Methodenartikel

Hoornvlies weefselengineering: Een In Vitro Model van de interacties die stromale-zenuwen van het hoornvlies, menselijke

DOI:

10.3791/56308

⸱

24 januari 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een nieuwe driedimensionale in vitro model, waar hoornvlies stromale cellen en gedifferentieerde neuronale cellen samen worden gekweekt om te helpen bij het onderzoek en het begrijpen van de interacties van de twee celtypes.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselengineering heeft opgedaan grote erkenning vanwege de grote vraag voor menselijke hoornvlies vervangingen met naar schatting 10 miljoen mensen wereldwijd lijden aan hoornvlies visie verlies1. Om de vraag naar haalbare menselijke hoornvlies, aanzienlijke vooruitgang in driedimensionale (3D) weefsel engineering geboekt2,3,4. Deze hoornvlies modellen variëren van eenvoudige enkelgelaagde systemen met meerdere lagen modellen, wat leidt tot 3D full-dikte hoornvlies equivalenten2.

Echter, het gebruik van een 3D weefsel-engineered hoornvlies in het kader van de in vitro ziekte modellen studeerde tot datum ontbreekt gelijkenis met de meerdere lagen 3D hoornvlies weefsel structuur, functie en de netwerken van verschillende celtypes (d.w.z., zenuw, epitheel, stroma en endotheel)2,3. Daarnaast is de vraag naar in vitro hoornvlies weefsel modellen gestegen in een poging om het verminderen van dierproeven voor farmaceutische producten. Dus, meer verfijnde modellen zijn moeten beter aansluiten bij systemen aan menselijke fysiologische eisen, en de ontwikkeling van een model die meer relevant is voor de populatie is absoluut noodzakelijk. Gezien het feit dat meerdere celtypen in de cornea worden beïnvloed door ziekten en dystrophie, zoals Keratoconus, diabetische Keratopathy en Fuchs, bevat dit model een 3D co cultuur model van primaire menselijke hoornvlies fibroblasten (HCFs) van gezonde donoren en neuronen van de SH-SY5Y cellijn. Hierdoor kunnen we voor het eerst te onderzoeken van de interacties tussen de twee celtypes binnen de menselijke hoornvlies weefsel. Wij zijn van mening dat dit model kan potentieel het ontleden van de onderliggende mechanismen die zijn gekoppeld aan de stromale-zenuw interacties van hoornvlies ziekten die zenuw schade vertonen. Deze 3D-model komt overeen met de fundamentele anatomische en fysiologische aard van het hoornvlies weefsel in vivo en in de toekomst als een instrument kan worden gebruikt voor hoornvlies gebreken onderzoeken, alsmede het screenen van de werkzaamheid van verschillende agenten voor dierproeven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het menselijk lichaam is het hoornvlies het meest dichtbevolkte bezenuwde weefsel. De zenuwen zijn verantwoordelijk voor verschillende sensaties zoals touch, pijn, temperatuur, en hebben ook een essentiële rol bij wondheling, knipperen reflexen, scheuren voor productie en afscheiding5,6,7. In het hoornvlies, stromale zenuw trunks voortvloeien uit de limbal plexus en voer de perifere hoornvlies stroma radiaal. De organisatie stromale zenuw is parallel aan de lamellen collageen en ze verder tak in kleinere werken als ze gaan naar de oppervlakkige stroma5,8. De zenuwvezels verder doordringen de epitheliale laag en dus innervatie arm grote schaal is verspreid over het hoornvlies epitheel en stroma. Innervatie arm heeft dus een essentiële rol in de gezonde en zieke toestand van het hoornvlies. We onthullen in dit protocol, de bevordering van een nieuwe 3D in vitro model, dat is de eerste van zijn soort na te bootsen de in vivo stromale-zenuw interacties. De SH-SY5Y-cellijn werd gebruikt voor deze studie, want het is een van de meest gevestigde, goed gekarakteriseerd lijnen gebruikt bij het bestuderen van de neuronale groei. De SH-SY5Y-cellijn is beschreven voor de productie van beide substraat aanhanger (S-type) en neuroblastic (N-type) cellen die transdifferentiatie9kan ondergaan. Dientengevolge, hoewel deze cellijn is afgeleid van een drievoudige opeenvolgende subclone selectie van N-type cellen, bevat het ook een klein aantal S-type cellen staat voor het ondergaan van differentiatie in neuronen met behulp van retinoic acid en hersenen-afgeleide neurotrophic factor9. Dit biedt een tool die tot een beter begrip van de cornea complicaties geassocieerd met diabetische retinopathie (DM) en andere oogbeschadigingen en/of ziekten leiden kan. Als gevolg van de moeilijkheden in verband met het verkrijgen en het kweken van neuronen van patiënten met oogbeschadigingen en/of ziekte, biedt dit model 3D in vitro aanzienlijke gevolgen voor de in de studie van de neuronale interacties en signalering met het hoornvlies stroma.

Zieke voorwaarden beïnvloeden vaak verschillende weefsels van het lichaam op zeer grote schaal, wat leidt tot een gecompromitteerde kwaliteit van leven. Oogbeschadigingen en/of dystrophie zijn algemene complicaties vaak geassocieerd met systemische ziekten en leiden tot verlies van de gezichtsscherpte of zelfs permanente visie. Uitgebreide studies zijn vaak essentieel voor een beter begrip van de toestand van de ziekte, alsmede de effecten op de basale cellulair niveau. Om te bestuderen van de effecten van deze ziekten, zijn verschillende in vivo en in vitro modellen ontwikkeld met de hulp van weefsel technische toepassingen. Hoornvlies weefsel waterbouwkundige toepassingen hebt opgeslaen belangstelling op verschillende gebieden van wetenschap10,11,12,13,14, maar er zijn nog steeds grote beperkingen tijdens concrete toepassing, met inbegrip van hoornvlies graft afwijzingen, infecties en littekens10,11,12,13,14. Er zijn verscheidene studies die hebt ontwikkeld en vastgesteld verschillende in vitro modellen3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. De 3D in vitro -modellen zijn de meest veelbelovende en van wetenschappelijke belangstelling. 3D-modellen staan bekend om beter spiegel de in vivo cellulaire en fysiologische gebeurtenissen die zijn kritische tijdens fibrose en wond genezing15,27,-28,29. Deze modellen in vitro spelen een integrale rol in het vinden van nieuwe therapeutische benaderingen voor de behandeling van verschillende ziekten met inbegrip van hoornvlies complicaties. Ondanks de kritische rol van innervatie arm in hoornvlies functies, weinig inspanning geboekt ter bevordering van de verspreiding van de perifere zenuw binnen hoornvlies weefsel-engineered constructies2,3. Echter, de voorgestelde 3D in vitro cel constructies nabootsen het doelweefsel teneinde te bereiken van de gewenste weefsel functionaliteit.

Diabetische keratopathy weliswaar een duidelijk verzoek om het model als gevolg van de neuronale gebreken die hier worden beschreven, zijn er verschillende andere hoornvlies ziekten die van een menselijke in vitro model profiteren kunnen, met inbegrip van Keratoconus en Fuchs dystrophie. Onze 3D-model komt naar voren uit dit perspectief en stelt voor de ontwikkeling van een in vitro -vertegenwoordiging van hoornvlies weefsel te beoordelen van de drug delivery en de veiligheid van nieuwe oogbeschadigingen en/of medicijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtsnoeren van de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center/institutionele review board (IRB #4509). Alle onderdelen van het protocol ontmoette de leerstellingen van de verklaring van Helsinki. Hoornvlies monsters werden verkregen van de nationale ontwikkeling en onderzoek Instituut (NDRI) en de Oklahoma Lions Eye Bank.

1. isolatie van primaire cellen

  1. Na ontvangst van de menselijke hoornvlies weefselsteekproeven, breng de weefsels in een 21.5 cm2 petrischaal met 2 mL steriele Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (1 x).
  2. Schrapen en positionering van het hoornvlies koepel gezicht-omhoog verwijderen het hoornvlies epithelium. Om ervoor te zorgen volledige verwijdering, schraap de epitheliale laag grondig met behulp van een scheermesje in een hoek van 45°. Vervolgens Tik het hoornvlies koepel face down en grondig Schraap het endotheel van het stroma met een scheermesje in een hoek van 45° te zorgen voor volledige verwijdering. Wassen het stromale weefsel met DPBS.
  3. Snijd de stromale weefsels in kleine stukjes, met behulp van een nummer 10 chirurgische mes, houden de stromale stukken NAT op aller tijden, met behulp van DPBS. Pick-up stromale stukken met steriel pincet en plaats in een maatkolf van T25 cultuur zonder media (4 of 5 stukken van 2 x 2 mm weefsel per fles).
  4. Laat de explantaten vast te houden aan de onderkant van de kolf bij 37 ° C gedurende ongeveer 30-40 min. Zodra nageleefd, Voeg langzaam Eagle's minimale essentiële medium (EMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% antibioticum/Antimycotic aan de maatkolf zonder verstoring van de explantaten.
  5. Plaats de erlenmeyer voorzichtig in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2. De explantaten ongestoord te verlaten totdat de cellen isoleren beginnen en migreren in de kolf. Na ongeveer 2-4 weken, moeten cellen samenvloeiing van 100% bereiken. Op 100% de samenvloeiing, passage van de cellen door het verwijderen van de media van weefselkweek en wassen van de cellen met DPBS.
  6. Trypsine aan de cellen toevoegen en hen vervolgens Incubeer bij 37° C. Na ongeveer 5 min, bekijken de cellen onder de lichte microscopie van om te bevestigen dat zij hebben losgekoppeld en vervolgens de proteolyse stop te zetten door het toevoegen van nieuwe media.
  7. De celsuspensie Breng in een conische tube van 15 mL voor centrifugeren op 1.000 x g. Verwijder het supernatant zorgvuldig zonder de pellet te verstoren en het opschorten van de cellen in verse EMEM 10% FBS 1% antibiotica. Cellen tellen en zaad van ongeveer 1 x 106 cellen in T75 cultuur kolf voor verdere expansie met verse EMEM 1% FBS 1% antibiotica.

2. primaire HCFs cultuur en 3D constructies vergadering

  1. Te monteren 3D constructies van explants eerder geteeld in EMEM 10% FBS 1% antibioticum/Antimycotic, passage en graaf HCFs.
  2. Zaad van ongeveer 1 x 106 cellen per putje van primaire HCFs op polycarbonaat membraan inzetstukken met 0.4-µm poriën van de 3D constructies, samen met 1,5 mL verse EMEM 10% FBS 1% antibioticum/Antimycotic naar de top van de constructie. Voeg een ander 1,5 mL van dezelfde media naar de onderkant van elke constructie.
  3. Na 24u van cel zaaien, cultuur de cellen met de EMEM 10% FBS 1% antibioticum/Antimycotic, gestimuleerd met 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic zuur (vitamine C) door toe te voegen 1,5 mL bovenop en 1,5 mL op de bodem van elke constructie.
  4. Handhaven van de culturen in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 voor 3 weken en leveren verse media elke andere dag gedurende de hele studieperiode. Geen verdere doorgang is nodig.

3. cel differentiatie en co culturen

  1. Voeg na 3 weken, 8 x 103 cellen per putje van SH-SY5Y menselijke neuroblastoma cellen op de bovenkant van de eerder geassembleerde 3D construeert met 1,5 mL van de EMEM met 10% FBS, 1% antibioticum/Antimycotic en 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic zuur (vitamine C).
    1. De SH-SY5Y neuroblastoom cellen om te groeien op de top van het hoornvlies stromale cellen gedurende ten minste 24 uur voordat de celdifferentiatie toestaan.
  2. SH-SY5Y celdifferentiatie starten door het stimuleren van de cellen met EMEM met 1% FBS en 1,5 mL van 10 µM retinoïnezuur bovenop de constructie. Voeg 1,5 mL van de EMEM 10% FBS 1% antibioticum/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic zuur (vitamine C) naar de onderkant van de constructie. Merk op dat de retinoïnezuur stap moet worden uitgevoerd in het donker.
    1. Blijven de cellen in deze differentiatie media cultuur voor 5 dagen.
  3. Wanneer de cellen de differentiatie fase bereiken, schakelen de cellen aan 1,5 mL serum-vrije media met 2 nM van hersenen-afgeleide neurotrophic factor (BDNF) en 1% antibioticum/Antimycotic toegevoegd aan de EMEM, door toe te voegen aan de bovenkant van de constructie. Voeg 1,5 mL van de EMEM 10% FBS 1% antibioticum/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic zuur (vitamine C) naar de onderkant van de constructie. Merk op dat de stap van BDNF in het donker moet worden uitgevoerd.
  4. Cultuur van de cellen voor 2 extra dagen vóór de verwerking voor elke verdere analyse zoals aangegeven in tabel 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 is een stapsgewijze representatief beeld van het werkmodel 3D in vitro . Bij de eerste stap zijn cellen geïsoleerd van menselijke hoornvlies. Vervolgens zijn ze gegroeid op een membraan van polycarbonaat en gestimuleerd met vitamine C te monteren een zelfstandige secreted 3D matrix. Dit 3D construct systeem induceert de synthese van een meerdere lagen cellulaire in vivo-zoals stromale matrix. Daarna worden neuroblastoom cellen overg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende studies hebben gericht geweest op de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen die kunnen helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van hoornvlies ziekten, alsook Ontdek behandelingen. Een belangrijke waarde voor de mens uit deze studies is echter niet geverifieerd. Tot op heden, zijn verschillende in vitro modellen ontwikkeld en grote schaal onderzocht vanwege hun opmerkelijke klinische betekenis. Onze eerder vastgestelde 3D in vitro model is een nieuw systeem die aanzienlij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen uit te breiden onze oprechte dank aan Dr. Ben Fowler voor zijn technische hulp bij de TEM-experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Healthy corneal tissueNDRISamples from donors with no ocular trauma or systemic disease
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X)Gibco by Life Technologies14190-144
Sterile forcepsFischer Scientific13-812-42Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps
Single edge razor bladesPersonna270100
Sterile surgical scalpel blades No.10Feather Surgical Blade2976#10
Eagle’s Minimum Essential MediumATCC30-2003
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS1155010% FBS is required for media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco by Life Technologies15240-0621% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation
0.05% Trypsin EDTA(1X)Gibco by Life Technologies25300062
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm poresCorning Costar3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C)Sigma-AldrichSMB00390-14A concentration of 0.5 mM should be used for the study
Wax blockVWR50-949-027
SH-SY5Y Neuroblastoma cellsATCCSHSY5YATCC CRL-2266
Retinoic AcidSigma-AldrichSRP3014-10UGFinal concentration of 10uM needs to be used
BDNFSigma-AldrichR2625-100MGFinal concentration of 2nM needs to be used
Dimethyl Sulfoxide(DMSO)VWR-Alfa Aesar67-68-5Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)Fisher Scientific12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)Fisher Scientific12-565-349

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  3. Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
  4. Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
  5. Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
  6. Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
  7. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  8. Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
  9. Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
  10. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
  11. Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
  12. Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
  13. Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
  14. Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
  15. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  16. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
  17. Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845(2016).
  18. Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
  19. Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
  20. Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
  21. Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395(2016).
  22. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  23. Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
  24. Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
  25. Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
  26. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
  27. Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
  28. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
  29. Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
  30. Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Humane corneale fibroblastenSH SY5Y cellijn3D cocultuurmodelsecretie van extracellulaire matrixtransmissie elektronenmicroscopieceldifferentiatieprotocolvitamine C supplementatiebehandeling met retino nezuur

Gerelateerde artikelen