Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Samenvatting

Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.

Samenvatting

Ontwikkeling van nieuwe microbiciden en vaccins voor Streptococcus pneumoniae (Schizophrenia) zijn noodzakelijk voor het stoppen van de snelle stijging van de meervoudige resistente stammen. Koolhydraten substraat bindende proteïnen (SBPs) vertegenwoordigen haalbare doelen voor de ontwikkeling van vaccins op basis van eiwitten en nieuwe antimicrobiële stoffen vanwege hun extracellulaire lokalisatie en de centraliteit van koolhydraten invoer voor pneumokokken metabolisme, respectievelijk. Hier beschreven is een gerationaliseerde geïntegreerde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide karakterisering van SP0092, die kan worden uitgebreid tot andere koolhydraten SBPs uit de pneumococcus en andere bacteriën. Deze procedure kan helpen het structuur gebaseerde ontwerp van remmers voor deze klasse van eiwitten. Gepresenteerd in het eerste deel van dit manuscript zijn protocollen voor biochemische analyse door thermische shift assay, multi hoek lichtverstrooiing (MALS) en uitsluiting chromatography (SEC), de grootte die het optimaliseren van de stabiliteit en homogeniteit van het monster gericht aan kristallisatie proeven en zo vergroten de kans op succes. Het tweede deel van deze procedure beschrijft de karakterisatie van de SBP kristallen met behulp van een afstembare golflengte abnormale diffractie synchrotron beamline en gegevens verzameling protocollen voor gemeten gegevens die kunnen worden gebruikt om op te lossen het gekristalliseerde eiwit structuur.

Inleiding

S. pneumoniae (Schizophrenia) is een gram-positieve bacterie die woonachtig zijn asymptomatically in de bovenste luchtwegen van de menselijke luchtwegen met de mogelijkheid om te migreren naar normaal steriele niches veroorzaakt otitis, sepsis, pneumonie en sepsis, en meningitis^1,2. Bovendien, pneumokokken infectie is de belangrijkste oorzaak van Gemeenschap-verworven pneumonie, die tot een klinische en economische last wereldwijd^{3,4 bijdraagt}. Antibioticum resistente stammen van S. pneumoniae hebben verspreid over de hele wereld en hoewel een zeven-valent en een dertien-valent pneumokokken eiwit geconjugeerde vaccin hebben bijgedragen aan het tarief van antimicrobiële resistentie, vervanging stammen uit verlagen vaccin gebruik naar voren zijn gekomen en hebben geleid tot hogere eisen voor onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor pneumokokken ziekte^5,,^6,,^7,8.

De pneumococcus is afhankelijk van suikers geïmporteerd uit de host als een CO2 bron^9,10; inderdaad besteedt het 30% van haar invoer apparaat voor het vervoer van 32 verschillende koolhydraten^11,-^12,13. Deze importeurs omvatten ten minste acht ABC-transporters¹³. In ABC vervoerders spelen de extracellulaire SBPs een fundamentele rol in het bepalen van de specificiteit voor de ligand en presenteert het aan de vervoerder integraal membraan voor opname in de cel. SBPs vertegenwoordigen geldige doelen voor het ontwerp van nieuwe vaccins en microbiciden, omdat ze oppervlakte-eiwitten en hun vitale rol in de cellulaire processen zijn.

Karakterisering van de eiwitten van het doel en gedetailleerde beschrijving van de structurele kenmerken, zoals ligand zakken en interdomain flexibiliteit, bieden een nuttig instrument voor structuur gebaseerde drug design^14,15. Röntgendiffractie is de methode van keuze voor de structurele karakterisatie van eiwitten bij in de buurt van atomaire resolutie, maar de kristallisatie proces is onvoorspelbaar, tijdrovend en niet altijd succesvol. Systematische methoden verbeterd het slagingspercentage en belangrijke factoren zijn de steekproef kwaliteit en stabiliteit. Het slagingspercentage van kristallisatie is beïnvloed door de chemische eigenschappen van de eiwitten en de sample voorbereiding methodologie. Het effect hiervan kan worden beoordeeld en door Biochemische karakterisering^16,17in kennis gesteld.

Een verdere complicatie voor structuur gebaseerde ontwerp is de kristallografische fase probleem, die moet worden aangepakt. Zoals meer eiwit structuren beschikbaar zijn gekomen, kunnen vele structuren worden opgelost door de methode van moleculaire replacement, waarvoor een homologe structuur¹⁸. SBPs presenteren een flexibele domeinstructuur, kan moleculaire vervanging ook blijken uitdagende¹⁹. Als een structureel model dat voldoende vergelijkbaar is met het doel-eiwit niet beschikbaar is, kan een aantal technieken te verkrijgen van de experimentele phasing²⁰worden gebruikt. Onder deze, de Single-golflengte Anomalous Dispersion (ed)-methode heeft ontpopt als de primaire techniek en uitgebreid om op te lossen het probleem fase²¹is gebruikt. Het gebruik van de trieste methode heeft verder naar voren geschoven met verbeteringen in de hardware en software, evenals gegevens verzameling strategieën om de opsporing en het gebruik van zwakke abnormale signalen voor geleidelijke afschaffing van^{22,23, 24}. Bovendien, voorschotten in directe methode voor het oplossen van de structuur van macromoleculen, die in het verleden diffractie gegevens naar atomaire resolutie vereiste, kan nu worden gebruikt door combineren bijvoorbeeld stereochemische kennis, zoals dit is geïmplementeerd in het programma ARCIMOLDO²⁵. Een nuttig overzicht van methodes voor het oplossen van het probleem van de fase in de kristallografie is gegeven door Taylor²⁶.

Hier presenteren we een gerationaliseerde protocol voor de karakterisatie van de koolhydraten vervoer SBP, SP0092 van S. pneumoniae, integratie van biochemische en structurele technieken (Figuur 1). Dit stapsgewijze protocol biedt een nuttig voorbeeld testcase van strategieën ter verbetering van het slagingspercentage van structurele studies over SBPs in het algemeen, die te in alle koninkrijken van het leven vinden zijn. Met name het protocol benadrukt het belang van het karakteriseren van de meest stabiele oligomere staat van het eiwit in oplossing in een snelle en doeltreffende methode, en de identificatie van de beste soort te volgen voor de kristallisatie experimenten kunt. Hoewel er meer dan 500 SBP structuren gemeld in de Protein Data Bank²⁷, kan moleculaire vervanging lastig vanwege de flexibele aard van de twee α/β-domeinen, die zijn verbonden door een scharnier regio¹⁹. Dus, het tweede deel van het protocol wordt beschreven met de trieste methode voor geleidelijke afschaffing van gebonden metaalionen, die gemeenschappelijk in SBPs, evenals de opneming van selenomethionine en het gebruik van selenium (Se is) in Trieste geleidelijke.

Protocol

Opmerking: de codering volgorde waarvoor de signaal-peptide is verwijderd wordt gekloond in de vector van de pOPINF na een standaardprotocol in-fusion; de inheemse proteïne wordt uitgedrukt als een fusie van de His-tag in Escherichia coli BL21 Rosetta cellen ^{28 , 29}. de selenomethionine label variant wordt uitgedrukt standaardmethoden volgens de fabrikant ³⁰ na. De recombinant SBP wordt gezuiverd zoals eerder beschreven ^{31 , 32}.

1. Biochemische karakterisering

1. thermische Verschuif assay
   1. bereiden 48 bufferoplossingen met een pH variërend van 4.0 naar 9.5 en concentratie van NaCl van 0 tot 0.5 M, en afzien van 40 µL in een 96-wells-plaat, zoals beschreven in Tabel 1 ³³.
   2. toevoegen aan elke goed 5 µL van de SBP-oplossing bij concentratie 1-2 mg/mL.
   3. Toevoegen aan elke goed 5 µL van 20 x TL vlek voor eiwitten (Zie Tabel of Materials).
   4. Spin voor 2 min bij 112 x g bij kamertemperatuur, Vermeng de oplossingen door pipetteren en afdichting van de plaat met behulp van een transparante kleeffilm.
   5. Draaien van het experiment op een real time machine: instellen van de helling van een temperatuur van 3 ° C/min van 4 tot 99 ° C met een 10 s wacht tijd en lees de fluorescentie elke 0,5 ° C met excitatie op 483 nm en emissie bij 568 nm.
   6. Analyseren de fluorescentie emissie curven voor elke aandoening van de buffer, de smelttemperatuur (T _m) identificeren als het minimum van de afgeleide.
      Opmerking: Deze procedure geeft een goede indicatie van de beste bufferoplossing om te helpen bij de verbetering van eiwitstabiliteit. Kies de pH bereik en zoute concentratie op basis van de voorwaarde van de buffer met het hoogste T _m en toevoegen van 2,5% (v/v) van glycerol en 0,5 mM voor tris(2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP) om te bepalen van de bufferoplossing voor de volgende stappen (SEC-buffer).
2. MALS en analytische SEC
   1. uitvoeren van een twee-kolom volume wassen van de voorverpakte gel filtratie kolom met ontgaste gefilterd water (gebruik een breed scala moleculair gewicht 24 mL-kolom).
   2. De kolom verbinden met de verstrooiing van licht detector en de kolom met de vastberaden SEC-buffer van de bepaling van de thermische shift equilibreer.
   3. Injecteren 100 µL van gezuiverde SBP op in het volume van het equilibrated SEC kolom en stroom de kolomwaarde voor SEC-buffer 5 mg/mL.
   4. Controleren het chromatogram elutie voor één of meerdere pieken en de verstrooiing gegevens met behulp van de software van de analyse, verkrijgen de molaire massa en de polydispersiteit index voor alle soorten onderzoeken.
      Opmerking: Voor elke piek overeenkomt met een oligomere soorten, is het nuttig om het controleren van de polydispersiteit index berekend als molaire massa gewogen op massa/molar massa gewogen op aantal moleculen (Mw/Mn). Polydispersiteit waarde dicht bij 1 geeft aan een piek monodispersed.
      Opmerking: Zodra de oligomerisatie van alle soorten zijn gedefinieerd, is het nuttig zijn te onderzoeken hun afhankelijkheid van de eiwitconcentratie, zoals hogere concentraties kunnen het voordeel van grotere oligomeren vorming.
   5. Uitvoeren van meerdere analytische SEC loopt; injecteren 100 µL van gezuiverde SBP op toenemende concentraties (0.1 - 10 mg/mL) in de kolom filtratie geëquilibreerd gel (gebruik een breed scala moleculair gewicht 5 mL kolom) en stromen van één kolom volume van de SEC-buffer telkens.
   6. Het chromatogram elutie voor één of meerdere pieken controleren en analyseren de intensiteiten van de extinctie op 280 nm van de curven die overeenkomt met verschillende startende eiwit concentraties. Als de relatieve intensiteiten van de verschillende toppen constant blijven, dan ontbreekt geen Inter conversie tussen de oligomere soorten niet. Variatie in de relatieve intensiteiten in verschillende concentraties is een indicatie van de interconversion tussen verschillende oligomere soorten die afhankelijk is van de eiwitconcentratie.
      Opmerking: Deze karakterisering stap is van fundamenteel belang om te bepalen welke soorten zijn meer geschikt voor kristallisatie. Inderdaad, de verschillende monodispersed soorten zijn meer vatbaar voor kristalliseren als ze in een gestage oligomere staat bij een bepaalde concentratie zijn.

2. Eiwit voorbereiding en kristallisatie

1. voorbereidende SEC
   1. na een één kolom volume wassen met ontgaste gefilterd water, equilibreer met SEC-buffer de voorbereidende voorverpakte gel filtratie kolom (allerlei moleculaire gewicht 120 mL kolom).
   2. 1-5 mL van gezuiverde SBP bij 5-50 mg/mL te injecteren in de gel geëquilibreerd filtratie kolom en stroom één kolom volume van de SEC-buffer.
   3. Verzamelen de kolom doorstroming in fracties van 1 mL.
   4. Bundelen de breuken die overeenkomt met een enkele monodispers piek; spin van het monster in 15 mL centrifugeren filters bij 1.500 g en kwantificeren van de concentratie, totdat de gewenste concentratie wordt bereikt (meestal 50-100 mg/mL voor SP0092).
2. Kristallisatie
   1. bepalen het bereik van de optimale concentratie voor de kristallisatie experiment met de pre kristallisatie Test zoals beschreven door de fabrikant:
      1. Doseer 0,5 - 1,0 mL van elk van de vier kristallisatie-test oplossingen in een ander reservoir van een vergadering 24-well drop kristallisatie plaat.
      2. Bereid de kristallisatie druppels door het mengen van 1 µL van eiwit-oplossing met 1 µL van reservoir oplossing, afdichting van de plaat en Incubeer bij kamertemperatuur voor maar liefst 1 h (betrouwbaardere resultaten worden verkregen na een incubatieperiode van overnachting).
      3. Controle van de kwaliteit van de daling voor elke concentratie met behulp van een 10 x vergroting Microscoop.
         Opmerking: Test ten minste drie verschillende eiwitconcentratie: (I) het merendeel van de druppels resterende duidelijk aangeven dat het eiwit ook verdund voor kristallisatie is; (II) de aanwezigheid van zware neerslag in het merendeel van de druppels impliceert een te hoge concentratie; en (III) een evenwichtige vóórkomen van zowel duidelijk druppels en neerslag (beter als lichte) is een goede indicatie dat de geteste concentratie gunstig voor de kristallisatie is.
   2. Bereiden de daling van de 96-Wells vergadering kristallisatie platen; afzien van 100 µL van verschillende commerciële kristallisatie oplossing in elk reservoir goed ^{34 , 35}, ^{, 36 , 37}.
   3. afzien 100 nL van eiwitSteekproef bij de eerder gedefinieerde concentratie (stap 1.1.6) in alle de kristallisatie drop putjes met behulp van een robot systeem van kristallisatie.
   4. 100 afzien nL van het reservoir van verschillende oplossingen voor het corresponderende kristallisatie drop putten te mengen met eiwitten afgeleverd in stap 2.2.3. Zegel van de kristallisatie plaat om te voorkomen van verdamping en inschakelen van de evenwichtsinstelling van de daling van de kristallisatie met het reservoir.
   5. Check de druppels periodiek (aanvankelijk elke 1-2 dagen, later elke week) (ten minste) met behulp van een 10 x vergroting Microscoop kristal vorming en groei te evalueren.
      Opmerking: Een geautomatiseerd imaging systeem voor eiwit kristallisatie kan worden gebruikt voor drops visualisatie en vastleggen.

< p klasse = "jove_title "> 3. Crystal karakterisering en verzamelen van de gegevens van de X-ray

1. Crystal montage
   1. bereid de cryoprotectant-oplossing door het toevoegen van 25% (v/v) glycerol (eindconcentratie) aan de voorwaarde van de kristallisatie (dus ter vervanging van 25% van het water in de eerste mengsel) ³⁸.
   2. Vul een schuim dewar met vloeibare stikstof en plaats het monster behuizing deel van een uni-puck in de dewar. Laat het afkoelen tot temperatuur van vloeibare stikstof.
   3. Knippen en verwijderen de afdichting van de plaat kristallisatie tape over de daling waar de kristallen worden gevormd.
   4. Breng een druppel van 1 µL van cryoprotectant oplossing op een coverslide geplaatst in de nabijheid van de daling van de target.
   5. Overbrengen van het geselecteerde kristal uit de oorspronkelijke drop naar de daling van de cryoprotectant oplossing met behulp van een nylon cryo-lus op een rug standaardgrondslag gemonteerd op een magnetische wand ^{39 , 40}.
   6. Snel overbrengen in het kristal vanuit naar de waterdruppel cryoprotectant vloeibare stikstof, het plaatsen van de lus in de eerste lege positie van de monsterhouder uni-puck.
   7. (Uit de afdichtende tape gesneden stap) herhalen totdat alle de gewenste kristallen worden geoogst en in de uni-puck monsterhouder opgeslagen.
   8. Plaats de uni-puck baseren op de uni-puck met behulp van de toverstaf puck en neem de puck naar de beamline (in vloeibare stikstof omstandigheden).
      Let op: Extreem lage temperatuur!
   9. Gebruiken de cryo-Tangen en de puck dewar laden hulpmiddel voor het laden van de uni-puck(s) tot de beamline monster wisselaar robot dewar. De monsterhouder uni-puck zal losmaken van de base deksel rechtop in de robot monster verlaten van de houders van de lus monster dewar dus blootgesteld aan de vloeibare stikstof en toegankelijk naar de robot monster wisselaar.
2. Crystal karakterisering
   Opmerking: de geoogste kristallen kunnen vervolgens worden gescreend voor diffractie kwaliteit met behulp van ofwel een laboratorium X-ray source of bronbelasting een X-ray synchrotronstraling (SR). Macromoleculaire kristallografie (MX) straallijnen bieden een afstembare energiebron misbruik wil maken van abnormale diffractie voor structuur oplossing. In de volgende sectie, een reeks werkvoorschriften in overeenstemming met de experimentele mogelijkheden van Diamond licht bron MX straallijnen is voorgesteld, maar deze richtsnoeren kunnen ook worden aangepast aan de MX straallijnen op andere synchrotrons wereldwijd.
   1. Als een eerste stap, is het nuttig om te bevestigen of identificeren van afwijkende scatterers in het kristal. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door het meten van een spectrum van X-ray fluorescentie van het kristal. Eerst Stel de X-ray-energie van de beamline is hoog genoeg om alle elementen die doorgaans verwacht voor macromoleculaire kristallen prikkelen (14 keV of hoger).
   2. Gebruik van de software van de controle van de beamline om te selecteren het monster te worden gemonteerd door de robot monster wisselaar; de lus automatisch wordt gecentreerd in de X-ray-balk en de centrering van de kristallen kan worden bevestigd handmatig met behulp van de software van de controle van de beamline.
   3. Opnemen een X-ray fluorescentie spectrum met behulp van de software van de controle van de beamline: de gebruiker selecteert een belichtingstijd en initieert de meting (fluorescentie/fluorescentie Spectrum instelling, → uitvoeren, figuur 2A). De software van de controle van de beamline plaatst automatisch de X-ray fluorescentiedetector in plaats en bepaalt de minimale incident X-ray flux te verkrijgen van een leesbaar signaal op de fluorescentiedetector. De verworven spectrum wordt vervolgens geanalyseerd op een geautomatiseerde wijze met emissie pieken gemonteerd op natuurlijk voorkomende biologische elementen. Deze routines beschikbaar zijn binnen de beamline controle software grafische gebruikersinterface (GUI) - GDA (www.opengda.org) bij ons bedrijf en synchrotrons in heel Europa ^{41 , 42}.
   4. Als geschikte elementen worden geïdentificeerd die kunnen worden benut voor een abnormale diffractie-experiment, uitvoeren van een X-ray absorptie rand energie scan om te bepalen van de optimale golflengte voor collectie van abnormale diffractie gegevens uit het kristal: op de beamline controle software, selecteert u het element en de scan starten (fluorescentie/fluorescentie Scan instelling, → atoom naam, → uitvoeren, figuur 2B).
      Opmerking: Voor een enkele afwijkende diffractie-experiment, het hoogtepunt van de absorptie rand wordt gebruikt voor het maximaliseren van de abnormale verstrooiing. Experimentele overwegingen voor het uitvoeren van een experiment multi golflengte abnormale diffractie geweest eerder gedetailleerde ⁴³.
   5. Om te bepalen van de eenheidparameters cel crystal, symmetrie en diffractie limiet, drie röntgendiffractie patronen meten tussenpozen 45° met de trilling-methode (Data collectie/Screening → draaien current, Figuur 2C). De software van de controle van de beamline biedt de gebruiker met een keuze van trilling hoek en blootstellingstijd en de mogelijkheid om de overdracht van het percentage van de X-ray-balk. Voor een standaard crystal-screening, een hoek van de trilling van 0,5 °, een belichtingstijd van 0,5 s, en 5% X-ray lichtbundel transmissie worden aanbevolen. De gemeten diffractie-beelden worden automatisch geanalyseerd door de pijpleiding EDNA en een set van strategieën voor de collectie van een volledige gegevensset ²² retourneren.
3. X-ray gegevensverzameling
   Opmerking: de gebruiker kan selecteren om gegevens in de standaard-interstadiaal modus of inverse beam-modus, waarmee Friedel stuurlieden dicht worden geregistreerd in de tijd en X-ray dosis, en met ongeveer hetzelfde absorptie gedrag te verzamelen het toestaan van een meer nauwkeurige meting van abnormale verschillen. De laatste is handig, vooral als kleine abnormale verschillen worden verwacht en/of de monsters straling gevoelig zijn bij het uitvoeren van een abnormale diffractie-experiment. Beschouwingen over de beste strategieën van de verzameling van de gegevens te gebruiken zijn volledig herziene ^{22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47}.
   1. met behulp van de software van de controle van de beamline, het importeren van de collectie parameters zoals voorgesteld door het programma van de strategie die zal bieden:
      i. beginpositie van de ω-rotatie-as
      ii. Breedte van de trilling van de ω-as rotatie hoek voor elke afbeelding diffractie
      iii. Belichtingstijd voor elke afbeelding diffractie
      iv. Aantal afbeeldingen voor een volledige dataset (niet indirect de totale ω-as rotatiehoek voor de hele gegevensverzameling definiëren)
      v. Percentage van demping van de X-ray-balk om overmatige blootstelling en straling schade te voorkomen
      Opmerking: bij onze instelling voor met het verzamelen van gegevens, de pijpleidingen software voor geautomatiseerde verwerking van de verzamelde gegevens zijn goed ingeburgerd: (i) de diffractie gegevens worden verlaagd (geïndexeerde, geïntegreerde en geschaald) door de xia2-pijpleiding, die genereert reflectie mtz bestanden voor de gebruiker als input voor een geleidelijke en structuur van de oplossing/verfijning ⁴⁸. (ii) wanneer een aanzienlijke afwijkend signaal wordt gedetecteerd tijdens data-analyse, een eerste snelle geautomatiseerde structuur oplossing pijpleiding (fast_ep) met behulp van SHELX probeert op te lossen van de zware atoom onderbouw door experimentele fasering, het verstrekken van een gefaseerde elektronen dichtheid kaart Wanneer dat haalbaar is. Een tweede meer omvattende structuur oplossing pijpleiding verbindt automatisch pogingen op te lossen en de structu bouwenopnieuw met behulp van onafhankelijke software suites ^{49 , 50 , 51 , 52}; in gevallen waar dit succesvol is, zal de gebruiker worden voorzien van een eerste model en elektron dichtheid kaart. Dit vormt de basis voor de gebruiker om te voltooien van verfijning en valideren van het model met de kristallografische software suites van keuze.

Resultaten

Dit geïntegreerde protocol is bewezen succesvol met vier (twee gepubliceerde en ongepubliceerde twee structuren) van zes koolhydraten bindende eiwit doelstellingen van Schizophrenia geanalyseerd tot op heden^32,,⁵³. In deze sectie presenteren wij de biochemische en structurele karakterisatie van SP0092 als een representatief resultaat te begeleiden van structurele studies van SBPs in het algemeen.

Nadat de SBP-SP0092 is uitgedrukt en gezuiverd zoals eerder omschreven³², het gezuiverde eiwit werd geanalyseerd voor stabiliteit van de buffer met behulp van een thermische shift test: SP0092 vertoont een verhoogde T_m met een pH van 6.5 en in aanwezigheid van NaCl in de 0 - 0.2 M concentratiebereik (figuur 3A). In dit licht was de bufferoplossing voor de volgende stappen gedefinieerd als: 0,02 M MES pH 6,5, 0,2 M NaCl, 2,5% (v/v) glycerol, 0.5 mM TCEP. De absolute molaire massa van de Staten van de verschillende oligomerisatie van SP0092 werd gemeten door MALS gekoppeld aan SEC het meten van een molecuulgewicht van 187,2, 140,8 97,0 en 49.4 kDa, overeenkomt met het tetramere, trimeric, dimeric en monomeer soorten, respectievelijk () Figuur 3B). Het onderzoek van de SEC-profiel in verschillende eiwit verdunningen bleek dat de oligomerisatie wordt geactiveerd door verhoogde eiwitconcentratie, suggereren dat de grotere oligomeren stabieler bij hogere concentraties dan meestal gebruikt in kristallisatie. Inderdaad, de gezuiverde grotere oligomere soorten omgeleid naar kristallisatie proeven, met succes geproduceerde eiwit kristallen terwijl het monomeer soorten niet.

De geoptimaliseerde kristallen verkregen uit de inheemse en Se-methionine vormen van SP0092 het label werden gekenmerkt door röntgendiffractie. Meting van de Röntgen fluorescentie van deze kristallen geopenbaard in beide gevallen emissie pieken voor Zn wordt gebonden aan het eiwit, terwijl Se alleen voor de Se-methionine kristallen zoals verwacht werd ontdekt. Later, werden X-ray absorptie scans aan de randen van de Se en Zn uitgevoerd, die geboden directe experimentele gegevens om af te stemmen op het incident golflengte X-ray aan de respectieve X-ray absorptie randen van Zn of Se presenteren in de kristallen te maximaliseren van het afwijkend signaal verkrijgbaar bij de resulterende gegevens (figuur 4A-B).

Na drie diffractie patronen op lage transmissie te meten, werd een complete set voor afwijkende gegevens verkregen met behulp van de gegevens collectie strategie voorgesteld door EDNA (figuur 4C). Het afwijkend signaal aanwezig activeert de geautomatiseerde phasing pijpleiding op de beamline om te bepalen van de sub structuur, en op basis van de eerste experimentele fasen afgeleid, produceert eerste kaarten en modellen, die vervolgens kunnen worden verfijnd en gevalideerd (Figuur 4 d ).

Kortom, zijn potentiële valkuilen van de techniek gecentreerd voornamelijk op crystal beschikbaarheid en kwaliteit. Optimalisatie van de voorwaarden van de buffer te verbeteren van eiwitstabiliteit, alsmede de identificatie van de meest geschikte oligomere staat van het eiwit te gebruiken, wanneer meer dan één oligomeren wordt geïdentificeerd in oplossing, kan het risico van mislukking op de kristallisatie fase. Exploitatie van het gebruik van afhankelijke metaalionen in een vroeg stadium geïdentificeerd kan versnellen structuur oplossing en vermijden van geen onnodige productie van selenomethionine label eiwit als vervanging van de moleculaire methoden falen.

Figuur 1. Diagram van de workflow voor biochemische en structurele karakterisatie van koolhydraten SBPs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Crystal karakterisering in GDA. (A) Screenshot van het tabblad Röntgen fluorescentie beheer van de software van de controle van het beamline van GDA. (B) Screenshot van de X-ray energie rand-scan controle tab in GDA. (C) Screenshot van het tabblad gegevens verzameling crystal screening in GDA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3. Biochemische karakterisering van SP0092^39-491. (A) 3D-oppervlak grafiek plotten van de smelttemperatuur van SP0092^39-491 als een functie van de pH en de concentratie van de NaCl bufferoplossing. (B) SEC en MALS resultaten voor SP0092^39-491. Absorptie bij 280 nm wordt in blauw weergegeven. De molaire massa van de verschillende oligomerisatie Staten worden in rood weergegeven. Deelvenster (B) is gewijzigd van³². Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4. Structurele karakterisering van SP0092^39-491. (A) en (B) X-ray absorptie energie scan aan de rand van het Zn en Se voor SP0092^39-491 kristallen. De gemeten fluorescentie van de Zn en Se met kristallen wordt weergegeven in het blauw, cyaan en de berekende f' en f "abnormale verstrooiing breuken zijn in groen en rood, respectievelijk. (C) voorbeelden van röntgendiffractie patronen verzameld uit SP0092^39-491 kristallen. (D) Cartoon vertegenwoordiging van de SP0092^39-491 dimeer structuur. Een protomer is wit gekleurd en de andere magenta (residuen 39-366) en violet (residuen 367-491), en de abnormale verstrooiing atomen worden weergegeven als blauwe en cyaan ballen voor Zn en Se, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

0,1 M citroenzuur pH 4.0

0,1 M citroenzuur pH 4,5

0,1 M fosfaat pH 5.0

0,1 M citraat pH 5.5

0,1 M Bis-tris pH 6

0,1 M ADA pH 6,5

0,1 M MOPS pH 7

0,1 M HEPES pH 7.5

0,1 M imidazool pH 8,0

0,1 M Tris pH 8,5

0,1 M CHES pH 9

0,1 M CHES pH 9,5

NaCl 0 M

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL

40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,1 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,2 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0.5 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL

Tabel 1. De samenstelling van de buffer voor thermische shift assay.

Discussie

In deze paper, we beschrijven en valideren van een geïntegreerde protocol voor biochemische en structurele karakterisatie van SBPs koolhydraten met een specifieke nadruk op eiwitten van S. pneumoniae. Niettemin, dit kan worden gebruikt als een standaardprocedure voor de analyse van andere SBPs uit verschillende organismen en zelfs andere niet-verwante oplosbare eiwitten.

Het eerste deel van het protocol is gericht op het verstrekken van biochemische informatie over eiwitstabiliteit en quaternaire structuur, die kan worden benut bij de voorbereiding van EiwitSteekproeven voor kristallisatie. In de sectie thermische shift testen beschrijven we alleen de pH en NaCl concentratie variaties het algemene karakter van deze procedure te handhaven. Ondanks dit, vele andere aandoeningen in de buffer kunnen worden getest op een gelijkaardige manier, bijvoorbeeld, met inbegrip van een chemische verbinding die als een stabiliserende additief gebruikt: met name de werkelijke ligand(s) die zich aan een specifieke SBP binden zijn opmerkelijk effectief in het verhogen van de T_m door een paar graden Celsius³¹. In sommige gevallen kunnen het denatureren curven slecht worden gedefinieerd als gevolg van lage signaal of een achtergrond van hoge fluorescentie, die wordt veroorzaakt door de aggregatie van eiwitten of gedeeltelijke ontvouwen. Om dit te voorkomen, kan een eiwit: kleurstof titratie worden uitgevoerd om de onduidelijk denatureren curven optimaliseren. Geen verbetering wordt verkregen, screening van verschillende additieven die de stabiliteit van het eiwit verbeteren kunnen wordt geadviseerd als geschikte schermen geweest eerder beschreven⁵⁴.

Meestal de meeste SBPs zijn monomeer in hun natuurlijke omgeving, maar zoals hier multimerization kan optreden bij de hogere concentraties gebruikt in kristallisatie experimenten, dus de oligomerisatie gedrag karakterisering geboden door MALS en SEC is van essentieel belang om de meest gunstige stabiel monodispers oligomerisatie toestand voor kristallisatie te beoordelen. Het is echter moeilijk te voorspellen van het effect van verschillende chemische stoffen die zijn opgenomen in de voorwaarde van de kristallisatie van het gedrag van de oligomerisatie van de eiwitten. Als de SEC en MALS onderzoek uitgebreide aggregatie van de eiwitSteekproef toont, adviseren wij het volgende aan het verminderen van de kans dat dit zich voordoet: verse eiwitSteekproef (niet bevriezen-ontdooid) gebruiken en uitbreiden van de stabilisatie-analyse uitgevoerd met thermisch Shift testen, testen mogelijk additieven en milde detergenten als een laatste resource, tot een minimum beperken van aggregatie. In deze paper presenteren we basisrichtsnoeren voor kristallisatie high-throughput sparse matrix commerciële kristallisatie screening met het algemene karakter van dit protocol te handhaven. Echter het verkrijgen van hoge-resolutie röntgendiffractie eiwit kristallen wellicht iteratieve fijnafstemming voor het optimaliseren van de kristallisatie voorwaarden met betrekking tot de precipitant concentratie, pH, toevoeging van chemische additieven, verschillende temperaturen, en andere factoren de veranderende dynamica van het evenwicht tussen de kristallen druppel en reservoir^16,17.

Het tweede deel van het protocol wordt de karakterisatie van de eiwit-kristallen beschreven ter vaststelling van de optimale strategie voor röntgendiffractie gegevensverzameling met een specifieke focus op de verwerving van afwijkende gegevens voor triest geleidelijke. Zelfs als SBPs een soortgelijke algemene architectuur handhaven (en er vele gedeponeerde 3D structuren mogelijk bruikbaar zijn als startende modellen), fasering van deze eiwitten door de methode van de moleculaire replacement is niet altijd eenvoudig vanwege de variabiliteit van de secundaire structuur elementen en de intrinsieke flexibiliteit van deze proteïnen. Vandaar, wij stellen de trieste methode en benadrukken dat deze proteïnen reeds hebben intrinsiek gebonden kunnen metalen of inderdaad niet-specifieke binding van metalen uit de kristallisatie buffer voorwaarden, die een aantal abnormale buigingsinrichting elementen zoals bieden kunnen een standaard stap in onze algemeen protocol.

Kortom, definieert dit protocol een standaard begeleide werkstroom van procedures waardoor de gedetailleerde beschrijving van de biochemische en structurele kenmerken van de SBPs die kunnen worden benut om het verhogen van het slagingspercentage van structuur vastberadenheid, evenals het versnellen de structurele karakterisatie van SBPs in het algemeen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SelenoMethionine Medium Complete	Molecular Dimensions	MD12-500	Gebaseerd op een synthetisch M9 minimaal media aangevuld met glucose, vitaminen en aminozuren met uitzondering van L-methionine. Andere equivalente producten zijn commercieel verkrijgbaar bij andere bedrijven.
MicroAmp Optical 96-Well plate	Applied Biosystems	4306737	De Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reactieplaat met Barcode is geoptimaliseerd om ongeëvenaarde temperatuurnauwkeurigheid en uniformiteit te bieden voor snelle, efficiënte PCR-amplificatie. Deze plaat, geconstrueerd uit een enkel stuk stijf polypropyleen in een 96-well formaat, is compatibel met Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR-systemen en thermale cyclussen.
SYPRO Orange	Molecular Probes	S6651	SYPRO Orange Protein Gel Stain is een gevoelige, kant-en-klare fluorescente vlek voor eiwitten in 1D gels. Een vrij universele en goed gevestigde eiwitkleurstof voor hydrofobe regio's.
MicroAmp Optical Adhesive film	Applied Biosystems	4311971	De Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film vermindert de kans op well-tot-well besmetting en sample verdamping wanneer toegepast op een microplaat. Het is ideaal voor optische meting, omdat het een lage achtergrond geeft.
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems	4362143	Het Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-systeem maakt standaard 96-well formaat hoge snelheid thermische cyclus mogelijk, waardoor uw uitvoeringstijd voor kwantitatieve real-time PCR-toepassingen aanzienlijk wordt verkort, met resultaten in ongeveer 30 minuten. Het Upgrade-kit is beschikbaar om een standaard 7500 Real-Time PCR-systeem te upgraden naar de Fast Configuratie via een service-installatie in het veld. Andere RT-PCR-machines kunnen worden gebruikt. Gegevensexport niet eenvoudig voor de oude data-analysesoftware.
Superdex 200 increase 10/300 GL column	GE Healthcare	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL is een veelzijdige, voorgepakte kolom voor exclusiechromatografie in kleinschalige (mg) preparatieve zuivering evenals voor karakterisering en analyse van eiwitten met molecuulgewichten tussen 10 000 en 600 000, zoals antilichamen. Optimale scheiding ideaal voor hoge resolutie biofysische technieken.
DAWN HELEOS II	Wyatt		DAWN HELEOS II is de belangrijkste Multi-Angle statische Lichtverstrooiing (MALS) detector voor absolute karakterisering van de molaire massa en grootte van macromoleculen en nanodeeltjes in oplossing. De DAWN biedt de hoogste gevoeligheid, het breedste bereik van molecuulgewicht, grootte en concentratie, en de grootste selectie van configuraties en optionele modules voor verbeterde mogelijkheden. Andere MALS detectiesystemen van andere bedrijven behalve Wyatt zijn niet getest, dus er kan geen aanvullende feedback worden gegeven.
Superdex 200 5/150 GL	GE Healthcare	28906561	Superdex 200 zijn voorgepakte exclusiechromatografie kolommen voor hoog-resolutie kleinschalige preparatieve en analytische scheidingen van biomoleculen. Superdex 200 heeft een scheidingsbereik voor moleculen met molecuulgewichten tussen 10 000 en 600 000. De piekscheiding is niet zo optimaal als voor de "increase" versie, maar dit model is ideaal voor het standaard dagelijks gebruik.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade zijn voorgepakte XK kolommen ontworpen voor hoog-resolutie preparatieve gel filtratie chromatografie.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate	MiTeGen	XQ-P-24S-A	De 24 well "big" kristallisatieplaat wordt voornamelijk gebruikt voor eiwitkristallen screening door sitting drop dampdiffusietechnieken, en voor optimalisatie van kristallisatiecondities. Het heeft een vrij grote reservoirput en monstercontainer, die gunstig zijn voor handmatig hanteren en grote eiwitkristallengroei. Bovendien zijn de vlakke oppervlakken gemakkelijk te verzegelen met transparant plakband of dekglasjes.
PCT Pre-Crystallization Test	Hampton	HR2-140	De PCT Pre-Crystallization Test wordt gebruikt om de geschikte eiwitconcentratie voor kristallisatie screening te bepalen.
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	6098xx	Vierkante putjesplaten hebben drie kristallisatieputjes per reservoir, waardoor het mogelijk is om 288 monsters per plaat te testen. Over het algemeen alleen gebruikt voor de initiële screening omdat hun vierkante rand het vissen van kristallen bemoeilijkt.
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601	De Universal V1-Puck (Uni-puck) is een opslag- en verzendcontainer voor monsterspinnen voor gebruik met de meeste geautomatiseerde monstermontagesystemen wereldwijd - inclusief de ACTOR, SAM en CATS systemen onder anderen (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI en in de VS)
Standard Foam Dewar	Molecular Dimensions	MD7-35	5,7" diameter door 2,8" diep. 800mL capaciteit.
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton	HR4-955	Gemonteerde CryoLoops met 20 micron diameter nylon. Deze nylon loops zijn gebonden aan holle, roestvrijstalen MicroTubes™ die worden gebruikt om de kristallen te monteren, invriezen en vastzetten tijdens cryokristallografische procedures en röntgengegevensverzameling. Er bestaan verschillende maten en ze kunnen worden aangepast in lengte. Het zijn behoorlijk veelzijdige tools.
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607	Dit gereedschap wordt gebruikt om uni-pucks te scheiden om ze in de robotdewar te laden. Het bestaat uit twee delen: een Teflon buis en een metalen staaf.