Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays

Samenvatting

Blootstelling aan milieu-toxines kan acuut ontwikkelende embryo's beïnvloeden. Hormoonontregelende chemische stoffen zoals Bisfenol is bekend dat een nadelige invloed op het zenuwstelsel. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een in vitro gewerveld dier (chick embryo) neuronale netwerkmodel te bestuderen van de functionele gevolgen van toxine blootstelling op vroege embryo's.

Samenvatting

BIB-fenolen, zoals bis-fenol A (BPA) en bis-fenol-S (BPS), zijn actinemonomeren agenten op grote schaal gebruikt in de productie van plastics en talrijke alledaagse producten. Ze worden geclassificeerd als endocriene storende stoffen (EDC) met estradiol-achtige eigenschappen. Langdurige blootstelling aan EDCs, zelfs op lage doses, is verbonden met verschillende gezondheid defecten met inbegrip van kanker, gedragsstoornissen en onvruchtbaarheid, met grotere kwetsbaarheid vroege developmental perioden. We gebruikten om te bestuderen van de effecten van BPA op de ontwikkeling van neuronale functie, een in vitro neuronale netwerk afgeleid van de vroege embryonale kuiken-hersenen als een model. We vonden dat de blootstelling aan BPA beïnvloed de ontwikkeling van de netwerkactiviteit, specifiek stekelige activiteit en synchronisatie. Een verandering in de netwerkactiviteit is de cruciale verbinding tussen het moleculaire doel van een drug of samengestelde en het effect op gedrags uitkomst. Multi elektrode matrices zijn steeds meer nuttige hulpmiddelen om te bestuderen van de effecten van drugs op netwerk activiteit in vitro. Er zijn verschillende systemen beschikbaar in de markt en, hoewel er variaties in het aantal elektroden, het type en de kwaliteit van de elektrodenserie en de software van de analyse, de onderliggende grondbeginselen, en de gegevens verkregen is hetzelfde over de verschillende systemen. Hoewel momenteel beperkt tot analyse van tweedimensionale in vitro culturen, worden deze MEA-systemen verbeterd zodat in vivo netwerkactiviteit in plakjes van de hersenen. Hier, bieden wij een gedetailleerd protocol voor embryonale blootstelling en opname van neuronale netwerkactiviteiten en synchrony, samen met representatieve resultaten.

Inleiding

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, meestal aangeduid als Bisphenol-A of BPA, een anti-oxydant additief komt voor in een grote verscheidenheid van polycarbonaat en epoxy hars gebaseerd producten variërend van thermisch papier, cd's en veiligheidsmaterialen bewijs glas, aan de binnenkant coating van drank blikjes. Hoewel BPA is gekend als een endocriene ontregelen agent dat oestrogeen¹nabootst, studies over zijn nadelige effecten als gevolg van dagelijkse casual blootstelling aan BPA meestal uit gekomen in de afgelopen 10 tot 15 jaar. De gevolgen van zelfs lage niveaus van BPA blootstelling zijn diepgaandste in vroege developmental perioden, waaronder tijdens de embryogenese door blootstelling van moeders^2,3. In utero blootstelling van vrouwelijke embryo's aan hormoonontregelaars is ook gekoppeld aan verhoogde ziekte gevoeligheid van vaginale borst kanker^4,5. Dierlijke studies hebben aangetoond dat blootstelling aan BPA leidt tot atypische hersenstructuur en functionele afwijkingen tot uiting in gedrag⁶. Dientengevolge heeft het gebruik van BPA in baby zuigflessen door meest regelgevende agentschappen in Europa en Noord-Amerika, met inbegrip van de FDA is verboden. Om te voldoen aan regelgeving, hebben veel fabrikanten overgestapt naar 4, 4'-sulfonyldiphenol of Bisfenol-S (BPS). Gebaseerd op het feit dat de BPA en BPS zijn structuuranalogons daarvan en dat recente rapporten vergelijkbare potentie van BPS in oestrogene transcriptie^{7 toonden}, is het belangrijk om te bestuderen van de toxiciteit van deze samengestelde ten opzichte van BPA.

Hier beschrijven we een protocol om te testen van de effecten van BPA (en andere EDCs) op netwerken van neuronen met behulp van een gewervelde model, het kuiken embryo. In vitro culturen van neuronen synaptic contacten vormen en genereren van de actie potentieel (ook wel ' spikes ' genoemd). De blancobepalingen activiteit van deze culturen kan worden vastgelegd met behulp van meerdere elektrodenserie (MEA) systemen. Spikes worden beschouwd als in synchronie wanneer zij binnen 5 ms voor elkaar plaatsvinden. Eerste willekeurige blancobepalingen activiteit die uiteindelijk worden gesynchroniseerd, is een belangrijk kenmerk van de ontwikkeling van de neuronale netwerken^8,9. Synchrony kan worden gemeten met behulp van verschillende methoden en verschillende algoritmen worden beschreven in de literatuur^9,10,11. In onze analyses gebruiken we een algoritme ontwikkeld door Paiva en collega's¹² die is geïntegreerd in de opname-software die de MEA-acquisitiesysteem drijft. De robuuste blancobepalingen activiteit van embryonale chick neuronen biedt een prototype voor de studie van het effect van BPA op neuraal netwerk activiteit¹³. Het gebruik van meerdere elektrode arrays record blancobepalingen activiteit, vastgesteld we hebben dat BPA blootstelling de ontwikkeling van neuronale blancobepalingen synchrony^{9,14 remt}. Wij bieden hier een gedetailleerde methodologie voor het bestuderen van BPA blootstelling op kuiken embryo neuronen in cultuur samen met representatieve resultaten op de ontwikkeling van neuronale blancobepalingen synchrony in chick embryonale culturen.

Protocol

Het protocol hieronder is gestandaardiseerd om te testen van de effecten van BPA blootstelling tijdens de embryogenese (begin), en kan worden aangepast voor gebruik met BPS, BPF of andere EDC in chick embryonale neuronen.

Dit protocol volgt het institutionele beleid van Delaware State University en het beleid van NIH voor aviaire embryo's. Het protocol is ook bevestiging met DSU van materiaal en chemische veiligheidsrichtlijnen.

1. materiële Setup

1. BPA (m.w. 228.29) in 10% ethanol (v/v) opgelost in water om een stamoplossing van 1 mM (0,23 mg per mL 10% ethanol). Maak opeenvolgende verdunningen (0.1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM en 10 µM) in neurobasal medium.
   Let op: BPA is een ecologische toxine en moet voorzichtigheid worden betracht bij de behandeling van het poeder.
2. Incubeer chick eieren in een broedstoof verkrijgbare tafelblad ei bij 37 ° C. Incubeer eieren gedurende 7 dagen voor embryo's de E7.
3. Bereiden tijdseenheid Sterilize het vereiste aantal multilaterale milieuovereenkomsten door onderdompelen in 70% ethanol voor 3 tot 4 h en spoel na drie keer in ongeveer 10 mL steriel gedistilleerd water in de kap van de BSLII.
   Opmerking: De multilaterale milieu-akkoorden bevatten 64 nanoporeuze platina-elektroden, gerangschikt in een 8 x 8 raster. De diameter van de elektrode is 30 µm en de afstand tussen de elektroden is 200 µm. Gebruik geen gedenatureerde ethanol voor het steriliseren van de multilaterale milieu-akkoorden, omdat dit tot corrosie van de MEA leiden zal.
4. Plaats de multilaterale milieuovereenkomsten binnen een steriele container met deksel (om steriele omstandigheden) en naar een tafelblad incubator. Bak gedurende ten minste 6 uur bij 55 ° C. Deze stap is essentieel voor goede sterilisatie en de temperatuur mag niet hoger zijn dan 60 ° C. Handhaving van de steriliteit, verplaatsen de schotel met multilaterale milieuovereenkomsten aan de kap van de BSLII voor opslag tot verder gebruik.
   Opmerking: We gebruiken een oven veilige glazen ovenschaal met plastic deksel en oppervlak het steriliseren met 70% ethanol en plaats in de kap van de BSLII voor het drogen.
5. Aliquot de extra-cellulaire matrix ECM-oplossing. De flacon bij 4 ° C's nachts ontdooien en bevriezen van 100 µL aliquots bij-20 ° C.
   Opmerking: De ECM is bevroren verzonden. ECM moet niet worden gebracht op kamertemperatuur totdat u jas en het polymerizes bij kamertemperatuur, zodra de polymeervorm, het is onmogelijk om de vacht. ECM zonder groeifactoren heeft de voorkeur om te voorkomen dat aanvullende effecten als gevolg van onbekende factoren.
6. Steriliseren van alle instrumenten van de dissectie (Dumont #5 pincet gebogen pincet, kleine schaar en voorjaar schaar) en zelfsluitende materiaal bekleed dissectie gerechten met 70% ethanol en laat ze drogen in de dissectie kap.

2. chick embryonale Neuron cultuur en netwerkactiviteit

1. Op de dag van de beplating, het verwijderen van een flesje voor ECM uit de diepvries van-20 ° C, spuiten met 70% ethanol en plaats op ijs. Vul aan tot 25% door het toevoegen van 300 µL koude neurobasal medium binnen BSLII kap.
2. Met behulp van een P200 pipetteman Voeg 100 µL van 25% ECM naar het midden van de MEA verzorgen niet te raken van de elektroden en verwijderen onmiddellijk het verlaten van een dunne film op het oppervlak. Bedek de MEA en plaats in de CO₂ incubator (37 ° C en 5% CO₂) tot klaar om de plaat van de neuronen.
3. Het steriliseren van de buitenste schil van een E7-ei (embryonale dag 7, gedurende 7 dagen bij 37 ° C geïncubeerd) met 70% ethanol. Decapitate het embryo in een Sylgard bodem dissectie schotel met koude steriele Henks evenwichtig zouten oplossing (HBSS) zonder calcium. Snij rond de ogen en verwijder de oogbollen. Met behulp van DuMont #5 fijne pincet en voorjaar schaar een insnijding aan de ventrale zijde maken en verwijderen van de buitenste lagen van de huid aan de reukkolf en optische tectum bloot. Schil en zorgvuldig verwijderen van het pial membraan. Breng de reukkolf in een ander petrischaal en snijd deze in kleine stukjes van ongeveer 2 mm met lente schaar.
   Opmerking: Er mag niet alle bloedvaten aangesloten op de reukkolf na verwijdering van het pial membraan. Indien beschikbaar, is het beter om het uitvoeren van de dissectie in een steriele dissectie kap, hoewel we redelijk goede resultaten hebben behaald wanneer dissectie wordt uitgevoerd buiten een kap, zolang de instrumenten en de dissectie gebied zijn grondig gesteriliseerd met 70% ethanol .
4. Met behulp van een steriele overdracht precisiepipet, verzamelen de stukjes reukkolf in een centrifugebuis 15 mL en Verwijder zo veel van de HBSS mogelijk na te laten de stukken van reukkolf zinken naar de bodem van de centrifugebuis.
5. Voeg vervolgens 1 mL van 0,05% trypsine/EDTA (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
6. Met behulp van een pipet van Pasteur, verwijder voorzichtig trypsine zonder verstoring van de stukjes weefsel en het toevoegen van 1 mL neurobasal medium. Laat de stukjes weefsel zinken naar de bodem en verwijder het medium. Deze wassing nogmaals herhalen. Deze stap is het wassen van de trypsine/EDTA.
7. Voeg toe 2 mL van neurobasal medium en start triturating. Verpulvering omvat het nemen van een steriele brand-gepolijst Pasteur pipet en passeren van het weefsel door het meerdere malen zachtjes totdat er geen meer stukken van weefsel worden gezien. Als alle stukken na herhaalde passen blijven, laat hen te vestigen aan de onderkant.
   Opmerking: Vermijd schuimvorming tijdens het triturating - als schuim vormen, stoppen en door aspiratie verwijderen.
8. Verdun het opnieuw gesuspendeerde cellen 1:10 met neurobasal medium en tellen van levensvatbare cellen met behulp van Trypan blauwe kleurstof en een hemocytometer. Mix-50 µL van de verdunde cellen met 50 µL van Trypan Blue oplossing in een centrifugebuis 0,5 mL. 10 µL toevoegen aan de hemacytometer na het plaatsen op het dekglaasje aan en Tel de heldere cellen wissen (blauwe cellen zijn dood en moeten niet worden meegeteld).
   Opmerking: Typische cel nummers uit één E7 optic tectum bereik tussen 1 en 5 x 10,⁷ cellen/mL.
9. Plaat de gedissocieerde cellen op ECM MEAs bekleed bij een dichtheid van 2.200 cellen/plein mm. Voor onze MEA systeem vertaalt dit aan ongeveer 130.000 cellen per MEA. Toevoegen neurobasal medium om het volume in de MEA tot 1 mL en plaats van multilaterale milieu-akkoorden in de incubator CO₂ 's nachts voor cel gehechtheid en neurite extensie (Figuur 1).
   Opmerking: Voor de multilaterale milieu-akkoorden van verschillende gebieden en elektrode cijfers, andere cel dichtheden kunnen worden geprobeerd - in het algemeen, hoger celdichtheid resulteert in een groter netwerkactiviteit, maar ook leidt tot kortere woonde culturen.
10. De volgende dag, BPA aan een eindconcentratie van 10 µM in neurobasal medium uit de voorraad van de 1 mM in stap 1.1 aangebracht in de behandelde MEA toevoegen. Toevoegen aan het besturingselement MEA, hetzelfde volume van de 10% ethanol in water (v/v) oplossing.
11. Vervangen besteed medium met neurobasal medium dat 10 µM BPA om de andere dag tot 7 dagen in vitro (7DIV) en elke dag daarna, als de verhogingen van de netwerk-activiteit.
    Opmerking: Aangezien de netwerkactiviteit stijgt, verhoogt de metabole activiteit en media wijzigingen moeten vaker. Laat niet het medium oranje.

3. opname van neuronale netwerkactiviteit

1. Op de dag van overname, het kweekmedium met verse neurobasal medium uit te wisselen en de MEAs terug naar de CO₂ -incubator voor een minimum van 2 uur voordat u gaat opnemen. Start de opnamesoftware en stel de temperatuur van de MEA op 37 ° C door te klikken op het pictogram van de temperatuur (aanvullende figuur 3.1a-b).
   Opmerking: Opname kan beginnen zo vroeg als dag 3 van plating en kan blijven zolang de culturen leven zijn.
2. De overname parameters instellen door met de rechtermuisknop op het pictogram "Muse" (onder Streams in het linker venster deelvenster) en selecteer "Add verwerking" en "Spike-Detector" en klik op OK in het pop-upvenster. "Spike Detector (6 x STD)" worden weergegeven onder de bestandsnaam (aanvullende figuur 3.2a-b).
3. Klik met de rechtermuisknop op de Spike-Detector, selecteer vervolgens "Toevoegen verwerking" en "Barsten Detector" en klik op OK in het pop-upvenster. "Barsten Detector" (ISI) verschijnt onder het pictogram van de muze (aanvullende figuur 3.3a-b).
4. Volgende klik met de rechtermuisknop op barsten Detector, selecteert u "Toevoegen verwerking" en "Neurale statistieken Compiler." Controleer of bestands-Header, goed statistieken samengevoegd en Synchrony zijn geselecteerd in het pop omhooggaande venster. Klik op OK. "Statistieken Compiler" verschijnt hieronder (aanvullende figuur 3.4a-b).
   Opmerking: Dit zal het adaptieve drempel overschrijden (6 x STD filter), het interval van de tussen piek bij 100 ms met een minimum aantal spikes op 5, het gemiddelde tarief detectie op 10 bakken instellen s met een parameter synchrony bij 20 ms, en het minimale spike tempo 0.083333 spikes per min.
5. De geplande opname voor de opnametijd van 5 minuten (300.000 ms) instellen door te klikken op het pictogram van de klok aan de onderkant. Dit wordt bereikt door het veranderen van de informatie in de sectie van de instelling tot elke 5.1 minuten opnemen en registreert voor 5 minuten. Dit zal onmiddellijk worden gestart en één keer zal worden uitgevoerd (aanvullende figuur 3.5).
6. Zorg ervoor dat de temperatuur van de MEA 37 ° C heeft bereikt alvorens de MEA. De MEA verwijderen uit de incubator, plaatst u deze op de opnameeenheid en de MEA vergrendelen. Start de opname van de netwerkactiviteit door te klikken op de start-record in de sectie geplande opname of het verslagpictogram in het "Bestand afspelen" venster. Een opnametijd van 5 minuten (300.000 ms) is gewoonlijk voldoende, alhoewel langer opnames van maximaal 10 minuten kunnen worden verkregen.
7. Na de opname door de MEA te terugkomen in de incubator.
   Opmerking: Zorg moet worden genomen om de steriliteit en om de tijd die de MEA buiten de incubator is te minimaliseren.

4. de gegevensanalyse

1. Analyse van de ruwe gegevens mogelijk off line met behulp van de opname-software. Klik op het bestand pull-down menu en open opname. Selecteer het bestand van de ruwe gegevens te analyseren. Replay de raw opnames te vangen het vereiste blancobepalingen parameters.
2. De Spike-Detector-module gebruiken voor het verkrijgen van het gemiddelde aantal van Spikes, en voor het verkrijgen van Synchrony Index, de neurale statistieken Compiler-module gebruiken.
3. De Spike-Detector, Burst Detector en statistieken Compiler Modules als vóór (sectie 3) geladen.
4. De pull-down menu's binnen de Spike-Detector Detector barsten en de statistieken Compiler modulevensters, selecteer Spike lijst, de netwerklijst barsten en geavanceerde statistieken, respectievelijk.
5. Klik op de record-knop om te beginnen het gegevensbestand die tot een CSV-bestand in de gestuurde map leiden zal opnemen. De spike parameters - het totale aantal spikes en de Synchrony Index - zal worden opgenomen in het CSV-bestand.
   Opmerking: real-time analyse tijdens het opnemen van onbewerkte gegevens wordt niet aanbevolen omdat dit zou kunnen processortijd en computationele middelen verbruiken.

Resultaten

We hebben onderzocht het effect van BPA op synchrony ontwikkeling in chick embryo neuronale culturen. Synchronisatie van stekelige activiteit is een indicator van de normale ontwikkeling van neuronale netwerken in vitro. Wanneer twee pieken binnen 5 ms van elkaar plaatsvinden, ze worden beschouwd als synchrone. In vitro neuronale culturen weergeven in eerste instantie willekeurige blancobepalingen activiteit — spikes optreden willekeurig en de intervallen tussen spike tonen een normaalverdeling. Naarmate de culturen rijpen, de blancobepalingen activiteit meer wordt gesynchroniseerd en de intervallen tussen spike zijn constant. Synchrone blancobepalingen activiteit van een cultuur was quantitated door cross-correlatie analyse van de Prikker tijden met opname software¹² voor het afleiden van een Synchrony Index (SI). We vonden dat BPA blootstelling beïnvloedt in negatieve zin de ontwikkeling van de activiteiten van het netwerk verminderen blancobepalingen activiteit en de synchrony index (Figuur 2een en 2b). Kortom, hebben we aangetoond dat de nadelige effecten van BPA blootstelling op een embryo van invloed op de ontwikkeling ervan, met inbegrip van neuronale functie die kan worden beoordeeld door synchrony ontwikkeling in chick neuronen in cultuur.

Figuur 1: Van het protocol van de stappen van de dissectie van chick reukkolf dissociatie, plating, en opname van de netwerkactiviteit schematische. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: (A) het gemiddelde aantal spikes is beduidend lager in BPA behandeld E7 chick reukkolf culturen in vergelijking met de controleculturen. Het gemiddelde aantal spikes is geëxtraheerd met behulp van de opname-software. De middelen (control, 14,890 ± 949.0, N = 15 en BPA, 5,624 ± 465.9, N = 22) aanzienlijk verschilden (ongepaarde t-test, p < 0.0001). (B) de gemiddelde synchrony index (SI) is beduidend lager in BPA behandeld E7 chick reukkolf culturen in vergelijking met de controleculturen. De SI is geëxtraheerd met behulp van de neurale statistieken Compiler module binnen de opnamesoftware. De SI-middelen (control, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 en BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) aanzienlijk verschilden (ongepaarde t-test, p < 0.0001). Foutbalken verbeelden standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Fasen van snelle groei en ontwikkeling zoals embryogenese zijn bijzonder kwetsbaar zijn voor de nadelige gevolgen van verschillende hormoonontregelende stoffen met inbegrip van BPA. Wij bieden gedetailleerde protocollen voor het bestuderen van de effecten van BPA blootstelling in een in vitro gewervelde neuronale netwerkmodel. Met behulp van dit protocol, vastgesteld we dat BPA het tarief van de spike evenals de synchrony index in de ontwikkelingslanden neuronale netwerken (Figuur 2a-b verlaagt).

Onze methodologie is ontworpen om te studeren BPA blootstelling tijdens de vroege embryogenese en kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van de effecten van andere EDCs. Embryonale neuronale culturen van het kuiken zijn relatief eenvoudig om vast te stellen ten opzichte van andere gewervelde modellen, met inbegrip van de rat of muis. Bovendien, er is geen vereiste voor een dierlijke logeerkamer — een eenvoudige incubator op een bankje laboratorium is voldoende voor het uitvoeren van deze tests. We beschrijven het gebruik van een systeem met meerdere elektrode (MEA) voor de beoordeling van het effect van de EDG, BPA, op netwerkactiviteit. De hier beschreven protocollen kunnen worden toegepast op andere systemen. Een kritisch aspect van dit protocol is handhaving van de steriliteit. Dit omvat van het embryo onder steriele condities dissectie — steriliseren van instrumenten met 70% ethanol en het gebruik van steriele Henks evenwichtig zouten oplossing is voldoende. Naarmate de gegevens worden verzameld over een periode van weken, is het van cruciaal belang voor het handhaven van de steriele behandeling van de multilaterale milieu-akkoorden. De neuronale culturen zodra die opgericht kunnen worden gekweekt op lange termijn - tot drie maanden — en zijn dus nuttig voor de studie van langdurige blootstelling aan EDCs en andere verbindingen over neuronale netwerken. Een ander belangrijk aspect van dit protocol is de tijd tussen dissectie beplating. De optimale tijd is 30 min, met inbegrip van de incubatie van het weefsel met trypsine. Hoe langer de tijd genomen, hoe armer het voortbestaan van de cellen.

Hier beschrijven we een basisprotocol die kan worden toegepast voor de beoordeling van de chemische stof of geneesmiddel dat is van invloed op gedrag en neurale functie. Hier hebben we gebruik gemaakt van een celdichtheid van 2.200 cellen per mm²; echter, dit kan worden gewijzigd en andere cel dichtheid kunnen worden gebruikt. In het algemeen, hebben we gevonden dat celdichtheid netwerkactiviteit - meer pieken in een kortere tijd verhoogt. De methode heeft beschreven, hoewel zeer nuttig in de beoordeling van de effecten van chemicaliën op netwerkactiviteit beperkingen. Een van de grootste beperkingen van de methode is dat deze in vitro culturen zijn twee dimensionale kan niet overeen met de drie-dimensionale architectuur van de gewervelde hersenen. Dit kan worden overwonnen met behulp van segment opnames. Een ander alternatief is de behandelingen toepassen op het kuiken zich ontwikkelende embryo door betekent voor een klein venster knippen op het brede uiteinde van de ei-¹⁵, ontleden de hersenen aan het einde van het behandelingsschema, dik secties op een vibratome maken en plaatsen op de MEA voor de activiteit van de netwerken van de opname.

Ons protocol is belangrijk dat het onderzoek naar het effect van EDCs op de ontwikkeling van de netwerkactiviteit maakt en de verkenning van een mechanistische basis voor de effecten van deze chemicaliën biedt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#5 foreceps	Fine Science Tools	11251-10
Axion Muse MEA	Axion Biosystems	M64-GL1-30Pt200	Wordt MEA-systeem genoemd in manuscript
Axis Software	Axion Biosystems		Wordt opnamesoftware genoemd in het manuscript
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
curved forceps	Fine Science Tools	11272-50
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
Fertilized chicken eggs	van elke lokale boerderij of Spafas
HBSS	Fisher	14170112
Hemacytometer	Fisher	02-671-6
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356231	Wordt Extra Cellulaire Matrix (ECM) genoemd in het manuscript
Neurobasal medium	BrainBits	Nb4-500
Neuroexplorer statistische software	Nex Technologies	Neuroexplorer versie 5
Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20A
spring scissors	Fine Science Tools	15514-12
Sylgard bottom dissection dishes	Living Systems Instrumentaion	DD-90-S-BLK-3PK
Trypan Blue kleurstof	Fisher	15-250-061
Trypsin-EDTA	Fisher	15400054