Optische Screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes op Ex Vivo menselijke longweefsel door Confocale Laser Endomicroscopy

Samenvatting

Deze techniek beschrijft een efficiënte screeningsproces voor de evaluatie van de bacteriën-specifieke optische beeldvorming agenten binnen ex vivo menselijke longweefsel, door fibered confocal fluorescentie microscopie voor de snelle identificatie van klein molecuul chemische sonde-kandidaten met vertaalbare potentieel.

Samenvatting

Verbetering van de snelheid en nauwkeurigheid van de detectie van bacteriële is belangrijk voor de patiënt stratificatie en om het juiste gebruik van antimicrobiële stoffen. Om dit te bereiken, de ontwikkeling van diagnostische technieken om te herkennen van de bacteriële aanwezigheid in real-time op de point-of-care is vereist. Optische beeldvorming voor directe identificatie van bacteriën binnen de host is een aantrekkelijke aanpak. Verschillende pogingen om chemische sonde ontwerp en validatie zijn onderzocht, echter geen zijn nog met succes vertaald in de kliniek. Hier beschrijven we een methode voor ex vivo validatie van bacteriën-specifieke sondes voor de identificatie van bacteriën in de distale Long, beeld door fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM). Ons model gebruikt ex vivo menselijke longweefsel en een klinisch goedgekeurde confocale laser endomicroscopy (CLE) platform scherm roman bacteriën-specifieke imaging verbindingen, nauw nabootsen imaging voorwaarden moeten worden geconfronteerd met patiënten. Daarom biedt screenen verbindingen door deze techniek vertrouwen van potentiële klinische werkwillig.

Inleiding

Deze techniek beschrijft een snelle screening-proces voor de evaluatie van de bacteriën-specifieke optische beeldvorming agenten binnen ex vivo menselijke longweefsel door gebruik van FCFM voor de snelle identificatie van stoffen met mogelijke klinische nut voor het visualiseren van CLE bacteriën in de distale longkanker in situ.

Er is een dringende globale vereiste om rantsoen antimicrobiële voorschrijven in het tijdperk van stijgende antimicrobiële resistentie¹. Te dien einde getracht de ontwikkeling van diagnostische methoden welke handeling voor de identificatie van bacteriële infectie met hoge specificiteit, gevoeligheid, en in real time zijn in hoge mate². Huidige technieken ter bevestiging van een diagnose van longontsteking bij kritisch onwel patiënten, zoals die binnen de intensive care units (IC's), afhankelijk vaak van de interpretatie van de aspecifieke klinische en radiologische kenmerken naast bacteriecultuur technieken uit aanzuiging vloeistoffen/weefsels, die kan tot 3 dagen tot resultaten leidt. Bovendien bacteriecultuur aan de vloeistof die de distale Long ingeprent en opgehaald is gevoelig voor besmetting van meer proximale airways³ en vaak cultuur negatief is als gevolg van gelijktijdige antimicrobiële therapie of slechte bemonsteringstechnieken. Daarnaast zijn moleculaire technieken zoals polymerase-kettingreactie overdreven gevoelig wanneer gebruikt op aanzuiging vloeistoffen, riskeren overtreatment van patiënten. Een opkomende diagnostische aanpak is moleculaire optische beeldvorming, maken in situ moleculaire pathologie van weefsels een mogelijkheid; de ontwikkeling en validering van optische beeldvorming verbindingen is echter vereist. Toch directe visualisatie van bacteriën, via gevechts optische sondes is in potentie een zeer krachtige methode om de studie van de aanwezigheid en evolutie van longontsteking in de patiënt, en belangrijker, kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties in reactie op therapieën in real-time in situ.

CLE is een gevestigde investigative procedure in meerdere ziekten⁴, met inbegrip van binnen het gebied van gastro-enterologie⁵, oncologie^6,7, en voor de raadpleging van de luchtwegen en alveolaire zakjes^{8, 9}. het point-of-care structurele beeldvorming van zieke weefsel met behulp van een vezel imaging bundel, die op zijn beurt via het kanaal van de werken van een klinische endoscoop stelt en formulieren rechtstreeks contact met het oppervlak van het weefsel te worden beeld door confocale microscopie. Een beperking die blijft echter de noodzaak van generieke contrastmiddelen. Daarom kan het gebruik van ziekte specifieke sondes, zoals specifieke bacteriële agenten, enorm uitbreiden van het nut van deze modaliteit door direct visualiseren bacteriën op de site van vermoede infectie. Optische agenten bieden vele voordelen ten opzichte van andere technieken doordat real-time, hoge resolutie beeldvorming met diagnostische mogelijkheden. Bovendien is optische sondes bieden het vooruitzicht van multiplex voor de raadpleging van meerdere doelen, allemaal bereikt tegen een relatief lage prijs. Een aantal optische agenten zijn in ontwikkeling voor dergelijke doeleinden, maar geen nog met succes doorgevoerd binnen de kliniek¹⁰. Wij hebben een bibliotheek van klein molecuul chemische sondes gesynthetiseerd met specificiteit naar bacteriën en een snelle, effectieve pijpleiding voor evaluatie van de sonde functie voor het detecteren van bacteriële longontsteking in situ¹¹ontwikkeld.

Ter identificatie van geschikte sonde kandidaten, moest de volgende vereisten worden voldaan vóór de ondervraging van de sonde op ex vivo menselijke longweefsel door FCFM: i) waterige oplosbaarheid, ii) specificiteit en selectiviteit voor het labelen van snel klinisch relevante bacteriën, iii) een hoge signaal-ruisverhouding, en iv) weerstand tegen afbraak binnen de omgeving van Long. De laatste werd beoordeeld door bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF) van patiënten met acute respiratory distress syndrome (ARDS), die is een aandoening die wordt gekenmerkt door Proteolytische en inflammatoire omgevingen in de longen in de ICU. Bovendien moest de sondes hebben een geschikte fluorophore voor detectie door een klinisch goedgekeurde optische CLE beeldapparaat binnen alveolaire menselijke longweefsel.

De pijpleiding naar het ondervragen van elk van deze voorwaarden was als volgt (in elke fase, alleen de sondes die doorgegeven werden overgedragen naar de volgende): (1) een bibliotheek van sondes worden onderzocht werd gesynthetiseerd; (2) elke sonde is toegevoegd aan een panel van levende bacteriën voor confocale laser scanning microscopie (CLSM) om ervoor te zorgen dat bacteriële etikettering; (3) selectiviteit van bacteriële labeling over zoogdiercellen in co culturen met primaire menselijke neutrofielen werd opgericht door CLSM; (4) stabiliteit en succesvolle labeling van bacteriën in aanwezigheid van de patiënt ARDS BALF werd bepaald door CLSM en Matrix bijgestaan Laser desorptie/ionisatie-tijd van de Spectrometrie van de massa van de vlucht (MALDI-TOF); (5) de optimale concentratie van kandidaten werd bepaald door CLSM, selectiviteit zorgen voor bacteriën over zoogdiercellen werd gehandhaafd; (6) kandidaten waren beeld door FCFM in suspensie en op ex vivo menselijke alveolaire longweefsel om stabiliteit en dat de signal-to-noise volstond voor detectie. Stap 6 is beschreven in detail binnen dit protocol. Methodologie voor stappen 1-5 al eerder gemeld¹¹.

Protocol

Alle menselijke longweefsel na de geïnformeerde toestemming werd verkregen en de studie werd goedgekeurd door de regionale ethische commissie.

1. bereiding van biologische monsters

1. Voorbereiding van sondes
   1. Make-up van een stamoplossing van 1 mM van elke sonde (bijvoorbeeldcalceïne AM, UBI-3, UBI-10, etc.) in steriele dH₂O, met behulp van een subtiel evenwicht te wegen de gevriesdroogde probe samengestelde¹¹. Bereken het volume van de dH₂O toe te voegen op basis van de gewogen massa en moleculair gewicht van de sonde.
2. Voorbereiding van bacteriële culturen
   Opmerking: Voor deze methode, Staphylococcus aureus werd gebruikt als de exemplar stam. Een juiste bacteriële stam kan worden geselecteerd. Elke commerciële kleurstof die bacteriën met een passende excitatie en emissie spectra etiketten kan worden geselecteerd om positief label de bacteriën.
   1. Selecteer een één kolonie van gewenste bacteriële stam in een verse lysogenie Bouillon (LB) agarplaat met behulp van een steriele lus. Beënt de kolonie in 10 mL LB in een tube van 50 mL centrifuge door het einde van de lus dompelen in de cultuur-media. Incubeer bij 37 ° C, 250 rpm voor 16 h (of 's nachts).
   2. De OD-₅₉₅ van de overnachting cultuur bepalen door 100 µL van de overnachting cultuur aan 900 µL LB in een cuvet van 1 mL toe te voegen. Meten van de OD op 595 (met behulp van een cuvet met 1 mL LB als een leeg) nm in een spectrofotometer. Vermenigvuldig de verkregen OD met 10 tot het verkrijgen van de OD voor de overnachting cultuur.
   3. Subcultuur de overnachting cultuur. Dit doen door het aanpassen van de optische dichtheid bij 595 nm (OD₅₉₅) tot 0.1 in 10 mL vers pond berekenen van het vereiste volume van overnachting cultuur moet worden toegevoegd aan de 10 mL verse LB aan te passen van de OD₅₉₅ tot 0,1. Incubeer de cultuur bij 37 ° C, 250 rpm tot de cultuur bereikt halverwege log fase (OD₅₉₅ van 0,6 - 0,8), ongeveer 4 uur.
   4. Meet de extinctie van de cultuur (stap 1.2.2) en oogst 1 x 10⁸ kolonievormende eenheden (kve) (OD₅₉₅ ~ 1-1 x 10⁸ CFU/mL) van de bacteriecultuur in een 1,5 mL microtube (bijvoorbeeldals de bacteriecultuur OD_{595 is} 0.6, verzamelen 1.67 mL). Centrifugeer de cultuur bij 10.000 x g bij kamertemperatuur voor 1 min aan de pellet van de bacteriën. Wash de pellet tweemaal in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door het resuspending (pipetteren omhoog en omlaag zorgvuldig) de pellet in 1 mL PBS, centrifugeren zoals hierboven, teruggooi het supernatant en herhalen. Wees voorzichtig niet te verjagen van de bacteriële pellet bij het verwijderen van de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de laatste pellet in 1 mL PBS.
      Opmerking: Bereiden zoveel monsters zoals vereist voor elke labeling procedure. Het protocol kan hier worden onderbroken voor maximaal 1 uur, gevolgd door de stap, 1.2.5.1, 1.2.5.2 of 1.2.5.3.
   5. Bacteriële kleuring
      1. Om de bacteriën met calceïne AM van een label, voegt u de kleurstof toe aan een eindconcentratie van 1 µM in de gewassen bacteriecultuur. Incubeer de cultuur gedurende 30 minuten bij 37 ° C met schudden bij 300 omwentelingen per minuut. De counterstained bacteriële suspensie in PBS 3 keer wassen door centrifugeren zoals in stap 1.2.4 te verwijderen overtollige kleurstof. Resuspendeer in 1 mL PBS, 100 µL 1:1 in PBS te verkrijgen van 200 µL van OD₅₉₅ 0.5 calceïne ben gebeitst bacteriën verdund. Het protocol kan hier voor maximaal 1 uur worden onderbroken.
      2. Om een label Verdun de bacteriën met test sondes (bijvoorbeeldUBI-3 of UBI-10), 100 µL van de bacteriecultuur 1:1 in PBS te verkrijgen OD₅₉₅ 0,5 in 200 µL PBS. Voeg dat een van de sondes naar een eindconcentratie van 10 µM. omkeren de microtube meerdere malen om homogenisatie van het mengsel van de bacteriën en de sonde.
         Opmerking: Imaging moet worden uitgevoerd onmiddellijk na de toevoeging van de sonde na te bootsen de klinische scenario.
      3. Ter voorbereiding van het besturingselement OD onbevlekt bacteriële monsters, verdunde 100 µL van de cultuur 1:1 met PBS te verkrijgen van 200 µL van onbevlekt₅₉₅ 0,5 monster.
3. Voorbereiding van ex vivo menselijke longweefsel
   Opmerking: Menselijke longen weefselsteekproeven zijn verkregen van patiënten die een chirurgische resectie voor longcarcinoom. Alle weefsel gebruikt voor imaging is verkregen uit monsters van normaal longweefsel verwijderd van het kankergezwel. Monsters werden genomen vers van de operatiekamer en opgeslagen in slangen of centrifuge buizen bij-80 ° C tot gebruik.
   1. Onmiddellijk vóór imaging, de menselijke Long weefsel monster uit de vriezer op droog ijs te verwijderen. Bij kamertemperatuur, toestaan dat het weefsel te ontdooien iets; net genoeg om te worden gesneden met een scalpel in 1 x 4 mm² secties.
      Opmerking: Het niveau van het ontdooien is belangrijk; ook bevroren en het weefsel zal niet snijd zonder chippen af, ook ontdooid en het weefsel is te zacht slice.
   2. Plaats de gesneden menselijke longweefsel met pincet in wells van een 96-Wells duidelijk flat-onderkant weefselkweek plaat. Retourneren ongebruikte menselijke longweefsel onmiddellijk aan de opslagcontainer en plaats op droog ijs voor vervoer terug naar de vriezer-80 ° C
   3. Voeg 100 µL PBS aan elke Long weefsel monster met een pipet. Gebruik de pipet tip om al het weefsel is bedekt met de PBS (en niet vast aan de wanden van de put). Het weefsel zal zwellen lichtjes en kan drijven. Laat de PBS op het monster gedurende een paar minuten zodat elke bloed naar het uitspoelen van het weefsel naar de oplossing. Verwijder zo veel van de PBS mogelijk. Het weefsel kan blokkeren het einde van de pipet tip; proberen om de hoek van de plaatsing van de plaat/tip om dit te voorkomen.
   4. Pipetteer 100 µL van onbevlekt, calceïne ben label of testpunt label bacteriën aan elke goed met longweefsel. Ook instellen naar besturingselementen met longweefsel en 100 µL PBS. Deze controleputjes, kunnen sondes zonder bacteriën worden toegevoegd voor het meten van een eventuele verhoging in achtergrond fluorescentie en/of aspecifieke activatie van de sonde longweefsel alleen. Een goed met longweefsel en PBS moet ook worden opgenomen.

2. imaging met de CLE apparaat met FCFM

1. Het instellen van CLE apparaat
   Opmerking: Bereid de CLE systeem 20 min vóór kalibratie aan het toestaan van de laser om op te warmen.
   1. Druk op de aan/uit-schakelaar op de achterkant van de transformator van het systeem en de aangewezen computer aanzet. Druk op de aan/uit-knop op de voorkant van de laser scanning unit (LSU). Bevestig het uiterlijk van het groene licht, die aangeeft dat het apparaat is ingeschakeld.
   2. Dubbelklik op het pictogram van de software CLE. Voer de login-gegevens en wacht op de LSU initialiseren (10-30-s).
   3. Voor gebruik van nieuwe FCFM imaging vezels, is de installatie met de meegeleverde CD nodig. Plaats de installatie-CD in de computer CD-station en volg de instructies op het scherm.
   4. Reinig de FCFM imaging glasvezel connector unit met een schonere vezel. Wrijf de connector op de schoonmaak lint in een voorwaartse beweging om elke stof/vuil te verwijderen. Verwijder de gele beschermkapje aan de voorkant van de GVE.
   5. Bereid de LSU-hub door zachtjes de zilveren hub linksom draaien totdat het stopt. Steek de FCFM imaging glasvezel connector in de hub met de platte kant van de verbindingslijn die naar boven zijn gericht. De vezel op zijn plaats houden en de zilveren hub rechtsom draaien totdat het tweemaal klikken. De verbinding voltooien door het draaien van de zilveren hub met de klok mee door een verdere 45°.
      Opmerking: Als de vezel wordt niet herkend, Controleer dat de FCFM vezel imaging is geïnstalleerd en in de juiste richting aangesloten.
   6. Volg de instructies die zal pop-up voor het voltooien van de FCFM imaging vezel kalibratie. Er zijn 3 stappen: (1) FCFM imaging vezel test (stappen 2.1.7 - 2.1.8), (2) achtergrond acquisitie (stap 2.1.9), (3) vezel detectie (stap 2.1.10).
   7. Druk op de knop 'start laser' op het scherm. De laser zal centrum.
   8. Selecteer verse flesjes (gele: kalibreren; rood: schoon; blauw: spoelen) uit de kalibratie kit en volg de instructies op het scherm: het distale uiteinde van de FCFM imaging vezel in de gele flacon plaatsen en kijken voor de verhoging in de fluorescentie op de monitor, dan plaatst u de de tip van de vezel in de rode flacon (zonder roeren). Wacht totdat de fluorescentie (zoals weergegeven op het computerscherm) te verdwijnen. Ten slotte spoel de fiber-tip in de blauwe flesje.
      Opmerking: Als de fluorescentie niet verdwijnt, schoon van de vezel FCFM imaging met 8% H₂O₂ en lens reinigen van weefsels en opnieuw beginnen. Herhaal de procedure tot bevredigende resultaten worden verkregen (de beeldkwaliteit is duidelijk, en geen merken tegen vuil zijn schijnbare).
   9. Plaats de FCFM imaging vezel in de blauwe flacon. Druk op 'start laser' gevolgd door 'berekenen' zodra dit een optie.
   10. Plaats de FCFM imaging vezel in de gele flacon. Druk op 'start laser' gevolgd door 'berekenen' zodra dit een optie.
   11. Tijdens de automatische kalibratie, schoon het distale einde van de vezel door te plaatsen in de rode flesje voor imaging FCFM > 10 s, gevolgd door de blauwe flacon voor > 4 s, zoals aangegeven door de software.
2. Gegevensverzameling met CLE
   1. Na de installatie, een venster Opslaglocatie en bestand voorvoegsel selecteren wordt geopend. Selecteer de gewenste map voor de opslag van gegevens en het voorvoegsel van de naam dienovereenkomstig.
   2. Plaats de voetpedalen zodat ze gemakkelijk bereikbaar door de exploitant. Linker pedaal: laser in/uit; centrum pedaal: onderbreken; rechts pedaal: opnemen/stoppen.
      Opmerking: De besturingselementen van de laser kunnen ook worden betreden via de regelaars.
   3. Klik op 'start' op het scherm of druk op de linker voet / pedaal inschakelen van de laser. Dit start verwerving en beelden met behulp van 100% laser macht en een framesnelheid van 12 frames per seconde (standaardinstellingen) te verkrijgen.
      Opmerking: Voor andere toepassingen, deze instellingen kunnen worden gewijzigd op het scherm indien nodig, afhankelijk van het type van de steekproef.
   4. Het imago van elk van de monsters van de bacteriële suspensie.
      1. Steek de distale uiteinde van de FCFM imaging vezel en verplaatsen van de vezel langzaam door de schorsing te ondervragen van het monster.
      2. Record video's van iedere lengte (maximaal 10 min) door het indrukken van de rechter voetpedaal of de record regelaars, selectie van de vezel beweegt langzaam rond het monster.
      3. Reinig het distale einde van de vezel FCFM imaging met 8% H₂O₂ en lens reinigen van weefsels tussen de monsters.
         Opmerking: De typische video lengtes van 10-30-s zijn voldoende voor in vitro imaging.
   5. Het imago van elk van de Long weefselmonsters.
      1. Plaats de distale uiteinde van de FCFM imaging vezels in het monster, ervoor te zorgen dat rechtstreeks contact tussen het einde van de vezel en het weefsel wordt gemaakt. Voorzichtig verplaats ik de zinsnede van de beeldvorming vezel rond het monster te ondervragen.
         Opmerking: Opheffing van het einde van de vezel uit de buurt van het weefsel worden verwijderd het weefsel van het brandvlak; Nochtans, kan dit worden gebruikt om het imago van gelabelde bacteriën die het weefsel niet worden nageleefd.
      2. Record video's van iedere lengte (maximaal 10 min) door het indrukken van de rechter voetpedaal of de record regelaars, selectie van de vezel beweegt langzaam rond het monster.
         Opmerking: Doorgaans, video lengtes van 30 s volstaan voor ex vivo imaging op weefsel.
      3. Reinig het distale einde van de FCFM imaging vezel met lens reinigen van weefsels en 8% H₂O₂ tussen de monsters.
3. Het uitschakelen van het systeem
   1. De laser uit te schakelen door op de linker voetpedaal te drukken of door te klikken op de knop op het scherm.
   2. De FCFM imaging vezel verbreken door de CLE-apparaat door de zilveren LSU hub linksom draaien totdat het stopt. Verwijder de FCFM imaging vezel van de LSU-hub door zachtjes trekken de fiber-connector van de GVE.
   3. Reinig en Desinfecteer de vezel FCFM imaging met 8% H₂O₂ en lens reinigen van weefsels. De beschermende caps terugkomen op het proximale einde van de FCFM imaging vezel en de voorkant van de LSU-eenheid. Plaats de vezel zachtjes in de opbergdoos.
   4. Sluit de gegevens vastleggen software en alle opgeslagen bestanden kopiëren naar een externe USB-apparaat. De computer afsluiten en de LSU-apparaat uitschakelen door te drukken op het voorpaneel I/O voor 3 s totdat het groene licht verdwijnt.
   5. Beschikken over menselijke longweefsel en bacteriën volgens plaatselijke voorschriften.

3. de gegevensanalyse

1. Open de software en de bestanden voor analyse door het selecteren van de juiste directory op de computer via het pictogram 'Ga naar' op het dashboard software importeren. U kunt ook kunnen bestanden slepen en neerzetten in het dashboard van de software.
2. Dubbelklik op elk videobestand om ze te openen. De video zal automatisch afspelen met geoptimaliseerde kleur opzoektabel (LUT) en kleurentabel aanpassen. Het uitschakelen van de automatische intensiteit schalen, door te klikken op de Toverstafknop boven de bar van de schaal van de intensiteit. De functie is uitgeschakeld als er geen zwarte schaduw rond de knop.
   Opmerking: Automatische intensiteit schaal moet worden uitgeschakeld om te voorkomen dat continu contrastverbetering gedurende elke video, waardoor het onmogelijk om te vergelijken en analyseren van video's van de dezelfde gegevensset.
3. Selecteer de gewenste intensiteit schalen door het bewegen van de minimale en maximale balken geven de beste contrast. Het hulpprogramma histogram gebruikt wanneer de intensiteit schalen om ervoor te zorgen het breedste dynamisch bereik selecteren is gevangen.
   Opmerking: Zorg ervoor dat het dynamisch bereik is zodanig dat de beelden zijn niet verzadigd (d.w.z. beperken de witte gebieden van de afbeelding, die duiden op een verzadiging), zodat de lage intensiteit functies zijn niet gemist.
4. Zodra de gewenste schaal is bereikt, klik met de rechtermuisknop op de dropdown menuknop vermeld als 'Default (groen)'. Selecteer de optie om op te slaan de LUT. De LUT op een gewenste locatie opslaan.
5. Voor elkaar video binnen de gegevensset toepassen van de dezelfde LUT door rechts te klikken op de 'Default (groen)' drop-down menu en selecteer 'Load LUT'. Selecteer het juiste bestand toe te passen consistent intensiteit schalen naar alle video's binnen een dataset.
6. Verwerkte video's exporteren door te klikken op de knop 'film reel'. Selecteer de gewenste videoformaat, b.v. 'voor presentatiedoeleinden', die een .mpg bestand zal opleveren. Druk op 'Exporteer' en koos voor de locatie van het bestand waarop het videobestand wilt opslaan. Momentopnamen van enkele frames kunnen worden geëxporteerd door te klikken op de cameraknop ''. Het is mogelijk een .png, .bmp of .jpg bestand op te slaan. Kies de bestemming van het bestand en druk op opslaan.
   Opmerking: Video's kunnen vervolgens worden geïmporteerd in ieder software voor bereiding van presentaties of verdere kwantificering. Gelabelde bacteriën worden gevisualiseerd als groene 'knippert' stippen in de video. Het Long weefsel structuur zal blijken als geordende fluorescerende strengen, met alveolaire ruimte wordt zwart weergegeven.

Resultaten

In deze studie hebben we een methode voor de snelle-screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes in een ex vivo menselijke alveolaire Long weefsel model van infectie met behulp van een klinisch goedgekeurde CLE stuurprogramma aangetoond.

CLE door FCFM is zeer geschikt voor het verkrijgen van structurele informatie binnen de distale Long, aangezien deze regio (als gevolg van een hoge overvloed van elastine en collageen) natuurlijk zeer fluorescerende is wanneer opgewekt met een 488 nm laser⁸. Omgekeerd, de alveolaire ruimte niet fluoresceren, en als zodanig kunt hoog contrast tussen weefsel structuur en het luchtruim worden gevisualiseerd (Figuur 1).

De toevoeging van ziekte gerelateerde sondes of contrastmiddelen, zoals bacteriën-specifieke sondes moeten inschakelen functionele informatie over ziekteprocessen in real time worden verkregen. Wij hebben eerder beschreven de synthese en eerste in vitro screening van een bibliotheek met bacteriën-specifieke sondes¹¹; Waar bacterial-specificiteit, werd Proteolytische stabiliteit en het vasthouden van binnen het bacteriële membraan na verloop van tijd vastgesteld. Een veelbelovende bacteriën-specifieke sonde (UBI-10) werd geïdentificeerd binnen de studie, en ook dat bleek slechte retentie in de bacteriële cel membraan (UBI-3). Deze werden vergeleken met een controle van commerciële counterstaining (calceïne AM) die is gebruikt voor het label van S. aureus.

Onbevlekt, waren calceïne AM, UBI-3 en UBI-10 S. aureus met het label beeld in suspensie door FCFM met 100% 488 nm laser macht en een framesnelheid van 12 frames per seconde (Figuur 2). Waar labelloze bacteriën in PBS waren beeld, was geen fluorescent signaal aantoonbaar. Dit is in tegenstelling tot wanneer gelabelde bacteriën werden beeld. Waar bacteriële suspensies met UBI-3 of UBI-10 waren beeld door FCFM, was het duidelijk dat de fluorescentie van de algemene achtergrond van de oplossing werd verheven in vergelijking met PBS alleen besturingselementen, dit is omdat NBD (de sonde fluorophore) het uitstoten van een kleine hoeveelheid fluorescentie signaal in waterige oplossing, echter, bright dots punctate genoemd zijn duidelijk zichtbaar in de oplossing, zonder de noodzaak voor een wassen stap. Dit is te wijten aan een toename van de fluorescentie signaal in een polaire omgeving door de NDB uitgestoten d.w.z., het bacteriële membraan. Calceïne AM is niet een gevechts sonde, dus een wassen stap na de bacteriële kleuring hoefde te verwijderen van de hoge, fluorescerende achtergrond van niet-afhankelijke sonde in de oplossing. UBI-3 als UBI-10 werden gelabelde bacteriën, bacteriën aangeduid met calceïne AM ontdekt in oplossing door FCFM als heldere groene punctate stippen. Zoals de gegevens worden verzameld in video-formaat, lijken deze puntjes 'twinkle' als zij zich tussen de kernen en opgeven van focus, een karakteristiek kenmerk van imaging gelabelde bacteriën door deze methode verplaatsen.

De gelabelde bacteriën werden later toegevoegd aan kleine segmenten van ex vivo menselijke longweefsel en beeld weer door FCFM (Figuur 3). Waar alleen PBS of labelloze S. aureus is toegevoegd aan het longweefsel, is alleen de Long weefsel autofluorescent structuur aangetroffen (gezien als helder groene soorten collageen en elastine en donkere gebieden van de alveolaire ruimte). Geen punctate punten waren voor deze controlevoorwaarden ontdekt. Op dezelfde manier, alleen Long weefsel structuur (en geen punctate punten) werd gevisualiseerd voor de Long weefsel conditie met S. aureus plus UBI-3; die aangeeft dat deze sonde werd niet behouden blijft stabiel binnen de bacteriële cel membraan dat wil zeggen, het was weggespoeld en/of wordt gedegradeerd in aanwezigheid van inheemse Proteolytische enzymen in het longweefsel (zoals eerder bewezen¹¹).

Bright dots punctate genoemd waren echter zichtbaar in zowel de calceïne AM positieve controlemonster S. aureus met het label, en met de meest veelbelovende bacteriën-specifieke sonde (UBI-10), S. aureus monster. De 'fonkelende' puntjes werden weergegeven ondanks de sterke weefsel autofluorescence (Figuur 3). Dus de resultaten verkregen door FCFM werden in overeenstemming met de in vitro pre-screening van het panel van bacteriën-specifieke sondes door CLSM, en aangetoond van een klinisch relevante detectiemethode voor imaging-infecties in real-time.

De hier gepresenteerde resultaten aantonen dat de Long een passende orgel systeem voor beeldvorming door FCFM als gevolg van haar kenmerkende autofluorescence is. De heldere kenmerkende structuren toestaan de CLE operator om te bepalen dat zij zich in de alveolaire ruimte. Deze regio's, in combinatie met de donkere alveolaire lucht zakjes vormen de perfecte achtergrond voor imaging fluorescently geëtiketteerde bacteriën met een hoog contrast.

Hoewel de opsporing van bacteriën binnen deze studie gepresenteerd wordt kwalitatief bepaald door het visualiseren van bright dots punctate genoemd, het mogelijk is te kwantificeren van het aantal punctate dots frame voor frame met behulp van een secundaire software om karakteriseren sonde bibliotheken.

Figuur 1: Statisch beeld van menselijke Long weefsel autofluorescence. Confocale laser endomicroscopy (CLE) afbeelding van ex vivo menselijke longweefsel met behulp van fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM), op 488 nm excitatie, 100% laser kracht en 12 frames/s. elastine en collageen zijn zeer TL (onwaar gekleurd groen), Overwegende dat de alveolaire ruimte is niet, en als zwarte gebieden weergegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Akram et al. ¹¹ Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Confocale laser endomicroscopy (CLE) beeld van gelabelde S. aureus in suspensie. Fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM) werd gebruikt om het imago van vooraf gelabelde bacteriën, op 488 nm excitatie, 100% laser kracht en 12 frames/s. Labeled bacteriën Toon als zeer fluorescerende punctate stippen (valse gekleurde groen). Dit cijfer is gewijzigd van Akram et al. ¹¹ Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figuur 3: Confocale laser endomicroscopy (CLE) afbeelding van ex vivo menselijke longweefsel met gelabelde S. aureus. Fibered confocal fluorescentie microscopie (FCFM) afbeelding ex vivo menselijke longweefsel gewend was en het label S. aureus, bij 488 nm excitatie, 100% laser kracht en 12 frames/s. Labeled bacteriën Toon als zeer fluorescerende punctate stippen (valse gekleurde groen) binnen het Long weefsel monster waarbij label met calceïne AM of UBI-10. De hoogste contrast wordt waargenomen waar bacteriën zijn beeld binnen de alveolaire ruimte. Dit cijfer is gewijzigd van Akram et al. ¹¹ Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.  

Discussie

Infecties van de lagere luchtwegen rekening voor de tweede hoogste ziektelast wereldwijd^12,13, en een aanzienlijke stijging van het aantal van infecties toegeschreven aan antimicrobiële resistente bacteriën geweest gerapporteerde¹⁴. Longontsteking blijft een veel voorkomende oorzaak voor hospitalisatie. In de ICU, de ontwikkeling van een longontsteking wordt verergerd door diagnostische onzekerheid en wordt geassocieerd met een zeer hoge sterfte tarief¹⁵. Tijdens het begin van longontsteking vermenigvuldigen de bacteriën binnen de alveolaire ruimte van de distale Long, een gebied dat is relatief steriel, met minimale microbiota in gezondheid.

Deze methode beschrijft relatief late stadium ex vivo validatie van bacteriën-specifieke optische beeldvorming sondes¹¹, maar het ontwerp, de synthese en evaluatie van de sonde voorafgaand aan het begin van deze stap van de validatie is absoluut noodzakelijk, als eerder is laten zien¹¹ .

CLE is een opkomende klinische techniek voor het ondervragen van ziekte verklaart in situ in real-time. Het biedt vele voordelen ten opzichte van traditionele technieken voor het onderzoeken van verdachte pulmonaire pathologie, die een biopsie en de collectie van de lavage vloeistof kan veroorzaken. Biopsieën zijn invasief en morbiditeit en mortaliteit bij geventileerde patiënten kunnen veroorzaken, en verzamelde lavage vloeistof is vaak besmet met bacteriën uit de bovenste luchtwegen. Het gebruik van CLE in de opsporing van longontsteking is echter enigszins beperkt door de slechte beschikbaarheid van compatibele imaging sondes die functionele informatie van ziekte, ondanks veel gezamenlijke inspanningen¹⁰kan bieden. CLE combineren met optische agenten biedt het vooruitzicht van de diagnose longontsteking sneller en minder gebeurt vergeleken met de huidige standaard praktijk.

De kritische stappen bij dit protocol zijn in de bereiding van de monsters en de installatie van de CLE-platform. Verkrijgen van menselijke weefsels die relevant zijn voor het uiteindelijke klinische toepassing is ook belangrijk, zoals menselijke longweefsel zoals aangetoond in deze studie. Het is noodzakelijk om het gebruik van menselijk weefsel, omdat de omvang van weefsel autofluorescence grote variatie tussen soorten toont, en kan daarom het misleiden van de gevoeligheid van de bacteriën-sonde image wordt gemaakt. Bovendien, het verkrijgen van ethiek voor ophalen en het gebruik van menselijke longweefsel is essentieel. Bij een technische niveau, juiste reiniging is bevestiging van de beeldvorming vezel aan de beeldvorming LSU platform, en de kalibratie essentieel voor goede resolutie en consequente beeldvorming, zoals is het waarborgen van gelijke aantallen bacteriën worden toegevoegd aan elk monster Long weefsel. Om verdere uitbreiding van het nut van deze methode voor het screenen van de panelen van sondes, is het noodzakelijk het procédé met allerlei ziekteverwekkers, zoals die kunnen worden van de causatieve agenten van longontsteking.

De grootste beperking van deze techniek is dat het klinisch goedgekeurde CLE apparaat slechts één laser heeft (488 nm). Dus, de selectie van fluorophore voor sonde ontwerp is momenteel beperkt voor gebruik met dit systeem, hoewel klinisch goedgekeurd één kleur apparaten bestaan met excitatie golflengten van 660 nm en nabij-infrarood. Het is zeer wenselijk dat een tweede laser regel uitgevoerd binnen hetzelfde apparaat om een sonde met een spectraal verschillende fluorophore om de gevoeligheid van bacteriën-sonde over het niveau van weefsel autofluorescence worden ontwikkeld. Terwijl dual-kleur CLE apparaten onder ontwikkeling zijn, ze zijn ofwel niet klinisch goedgekeurd en/of hun kosten is aanzienlijke¹⁶.

Overbrugt de kloof tussen conventionele in vitro technieken zoals stroom cytometry en CLSM, en klinische nut CLE in vitro met behulp van pathogene bacteriën en ex vivo menselijke longweefsel te scherm potentiële sondes. Deze stap biedt vertrouwen bij het selecteren van veelbelovende verbindingen voort te zetten om te worden gecombineerd met klinisch CLE imaging; en geeft een indicatie of de geteste sonde onderhoudt doel specificiteit, toont af-target labelen, zoals binding rechtstreeks aan weefsel, of toont instabiliteit met host Proteolytische enzymen. Het zou ook relevant zijn voor elk van de gevechts sondes rechtstreeks toevoegen aan monsters van menselijke longweefsel plus bacteriën, de snelheid van de sonde bindende en activering in real-time volledig te karakteriseren.

Wij zijn van mening dat onze pijpleiding voor het snel screenen nieuwe bacteriën-specifieke sondes voor de beoordeling van hun potentieel voor imaging binnen de distale Long van patiënten in veel sneller vertaling naar de kliniek resulteren zal. Dit is grotendeels omdat de bacteriën-specifieke sonde kan lokaal worden afgeleverd binnen de longen via een katheter ingevoegd neer het kanaal van de werken van een bronchoscope, wat betekent dat microdose (< 100 µg) bedragen kunnen worden geleverd. Daarom, systemische leverings- en ook van de stof is niet een punt van zorg, zoals het geval is voor vele andere infectie doelen binnen het lichaam, of met nucleaire beeldvorming. Bovendien leveren de imaging sonde in zo'n een kleine dosis vermindert het risico van toxiciteit gerelateerde complicaties (hoewel toxiciteit screening voor vertaling nodig zijn zou). Na toediening van de sonde, de katheter kan vervolgens worden vervangen door de FCFM vezel en dezelfde regio van de Long ondervraagd door CLE, veel de zelfde manier wij hebben uitgevoerd binnen deze methode. Imaging moet snel na de installatie van de sonde voordat de sonde undetectable concentraties wegspoelt worden uitgevoerd.

Het is ook belangrijk op te merken dat screening van ziekte-identificerende sondes door deze techniek moet niet beperkt blijven tot bacteriële-imaging agenten, maar kan zich ook uitstrekken tot de validatie van sondes met alternatieve doelen, zoals ontsteking. Deze aanpak moet ook worden aangepast naar andere locaties van de ziekte in het lichaam waar imaging via FCFM toegestaan is.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-14 Microfuge	SciQuip	90616	Kleine tafelmicrocentrifuge
96-well plate	Corning	3370	Testplaat
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Commerciële fluorescerende kleurstof
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Confocale laserendomicroscopie apparaat
Cletop-S	Cletop	14110601	Vezelreiniger
Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	1,5 mL microfugebuis
Eppendorf Research Plus Pipettes	Fisher Scientific	11568663	Micropipetten
Falcon tube (50 mL)	Scientific Lab Supplies	352070	50 ml centrifugebuis
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - wasmedium
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Software voor gegevensverzameling en -verwerking voor het CellVizio 488 nm onderzoekssysteem
Incu-Shake midi	Sciquip	SQ-4020	Op de grond staande schuddende incubator
Lysogeny Broth	Sigma Aldrich (Miller)	L3522	LB Groeimedia voor S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Fibred confocale fluorescentiemicroscopie vezel
Quanti Kit 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Calibratieset voor het CellVizio 488 systeem
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Bacteriestammen gebruikt in dit onderzoek
Semi-micro spectrophotometry cuvette	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Voor spectrophotometrie
Thermomixer comfort	Eppendorf	41102422	Tabeltop verwarmer met schudden
UV 1101 Biotech photometer	Biochrom WPA		Spectrofotometer