Methodenartikel

Hoornvlies weefselengineering: Een In Vitro Model van de interacties die stromale-zenuwen van het hoornvlies, menselijke

DOI:

10.3791/56308

⸱

24 januari 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een nieuwe driedimensionale in vitro model, waar hoornvlies stromale cellen en gedifferentieerde neuronale cellen samen worden gekweekt om te helpen bij het onderzoek en het begrijpen van de interacties van de twee celtypes.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselengineering heeft opgedaan grote erkenning vanwege de grote vraag voor menselijke hoornvlies vervangingen met naar schatting 10 miljoen mensen wereldwijd lijden aan hoornvlies visie verlies1. Om de vraag naar haalbare menselijke hoornvlies, aanzienlijke vooruitgang in driedimensionale (3D) weefsel engineering geboekt2,3,4. Deze hoornvlies modellen variëren van eenvoudige enkelgelaagde systemen met meerdere lagen modellen, wat leidt tot 3D full-dikte hoornvlies equivalenten2.

Echter, het gebruik van een 3D weefsel-engineered hoornvlies in het kader van de in vitro ziekte modellen studeerde tot datum ontbreekt gelijkenis met de meerdere lagen 3D hoornvlies weefsel structuur, functie en de netwerken van verschillende celtypes (d.w.z., zenuw, epitheel, stroma en endotheel)2,3. Daarnaast is de vraag naar in vitro hoornvlies weefsel modellen gestegen in een poging om het verminderen van dierproeven voor farmaceutische producten. Dus, meer verfijnde modellen zijn moeten beter aansluiten bij systemen aan menselijke fysiologische eisen, en de ontwikkeling van een model die meer relevant is voor de populatie is absoluut noodzakelijk. Gezien het feit dat meerdere celtypen in de cornea worden beïnvloed door ziekten en dystrophie, zoals Keratoconus, diabetische Keratopathy en Fuchs, bevat dit model een 3D co cultuur model van primaire menselijke hoornvlies fibroblasten (HCFs) van gezonde donoren en neuronen van de SH-SY5Y cellijn. Hierdoor kunnen we voor het eerst te onderzoeken van de interacties tussen de twee celtypes binnen de menselijke hoornvlies weefsel. Wij zijn van mening dat dit model kan potentieel het ontleden van de onderliggende mechanismen die zijn gekoppeld aan de stromale-zenuw interacties van hoornvlies ziekten die zenuw schade vertonen. Deze 3D-model komt overeen met de fundamentele anatomische en fysiologische aard van het hoornvlies weefsel in vivo en in de toekomst als een instrument kan worden gebruikt voor hoornvlies gebreken onderzoeken, alsmede het screenen van de werkzaamheid van verschillende agenten voor dierproeven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het menselijk lichaam is het hoornvlies het meest dichtbevolkte bezenuwde weefsel. De zenuwen zijn verantwoordelijk voor verschillende sensaties zoals touch, pijn, temperatuur, en hebben ook een essentiële rol bij wondheling, knipperen reflexen, scheuren voor productie en afscheiding5,6,7. In het hoornvlies, stromale zenuw trunks voortvloeien uit de limbal plexus en voer de perifere hoornvlies stroma radiaal. De organisatie stromale zenuw is parallel aan de lamellen collageen en ze verder tak in kleinere werken als ze gaan naar de oppervlakkige stroma5

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtsnoeren van de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center/institutionele review board (IRB #4509). Alle onderdelen van het protocol ontmoette de leerstellingen van de verklaring van Helsinki. Hoornvlies monsters werden verkregen van de nationale ontwikkeling en onderzoek Instituut (NDRI) en de Oklahoma Lions Eye Bank.

1. isolatie van primaire cellen

  1. Na ontvangst van de menselijke hoornvlies weefselsteekproeven, breng de weefsels in een 21.5 cm2 petrischaal met 2 mL steriele Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (1 x).
  2. Schrapen en positionering van het hoornvlies ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 is een stapsgewijze representatief beeld van het werkmodel 3D in vitro . Bij de eerste stap zijn cellen geïsoleerd van menselijke hoornvlies. Vervolgens zijn ze gegroeid op een membraan van polycarbonaat en gestimuleerd met vitamine C te monteren een zelfstandige secreted 3D matrix. Dit 3D construct systeem induceert de synthese van een meerdere lagen cellulaire in vivo-zoals stromale matrix. Daarna worden neuroblastoom cellen overg.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende studies hebben gericht geweest op de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen die kunnen helpen bij het ontwikkelen van een beter begrip van hoornvlies ziekten, alsook Ontdek behandelingen. Een belangrijke waarde voor de mens uit deze studies is echter niet geverifieerd. Tot op heden, zijn verschillende in vitro modellen ontwikkeld en grote schaal onderzocht vanwege hun opmerkelijke klinische betekenis. Onze eerder vastgestelde 3D in vitro model is een nieuw systeem die aanzienlij.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen uit te breiden onze oprechte dank aan Dr. Ben Fowler voor zijn technische hulp bij de TEM-experimenten.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Healthy corneal tissueNDRISamples from donors with no ocular trauma or systemic disease
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X)Gibco by Life Technologies14190-144
Sterile forcepsFischer Scientific13-812-42Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps
Single edge razor bladesPersonna270100
Sterile surgical scalpel blades No.10Feather Surgical Blade2976#10
Eagle’s Minimum Essential MediumATCC30-2003
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS1155010% FBS is required for media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco by Life Technologies15240-0621% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation
0.05% Trypsin EDTA(1X)Gibco by Life Technologies25300062
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm poresCorning Costar3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C)Sigma-AldrichSMB00390-14A concentration of 0.5 mM should be used for the study
Wax blockVWR50-949-027
SH-SY5Y Neuroblastoma cellsATCCSHSY5YATCC CRL-2266
Retinoic AcidSigma-AldrichSRP3014-10UGFinal concentration of 10uM needs to be used
BDNFSigma-AldrichR2625-100MGFinal concentration of 2nM needs to be used
Dimethyl Sulfoxide(DMSO)VWR-Alfa Aesar67-68-5Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)Fisher Scientific12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)Fisher Scientific12-565-349

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translat....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Humane corneale fibroblastenSH SY5Y cellijn3D cocultuurmodelsecretie van extracellulaire matrixtransmissie elektronenmicroscopieceldifferentiatieprotocolvitamine C supplementatiebehandeling met retino nezuur

Gerelateerde artikelen