Kwantificering van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van personen met chronische inflammatoire aandoeningen

Summary

Beschrijven we een protocol voor het meten van transmigratie door monocyten over menselijke endothelial monolayers en hun daaropvolgende rijping in schuim cellen. Dit biedt een veelzijdige methode te beoordelen van de atherogene eigenschappen van monocyten geïsoleerd uit mensen met verschillende ziekten en te evalueren van factoren in het bloed die deze neiging kunnen versterken.

Abstract

Coronaire hartziekten (CAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Atherosclerose, een toonaangevende veroorzaken van CAD-, wordt geïnitieerd door de transmigratie van aangeboren immuun monocyten naar inflammatoire sites van gedeponeerde lipide vettige strepen, die aanwezig in arteriële muren van medium tot grote arteriën zijn genoemd. De pathogene spil van laesies in dit vroege stadium van atherosclerose is de rijping van monocyten die naar slagaders migreren om schuim cellen of lipide-beladen macrofagen. Aanzienlijke bewijs ondersteunt de hypothese dat risico van atherosclerose wordt verhoogd met chronische inflammatoire aandoeningen begeleidende ziekten zoals reumatoïde artritis en HIV, evenals algemene vergrijzing, en dat dit risico wordt voorspeld door monocyt activering. Hoewel Muismodellen een goed platform bieden voor het onderzoek naar de rol van monocyten in atherogenese in vivo, ze genetische wijziging van natuurlijke cholesterol metabolisme en drastische wijziging van normale muis diëten vereisen, en hebben beperkte geschiktheid voor de studie van atherogene invloeden van menselijke comorbide aandoeningen. Dit motiveerde ons om een menselijke in vitro model voor het meten van het atherogene potentieel van monocyten geïsoleerd uit personen met een bepaalde ziekte staten te ontwikkelen. Op dit moment beperken menselijke in vitro modellen in die zin dat zij monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming in isolatie evalueren. Hier beschrijven we een protocol waarin monocyten geïsoleerd uit patiënt bloed transmigrate over menselijke endotheliale cellen in een matrix van de collageen type 1 en hun neiging om te rijpen in schuim cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van exogene lipide wordt gemeten. Het protocol is gevalideerd voor het gebruik van menselijke monocyten gezuiverd van personen met HIV-infectie en ouderen HIV niet geïnfecteerde individuen. Dit model is veelzijdig en kunt monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming te worden geëvalueerd met behulp van beide microscopie of stroom cytometry evenals waardoor de beoordelingvan atherogene factoren in serum of plasma.

Introduction

Monocyt transmigratie is een cruciale stap in de ontwikkeling van atherosclerotische plaque die tot trombose, beroerte en een hartinfarct leiden kan. Atherosclerotische plaques ontwikkelen van vettige strepen, over het algemeen aanwezig op sites van lage oscillerende bloedstroom in middelgrote tot grote arteriën, waar gedeponeerde lipide bijdraagt tot activering van het endotheel en een gelokaliseerde ontsteking¹. Monocyten worden gerekruteerd voor endotheliale cellen in vettige strepen via monocyt Chemotactische eiwitten (zoals CCL2) en transmigrate in de intima-². Naar aanleiding van zielsverhuizing, kunnen monocyten uitmaken atherogene, lipide-beladen macrofagen oftewel schuim cellen ten gevolge van lipide opname, lipide synthese, down-regulatie van cholesterol efflux of een combinatie van bovengenoemde factoren. Monocyten kunnen ook accumuleren lipiden in het verkeer en hebben een 'schuimend' fenotype, eventueel predisponerende cellen voor schuim-cel formatie^3,4. Schuim cellen zijn de definiërende eigenschap van vettige strepen en beginnende atherosclerotische plaques en hun vorming wordt beïnvloed door zowel lipide en inflammatoire mediatoren⁵. Als alternatief, monocyten hebben de mogelijkheid om reverse transmigrate van de slagader in de bloedbaan⁶, daardoor verwijderend lipide van de intima en handelen om de gezondheid van de slagader.

Bepaling van de neiging van monocyten naar transmigrate over arteriële endotheel en formulier schuim cellen in de intima, of om te keren transmigrate en voeren lipide uit de plaque, is een basisvereiste voor het begrijpen van de rol van monocyt activering in toenemende atherosclerotische risico. Muismodellen voor CADs zoals atherosclerose zijn belangrijk in het ophelderen van real-time in vivo informatie over vette streep/atherosclerotische plaque ontwikkeling. Echter, deze modellen vereisen een genetische verandering van de natuurlijke cholesterol verwerking capaciteiten van deze dieren meestal in combinatie met drastische veranderingen in het dieet (zoals het ApoE-/-Western-type dieet model)^7,8, daardoor, inducerende niet-fysiologische accumulatie van circulerende lipide niveaus welke schijf plaque ontwikkeling. Deze modellen bieden slechts beperkte relevantie voor chronische inflammatoire menselijke aandoeningen zoals HIV-infectie die niet geassocieerd met verhoogd circuleert cholesterol of low-density lipoprotein (LDL) niveaus. Bovendien verschillen in monocyt biologie tussen mensen en muizen maken het testen van immunologische vragen met betrekking tot de relevantie van de subpopulaties van monocyten (zoals tussenliggende monocyten (CD14⁺⁺CD16⁺))⁹ moeilijk. Dit is belangrijk bij de studie van de mechanismen die rijden van hart-en vaatziekten, zoals de graven van de tussenliggende monocyt onafhankelijk cardiovasculaire gebeurtenissen^{10,11 voorspellen}. Hoewel testen bestaan voor het sequentieel meten van beide monocyt transmigratie of schuim celvorming in isolatie, is geen in vitro -assay gevalideerd voor het kwantificeren van beide aspecten van vroege atherogenese met behulp van dezelfde cellen van klinische cohorten. Transwell modellen gebruiken een gemodificeerde Boyden twee-kamer systeem waarbij cellen worden geladen in de bovenste kamer en transmigrate over een cel enkelgelaagde of poreuze plastic barrière in een tweede kamer die meestal media met chemoattractant^{12 bevat , 13}. terwijl op grote schaal gebruikt voor het analyseren van leukocyten zielsverhuizing, deze modellen een laag vertegenwoordigen de intima, resulterend in transmigrated cellen migreren naar oplossing, in het algemeen niet te nemen en niet toegestaan voor de meting van schuim cel vorming of omgekeerde transmigratie van dezelfde cellen. Daarentegen modellen van de celvorming schuim geen rekening met eventuele transmigratory-geïnduceerde veranderingen monocyten of effecten van endothelial activering waarvan bekend is dat de bijdragen aan het schuim cel formatie¹⁴. Bovendien, deze systemen veroorzaken schuim celvorming van macrofagen aangehangen door de toevoeging van het verzadigen van de concentraties van exogene geoxideerde low-density lipoprotein (oxLDL)^15,16, een belangrijke inductor cel cultuur platen van schuim celvorming. LDL gebruikt in deze modellen is vaak geoxideerd door niet-fysiologisch-relevante processen zoals CuSO₄ behandeling¹⁷, daarom vraagtekens bij het fysiologisch belang van studies met behulp van deze modellen.

Hier beschrijven we een bepaling die kwantificeert monocyt zielsverhuizing en celvorming schuim van dezelfde cellen die vereist niet de toevoeging van exogene oxLDL, dus beter de modellering van de rol van monocyten in schuim celvorming. Dit model werd oorspronkelijk ontwikkeld door Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)¹⁸, en heeft zijn verder verfijnd in ons laboratorium te beoordelen ex vivo de atherogenicity van monocyten geïsoleerd onder niet-activeren voorwaarden van individuen met onderliggende inflammatoire voorwaarden begeleidende ziekten zoals HIV infectie¹⁹ evenals vergrijzing²⁰, die zijn geassocieerd met een verhoogd risico van atherosclerose. Dit model biedt ook een platform voor het beantwoorden van elementaire biologische vragen over de neiging van verschillende monocyt deelverzamelingen formulier schuim cellen²⁰, de invloed van endothelial activering door cytokines zoals TNF op schuim celvorming¹⁴ , de trekkende eigenschappen van monocyten zoals de diepte en snelheid van de zielsverhuizing in gels¹⁹. Bovendien, monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming kan worden gekwantificeerd aan de hand van standaard microscopie, live cel imaging, stroom cytometry en imaging stroom cytometry, daarom bieden een veelzijdige methode om te evalueren van de rol van monocyten in atherogenese.

Protocol

Opmerking: alle experimenten met behulp van de menselijke biologische monsters werden uitgevoerd met goedkeuring van de ethiek van de Alfred ziekenhuis menselijke ethische Commissie, Melbourne. Alle experimenten werden uitgevoerd in klasse II bioveiligheid kasten, tenzij aangegeven. " Prewarmed " verwijst naar reagentia opgewarmd tot 37 ° C in waterbaden.

1. voorbereiding van Type I vezelig collageen Gels: dag 1

1. voorbereiden polymeervorm collageen gels door sequentieel toevoegen en mengen van 35.7 mM NaOH, 0.71 x M199, 4.58 mM azijnzuur en 1,71 mg/mL typ ik vezelig collageen in een polystyreen 5 mL buis volgens tabel 1.
   Opmerking: Zorg ervoor dat het collageen goed gemengd is door pipetteren zachtjes op en neer 5 keer om te stoppen met de vorming van collageen ' zakken ' in het mengsel van de gel. Bereiden van 4-6 gels per testvoorwaarde voor microscopie of 15 gels per testvoorwaarde voor stroom cytometry.
2. Nou eenmaal gemengd, aliquoot 50 µL van collageen gel mengsel in ieder putje van een steriele platbodem weefselkweek van de 96-wells-plaat. Gebruik niet de buiten rijen en kolommen, maar vul deze met 200 µL van 1 x Dubecco ' s fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) de gels beschermen tegen uitdroging. Incubeer de platen bij 37 °C/5% CO ₂ gedurende 2 uur om het collageen te polymeriseren.
   Opmerking: Plaats de platen direct op schone metalen rekken in de incubator om gelijkmatige warmteverdeling.
3. Na incubatie, bedekken de gels met 150 µL 1 x aangevuld M199 (Zie Tabel van materialen) en incubeer gedurende 5 dagen tot gebruik.

2. Uitbreiding van de opgeslagen HUVEC: dag 1

1. Label en vacht een 10 cm diameter petrischaal met 50 µg Mo/mL fibronectine 1 mL verdund in 1 x PBS en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten
2. Dooi aliquots van cryopreserved primaire menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC, 1.0 x 10 ⁶ cellen) 10 ml M20.
   Opmerking: HUVEC moet worden voorbereid als eerder ^{21 beschreven} en op een lage passage-nummer gebruikt (< passage 4). HUVEC vervangen kan worden door menselijke coronaire endotheliale cellen hier.
3. HUVEC 10 ml M20 resuspendeer en voeg toe aan fibronectine gecoate schotel, zuigen overtollige fibronectine vóór toevoeging van cellen, en cultuur tot samenkomst (ongeveer 5 dagen), ter vervanging van de media op dag 3.

3. Kweken van HUVEC enkelgelaagde op collageen Gels: dag 5

1. op dag 5, loskoppelen HUVEC door zuigen cultuur supernatant van de petrischaal en wegwassen van serum-bevattende media met 10 mL serumvrij M199.
2. Voeg toe 5 mL 0,05% trypsine/0,53 EDTA in M199 aan HUVEC en incubeer gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur, zachtjes schudden tot de cellen loskoppelen.
3. Zodra vrijstaand, snel afspoelen petrischaal met 5 mL M20 en overdracht van de media met cellen die een tube 10 mL.
4. Centrifuge monsters bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gecombineerd supernatant resuspendeer de cellen in 200 µL van de M20 en tellen van cellen met behulp van een hemocytometer.
5. Resuspendeer de cellen aan 2.0 x 10 ⁵ cellen/mL in M20, gecombineerd de M199 op de gels van de 96-wells-plaat (stap 1.3) en voeg 100 µL van de geresuspendeerde HUVEC (2.0 x 10 ⁴ cellen) aan elke collageen gel bereid boven (stap 1.2). Cultuur platen voor een verdere 3 dagen bij 37 °C/5% CO ₂.
   Opmerking: De integriteit van de HUVEC enkelgelaagde misschien na 3 dagen door zilvernitraat kleuring van ²² of immunohistochemistry voor strakke junction eiwitten ²³ in dit stadium worden bevestigd. Extra gels moeten worden voorbereid voor dit doel.

4. Activering van HUVEC enkelgelaagde en isolatie/activering van monocyten voor transmigratie: dag 8

1. op dag 8, elke HUVEC enkelgelaagde voordat het prestatiemeteritembestand van monocyten activeren door het aspirating van de M20 media bedekken de gels en het toevoegen van de 100 µL van 10 ng/mL menselijke TNFα in M20 per gel. Incubeer bij 37 °C/5% CO ₂ voor 4 h.
   Opmerking: Niet-geactiveerde HUVEC voorwaarden kunnen ook worden opgenomen als vereist als besturingselementen.
2. Tijdens de 4 h HUVEC activeringsstap, isoleren monocyten van PBMCs met behulp van magnetische bead technieken negatief selecteren voor cellen volgens de fabrikant ' s instructies. Een minimum van 6,5 x 10 ⁶ PBMCs tijdens deze stap moet worden gebruikt om op betrouwbare wijze herstellen 3.0 x 10 ⁵ monocyten vereist voor één voorwaarde, als monocyten doorgaans goed voor ongeveer 10-15% van PBMCs.
   Opmerking: Om te evalueren van het effect van monocyt activering vóór monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming, monocyten kunnen geactiveerd worden in dit stadium. Monocyten kunnen worden geïsoleerd uit ontdooide PBMCs indien nodig (dwz, opgeslagen patiënt monsters). Monocyt deelverzamelingen geïsoleerd door FACS sorteren kunnen worden voorbereid voor toevoeging aan gels (Figuur 1).

5. Transmigratie van primaire menselijke monocyten: dag 8

1. te meten van monocyt zielsverhuizing, verwijder TNFα-bevattende media en wassen gels tweemaal met 100 µL M199 door toe te voegen en te verwijderen van de media. Na wassen, toevoegen 2.0 x 10 ⁵ vers geïsoleerd of ontdooid en gewassen cryopreserved PBMCs of 5.0 x 10 ⁴ vers geïsoleerd monocyten of gezuiverd monocyt deelverzamelingen te HUVEC monolayers in 100 µL M20. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO ₂ om de voorwaartse transmigratie van monocyten in de gel. Het is het beste om 6 putten voor elke experimentele conditie onderzocht.
   Opmerking: Om te evalueren van het effect van autologe serum op zielsverhuizing en schuim celvorming, Incubeer de cellen met M20 met de gewenste concentratie van warmte-geïnactiveerd donor serum en vergelijk met voorwaarden met een besturingselement gepoolde menselijk serum. Leukocyten dan monocyten kunnen worden toegevoegd in dit stadium. Als het onderzoeken van het effect van specifieke lipiden/lipide soorten (bijvoorbeeld HDL, oxHDL), alle volgende stappen uitvoeren met serumvrij medium met 20-50 µg Mo/mL lipiden.
2. Na 1 h van de voorwaartse zielsverhuizing, verzamelen de cellen niet-transmigrated door het wassen gels tweemaal met 100 µL voorverwarmde 1 mM EGTA in 1 x PBS, en eenmaal met 100 µL M199 (hetzelfde Centrifugeer voorwaarden), bundeling van het supernatant van elk putje van de zelfde experimentele conditie (meestal 6 wells) in een 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs. Centrifugeer de cellen niet-transmigrated bij 4 ° C, 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer in 30 µL 1 x PBS.
3. Cellen verzameld in de bovendrijvende vloeistof om te bepalen van het aantal voorwaartse transmigrated cellen tellen.
4. Het percentage voorwaartse transmigrated cellen wordt als volgt bepaald:
   
5. dekking van de gewassen gels met transmigrated cellen met 100 µL M20 en incubeer gedurende een verdere 48 h.
6. Na 48 h, verzamelen het supernatant en wassen niet-transmigrated cellen tweemaal met 100 µL voorverwarmde 1 mM EGTA/PBS, verzamelen en bundelen het supernatant van elke voorwaarde zoals in stap 5.2.
   Opmerking: Het fenotype van omgekeerde transmigrated cellen kan worden getest op deze cellen fdrijfscombinati standaard stroom cytometry kleuring protocollen.
7. Centrifugeren cellen bij 4 ° C, 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer de cellen in 30 µL 1 x PBS. Cellen tellen en bepalen de levensvatbaarheid via trypan blauw kleuring.
8. Bepalen het percentage van de omgekeerde transmigrated cellen met behulp van de volgende vergelijking:
   
   Opmerking: Accounting voor het totaal aantal voorwaartse transmigrated cellen een meer nauwkeurige indicatie van de omgekeerde zielsverhuizing geeft aangezien er onwaarschijnlijk voorwaartse transmigratie zal worden 100%.
9. Voor analyse door microscopie, bevestigen de gels door 100 µL 2% formaldehyde (eindconcentratie) toe te voegen aan elk putje, dekken de platen in aluminium folie en bewaren bij 4 ° C tot analyse. Voor stroom cytometry, niet positiebepaling naar de cellen in dit stadium. De protocollen hieronder microscopie (punt 6) of stroom cytometry (sectie 7) analyse zien.
   Let op: Formaldehyde is giftig en corrosief; gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Zorg moet worden genomen bij het toevoegen van formaldehyde, echter deze stap hoeft niet te worden uitgevoerd in een zuurkast te wijten aan de lage concentratie gebruikt.

6. Kwantificatie van schuim-cellen en macrofagen door microscopie (olie-Red O vlek)

1. verwijderen van de formaldehyde en wassen van de gels met 100 µL van 50% (v/v) methanol gedurende 5 minuten en dan 100 µL 78% (v/v)-methanol voor 15 min.
   Opmerking: De kleuring stappen kunnen worden uitgevoerd op de laboratorium-Bank en niet in een kast van klasse II Biohazard.
2. Vlek voor lipide druppeltjes door toe te voegen 100 µL van vers bereide 0,2% (m/v) olie-Red O (Zie Tabel van materialen voor details) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. De overtollige vlek verwijderen door te wassen de gels 4 keer met 100 µL van 78% (v/v) methanol, zuigen en teruggooi van het supernatans dat na elke wash.
4. Counterstain voor 15 minuten bij kamertemperatuur met 100 µL van de Giemsa, verdund 1:10 in gedestilleerd water.
5. Gecombineerd de Giemsa-kleuring en gels keer met water wassen.
6. Als u wilt loskoppelen van de gels van de plaat, rim de putjes met behulp van een naald 21 G, met de schuine kant naar buiten gericht, op de rand van de gel.
7. Voor montage van de gels op een microscoopglaasje, punch twee gaten (6.35 mm doorsnede) in een strook 2,54 cm x 1,5 cm voor dubbelzijdige tape. De tape aan de zijkant van een standaard Microscoop vast en verwijder de beschermende coating van de boven.
   1. Toevoegen een druppel water om de gaten in de tape met behulp van een precisiepipet overdracht. Met pincet, zachtjes overbrengen gels de gaten in de tape en bedek met een grootte van 1,5 glas dekglaasje aan. Druk zachtjes op het dekglaasje aan te houden het op tape.
8. Onderzocht met differentiële interferentie contrast helder-veld microscopie met behulp van 40 X doelstelling op een omgekeerde microscope.
   1. Brengen de HUVEC enkelgelaagde in focus op 40 X vergroting en blader ' in ' de gel, tellen macrofagen/schuim cellen gedurende de gehele diepte van de gel. Herhaal voor drie verschillende gezichtsveld gelegen op vergelijkbare afstanden vanaf de rand van de gel om te minimaliseren mogelijk randeffecten. Hierdoor zullen de diepte van de gel is consistente tussen regio's tellen.
      Opmerking: Score cellen in de gel als beide cellen schuim (gedefinieerd als cellen met > 1/3 van hun cytoplasma als olie-Red O gekleurd lipide druppels) of macrofagen binnen 2 uur voor montage op dia's ( Figuur 2). Schuim celvorming wordt uitgedrukt als het percentage van schuim cellen ten opzichte van het totale aantal gemigreerde cellen en de mediane graven in 3 gezichtsveld onderzocht voor 6 gels per aandoening, dus een gemiddelde van 18 metingen per voorwaarde wordt uitgedrukt. Een voorbeeld van ruwe cellen van een typisch experiment is weergegeven in tabel 2.
      Opmerking: Een cel te classificeren als een schuim cel vs macrofaag door microscopie is subjectief en bijgevolg kunnen afhankelijk van de onderzoeker. In klinische studies, waar experimenten worden uitgevoerd over een langere periode van tijd, is het belangrijk voor het tellen van alle verblind door een enkele onderzoeker worden uitgevoerd. Voorbeelden van schuim-cellen en macrofagen in gels vindt u in Figuur 2.

7. Analyse van Transmigrated cellen door Stroom Cytometry

1. fenotypische karakteriseren schuim-cellen en macrofagen na migratie van de signaalcomplexen, de gels door toevoeging van 100 µL van 37 ° C voorverwarmde 1 mg/mL collagenase D verdund in M199 te verteren elk goed en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C/5% CO ₂.
   Opmerking: Plaats de 96-wells-platen rechtstreeks op schone metalen rekken in de incubator om gelijkmatige warmteverdeling.
2. Na incubatie, de gels met behulp van een pipet tip van 200 µL maceraat en incubeer gedurende een verdere 20 min op 37 °C/5% CO ₂.
3. Eenmaal volledig verteerd, filter en zwembad de verteerd repliceren gels via 35 µm nylon mesh afgetopte FACS buizen geplaatst op ijs, en wassen eenmaal met FACS wassen (Zie tabel van materialen) bij 4 ° C, 300 x g. resuspendeer de cellen in 100 µL van FACS Wash.
4. Broeden de resulterende cellen met fluorophore-geconjugeerde antilichamen specifiek voor CD45, een leven/dood cel marker en oppervlak/intracellulaire fenotypische of functionele merkers van belang met behulp van standaard stroom cytometry protocollen.
   Opmerking: Bereiden controle buizen schadevergoeding met behulp van de juiste fluorophores en Ig compensatie kralen. Uitgepakte cellen kunnen ook worden verzameld in glas dia's voor immunofluorescentie microscopie door cytospinning. Anderzijds hebben we met succes verzameld cellen met behulp van dit protocol voor beoordeling via imaging stroom cytometry.
5. Cellen met behulp van een stroom cytometer verwerven en uitvoeren van compensatie overeenkomstig.
   Opmerking: Aangezien schuim cellen/macrofagen niet afzonderlijke populaties met lichte scatter eigenschappen vormen en aanzienlijk verschillen in grootte en vorm kan kunnen, ingesteld liberale voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) poorten om te vangen alle gemigreerde cellen zoals in < sterke class = "xfig" > figuur 3A.
6. Na overname, het uitvoeren van de gegevensanalyse met behulp van stroom cytometry software. Om te identificeren gemigreerde cellen, selecteert u eerst cellen als negatief voor de live/dead-markering zoals weergegeven in figuur 3B. Volgende, het uitvoeren van een eencellige discriminatie door het creëren van een strakke hek rond de cellen weergegeven op een perceel van SSC-gebied vs SSC-hoogte.
7. Selecteer CD45 ⁺ cellen en de grote bevolking van gemigreerde cellen in een proefvlak FSC/SSC poort als deze zijn de macrofagen/schuim cellen.

Results

Kwantificeren van monocyt zielsverhuizing

Monocyten worden toegevoegd aan het model zoals beschreven in Figuur 1en zes gels zijn bereid voor elke voorwaarde. Monocyten voor 6 gels per donor (dat wil zeggen, 5.0 x 10⁴ monocyten per gel 6 gels = 3.0 x 10⁵ monocyten per donor) geresuspendeerde zijn tot een eindvolume van 600 µL van M199 media met de lipid...

Discussion

Het protocol hier beschreven biedt een veelzijdig en fysiologisch relevante methode voor de beoordeling van de atherogenicity van monocyten van menselijke klinische cohorten, door zowel monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming te combineren. Dit model biedt voordelen ten opzichte van alternatieve methoden van schuim celvorming zoals het rekening houden met het effect van de monocyt zielsverhuizing op schuim celvorming en de meting van omgekeerde transmigratie⁶ naast de inherente laat neiging v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel preparation reagents
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH verdund in H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM azijnzuur verdund in H20
Cultrex Bovine Collagen I	R&D Systems	3442-050-01	Type I Fibrous Collagen
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Celcultuur
M199	Life Technologies	11150-059	M199 media met Earle's zouten, L-glutamine en 2,2 g/L natriumbicarbonaat. Media aangevuld met 100 µg/mL L-glutamine en 100 U/mL penicilline/streptomycine
M20			Aangevuld M199 met 20% hitte-geïnactiveerd gepoold of donor serum. Individuele lipidesoorten zoals LDL kunnen aan M199 worden toegevoegd.
HUVEC			Primaire humane navelstreng endotheliale cellen (HUVEC) kunnen worden geïsoleerd uit navelstreng die met geïnformeerde toestemming en ethische goedkeuring is gedoneerd. Geïsoleerde HUVEC kunnen ook commercieel worden gekocht.
Menselijke coronaire arterie endotheliale cellen			Primaire humane coronaire arterie endotheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit slagaders die met geïnformeerde toestemming en ethische goedkeuring zijn gedoneerd. Geïsoleerde cellen kunnen ook commercieel worden gekocht.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) - 0,5 M, pH 8,0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethyleenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA) - 1 mM, pH 8,0
0,05% trypsine EDTA	Gibco	25300-054	0,05% trypsine/0,53 EDTA (1X)
L-glutamine	Gibco	25030-081	L-glutamine (200 mM)
Penicilline/streptomycine	Gibco	15140-122	Penicilline/streptomycine (10.000 eenheden/mL Penicilline en 10.000 µg/mL Streptomycine)
Kalfsserum	Gibco	16010-142	Kalfsserum: Nieuw-Zeelandse oorsprong
Fibronectine	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectine - 50 µg/mL aliquoten bereid en bewaard
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (10x): Verdun tot 1x met steriele H20
0,1% TNF	Gibco	PHC3015	Recombinant menselijk TNF - Geconstitueerd in H20 en bewaard in 10 µg/mL aliquoten
Laag-dichtheidslipoproteïne	Merck Millipore	LP2-2MG	Laag-dichtheidslipoproteïne (LDL)
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microscopie
1 of 2% formaldehyde	Polysciences	4018	1 of 2% formaldehyde verdund met steriele H20
50% en 78% methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% of 78% v/v methanol, verdund met H20
Oil Red O-kleuring	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Verdun tot 2 mg/mL in 22% 1M NaOH en 78% (v/v) methanol
Microscoopglaasjes	Mikro-Glass	S41104AMK	Dubbel gefroste 45 graden geslepen rand microscoopglaasjes (25 X 76 mm)
Dekglasjes	Menzel-Gläser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1,5 maat glasdekglasjes
Dubbelzijdig plakband	3M Scotch	4011	Super sterk buitenmontagetape (25,4 mm x 1,51 m)
Giemsa-kleuring	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsa's azur eosin methyleenblauw oplossing (verdunde stock 1:10 in H20)
Vulpons			Handmatige enkelvoudige pons (6,35 mm pons)
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Flowcytometrie
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Collagenase D verdund in M199 media tot 1 mg/mL
35 µm nylon gaas dop polystyreen FACS buisjes	BD Biosciences	352235	35 µm nylon gaas dop polystyreen FACS buisjes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell-kleuring	Life Technologies	L34959	Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell-kleuring
FACS-was			Bereid door 1 X PBS-, 2 mM EDTA en 1% kalfsserum te mengen
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Kunststofmateriaal
96-wellsplaat	Nunclon	167008	Delta-oppervlakte vlak-gebodemde 96-wellsplaat
10 cm Petri-