ontwikkeling van LCOs voor veelzijdige detectie van biomoleculaire doelstellingen, bijvoorbeeldregistratie van de interacties door oppervlakte plasmon resonantie (SPR)23 en radiolabeling voor positron-emissie tomografie (PET)24.

Tot op heden zijn meer dan 25 verschillende LCOs met gepubliceerd. Een intensiever gebruik van LCOs voor beeldvorming van amyloïde deposito's vergroot de kennis en begrip van hoe deze ziekte-geassocieerde aggregaten monteren, demonteren en interfereren met de organen en de personen waar zij wonen.

Openbaarmakingen

PH PN MB SN zijn kleine aandeelhouders in Ebba Biotech die hFTAA onder de merknaam Amytracker545 commercialiseert.

Dankbetuigingen

De auteurs bedank Mikael Lindgren en Chanan Sluzny voor advies over fluorescentie microscopie, en Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark en Kurt Zatloukal om bij te dragen weefselsecties of microfoto weergegeven in deze publicatie. Het verzamelen van gepresenteerde gegevens hierin is gefinancierd door bijdragen van Zweedse hersenen Foundation (Hjärnfonden), de Zweedse Alzheimer association (Alzheimerfonden), de Zweedse Onderzoeksraad (VR), de vereniging van Göran Gustafsson, Georg & Astrid Olsson, EU KP7 Gezondheidsproject LUPAS en de Universiteit van Linköping.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
hFTAA/Amytracker545Ebba Biotech
Dako fluorescene mounting mediumAgilent technologiesGM304
LeicaDM6000Leica
Lumen 200Prior
Spectraview systemASI spectral imaging
Spectraview softwareASI spectral imaging
LSM780Zeiss
Zen 2010b v6.0 softwareZeiss
FLIM systemBecker & Hickl
Ar/ML 458/488/514Zeiss
Tunable Laser In TuneZeiss

Referenties

  1. Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
  2. Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
  3. Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
  4. Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. , 3-25 (1999).
  5. Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
  6. Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
  7. Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
  8. Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
  9. Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
  10. Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
  11. Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
  12. Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
  13. Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
  14. Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
  15. Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
  16. Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
  17. Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44(2016).
  18. Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123(2015).
  19. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).
  20. Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
  21. CORDIS. Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). , European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).
  22. Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. , 1-9 (2017).
  23. Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
  24. Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).

Herprints en machtigingen

Tags

Amylo dedetectiehFTAA kleuringbeeldvorming van eiwitaggregatenpreparatie van weefselcoupesspectrale data analysefluorescentiemicroscopieamylo defibril polymorfisme
Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.