Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

17.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56313

⸱

13 november 2017

 ,  ,  ,  , 
1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

In dit artikel

Samenvatting

Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine in combinatie met high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een genoom-brede methode aan het licht brengen van toegankelijke chromatine. Dit is een stapsgewijze ATAC-seq-protocol, van moleculaire aan computationele uiteindelijk geoptimaliseerd voor menselijke lymfocyten (Th1/Th2). Dit protocol kan worden aangenomen door onderzoekers zonder voorafgaande ervaring in volgorde van volgende-generatie methoden.

Samenvatting

Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine met hoge gegevensdoorvoer sequencing (ATAC-seq) is een methode die wordt gebruikt voor de identificatie van open (toegankelijk) regio's van de chromatine. Deze regio's vertegenwoordigen regelgevende DNA elementen (bijvoorbeeld, initiatiefnemers, versterkers, locus controle regio's, isolatoren) welke transcriptie factoren binden. Toewijzing van het landschap toegankelijk chromatine is een krachtige aanpak voor blootleggen actieve regelgevende elementen over het genoom. Deze informatie dient als een onbevooroordeelde benadering voor het ontdekken van het netwerk van relevante transcriptiefactoren en mechanismen van de structuur van de chromatine waaraan gen expressie programma's. ATAC-seq is een robuuste en gevoelige alternatief voor DNase ik overgevoeligheid analyse in combinatie met de volgende-generatie sequentie (DNase-seq) en formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen (FAIRE-seq) voor genoom-brede analyse van de chromatine toegankelijkheid en de sequencing van micrococcal nuclease-gevoelige sites (MNase-seq) om te bepalen nucleosoom positionering. We presenteren een gedetailleerde ATAC-seq protocol geoptimaliseerd voor menselijke primaire immune d.w.z. CD4 +-lymfocyten cellen (T-helper 1 (Th1) en Th2 cellen). Dit uitgebreide protocol begint met de oogst van de cel, dan beschrijft de moleculaire procedure van chromatine tagmentation, bereiding van de monsters voor de volgende generatie sequencing, en bevat ook methoden en overwegingen voor de computationele analyses gewend het interpreteren van de resultaten. Bovendien, om te besparen tijd en geld, introduceerden we kwaliteitscontrole maatregelen voor de beoordeling van de bibliotheek van de ATAC-seq voorafgaand aan het rangschikken. Nog belangrijker is, kunnen de beginselen die in dit protocol gepresenteerd de aanpassing ervan aan andere menselijke immuun en niet-immuun primaire cellen en cellijnen. Deze richtsnoeren zullen ook bruikbaar zijn voor laboratoria die niet vakkundig met de volgorde van de volgende generatie methoden zijn.

Inleiding

ATAC-seq1,2 is een krachtige methode waarmee identificatie van regelgevende3 open chromatine-regio's en nucleosoom positionering. Deze informatie wordt afgeleid van de locatie, identiteit en activiteiten van transcriptiefactoren toegepast. De gevoeligheid van de methode voor het meten van kwantitatieve verschillen in de structuur van de chromatine maakt de studie van de activiteit van de chromatine factoren, met inbegrip van chromatine remodelers modifiers, alsmede de transcriptionele activiteit van RNA polymerase II1. ATAC-seq biedt dus een krachtige en onbevooroordeelde benadering voor het ontcijferen van de mechanismen die transcriptionele verordening in elk celtype van belang regeren. We beschrijven van de aanpassing van ATAC-seq aan primaire menselijke Th1 en Th2 cellen.

ATAC-seq, hyperactieve Tn5 transposase geladen met adapters voor volgende-generatie sequencing (NGS) paren DNA fragmentatie met tagging van DNA met adapters (dat wil zeggen, het proces van "tagmentation")1. Na PCR versterking zijn de resulterende DNA-bibliotheken klaar voor de volgende generatie sequencing (Figuur 1). De preferentiële tagmentation voor toegankelijk chromatine is gedetecteerd door de analyse van lokale verrijking van ATAC-seq sequencing luidt als volgt.

De korte experimentele procedure en de behoefte aan minder grondstof, ten opzichte van andere methoden voor het meten van de chromatine toegankelijkheid en nucleosomal positionering zoals DNase-seq4, FAIRE-seq5en MNase-seq6, heeft het gebruik van ATAC-seq bevorderd in meerdere biologische systemen, met inbegrip van menselijke primaire cellen1,7 en klinische monsters8, evenals eencellige organismen9, planten10, fruitvliegen11 , en diverse zoogdieren12.

De identiteit van de transcriptie factoren die aan toegankelijk loci gebonden zijn kunnen worden ontdekt door het analyseren van de verrijking van hun bindende reeks motieven of ATAC-seq combineren met chromatine immunoprecipitation (ChIP) gevolgd door high-throughput DNA sequencing) ChIP-seq). Deze aanpak ingeschakeld de identificatie van geslacht-specifieke transcriptiefactoren belangrijk voor Haematopoiese in13van de muis. De onbevooroordeelde en mondiale aard van ATAC-seq kunt studeren genregulatie in organismen waarvoor reagentia zoals antilichamen ChIP p.a. niet beschikbaar zijn. Bijvoorbeeld, evolutionaire variaties in cis-regelgevende gebieden zijn geïdentificeerd door het bestuderen van de craniale neurale kamcellen van mensen en chimpansees14, developmental variaties in regelgevende elementen tijdens de vroege muis embryogenese15, veranderingen in de regelgevende landschap tijdens een levenscyclus van eencellige C. owzarzaki9, en de evolutie van de initiatiefnemers en versterkers over 20 zoogdieren soorten12.

ATAC-seq ook behulpzaam geweest voor het meten van toegankelijkheid van de chromatine in afzonderlijke cellen, aldus onthullende variabiliteit binnen cel populaties, die meestal genoom-brede studies7,16 ontwijkt. ATAC-seq kan bovendien worden gebruikt om te bestuderen van de veranderingen die zich in de regelgevende gebieden DNA in ziekten voordoen, waarin monsters zeldzaam zijn. Bijvoorbeeld, ATAC-seq kan worden gebruikt om te studeren van veranderingen in de regelgevende landschap tijdens de eerste verschijnselen van acute myeloïde leukemie (AML)17 of Ras-gedreven oncogenese11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

alle procedures werden goedgekeurd door institutionele review board van Bar-Ilan Universiteit en het protocol volgt de richtsnoeren van de Commissie houdende goedkeuring van de experimenten.

1. zuivering van naïeve menselijke CD4 + cellen en polarisatie tot T-Helper 1 (Th1) en Th2 cellen

Opmerking: hier beschrijven we de procedure vanaf bevroren perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). De eerste stap bestaat uit het isoleren van CD4 + cellen met behulp van microbeads en kolommen die normaal gesproken geven ons meer dan 95% van CD4 +-cellen. Deze stap kan echter variëren volgens het voorkeursprotocol voor in elk lab. Het protocol voor T-cel activatie en polarisatie werd van Jenner et al. gewijzigd (2009) 18. isolatie van CD4 + cellen uit 10 miljoen PBMCs geeft aanleiding tot 4-6 miljoen van CD4 +-cellen. Ze zijn opgesplitst in twee maatkolven geteeld onder Th1 en Th2 polariserende voorwaarden opbrengst 3-5 miljoen Th1 en Th2 cellen binnen een week.

Opmerking: Cool-down de centrifuge tot 4 ° C voordat.

  1. Ontdooien 1 mL van menselijke PBMCs (10 7 cellen) in een tube van 50 mL met 10 mL van RPMI medium aangevuld met 1% penicilline-streptomycine, 2 mM L-glutamine en 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met een steriele 25 mL pipet in 15 mL aangevuld RPMI voedingsbodem. De cellen (met steriele 25 mL pipet) overbrengen in een maatkolf van de cultuur T75.
  2. Laat de cellen overnachting in een bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO 2).
  3. De zwevende cellen met een steriele 25 mL pipet overbrengen in tube 50 mL. Celaantal en levensvatbaarheid bepalen door trypan blauwe uitsluiting.
  4. Isoleren CD4 + cellen uit 10 miljoen leven niet-aanhanger PBMCs door positieve selectie met behulp van CD4 + microbeads en kolommen volgens de fabrikant ' s aanbevelingen (Zie Tabel van materialen/uitrusting) met de volgende wijzigingen: 10 7 PBMCs zijn gelabeld met 30 µL van CD4 microbeads in 120 µL van 0,5% BSA in PBS.
  5. Activeren de CD4 + T cellen gedurende 72 uur door rhIL-2 (10 ng/mL), plaat-gebonden anti-CD3 (5 µg/mL) en oplosbare anti-CD28 (2 µg/mL). Voor Th1 polarisatie, voeg rhIL-12 (20 ng/mL) en anti-IL-4 (10 µg/mL). Voor Th2 polarisatie, voeg rhIL-4 (40 ng/mL) en anti-IFN-γ (10 µg/mL).
  6. Cultuur van de cellen voor extra 7 dagen in de aanwezigheid van rhIL-2 (10 ng/mL) en de dezelfde polariserende cytokinen (rhIL-12 voor Th1 en Th2 rhIL-4).

2. Kernen isolatie

Opmerking: ATAC-seq wordt uitgevoerd met intact kernen. Lysis buffer met 0,05% nonylphenyl polyethyleenglycol was (Zie Tabel van materialen/uitrusting) voor het isoleren van de kernen van primaire menselijke Th1 en Th2 cellen gekalibreerd. Het is raadzaam om deze stap met de laboratoriumreagentia en cellen kalibreren. Een overmaat van onbeschadigde cellen van onvoldoende wasmiddel vermindert de efficiency van de reactie van de omzetting. Efficiëntie lysis van de cel wordt bepaald door het aantal kernen (trypan blauw positieve cellen) ten opzichte van het totale aantal cellen.
Opmerking: Bereiden de lysis-buffermengsel (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2). Cool-down een centrifuge met een swing-emmer rotor tot en met 4 ° C. de cellen in een centrifuge swing-emmer in plaats van een vaste hoek centrifuge pillering vermindert celkernen/verlies. Om te voorkomen dat de kernen of cel verlies, Pipetteer zorgvuldig wanneer het supernatant teruggooi.

  1. Toevoegen verse nonylphenyl polyethyleenglycol (om een eindconcentratie van 0,05%) en 100 x proteaseinhibitors (om een eindconcentratie van 1 x) aan de koude lysis buffer onmiddellijk vóór gebruik. Houd de buffer op ice.
  2. Aantal T-cellen om te bepalen hun bedrag en levensvatbaarheid trypan blauwe methode. Levensvatbaarheid die lager is dan 90% resulteert in hogere aspecifieke spijsvertering.
  3. Overdracht 0,5 x 10 6 T cellen (Th1 of Th2) tot 1,5 mL slangen. Spin down bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  4. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing. Spin down bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  5. Resuspendeer de pellet in 1 mL van de cel van koude lysis-buffermengsel (met polyethyleenglycol nonylphenyl en proteaseinhibitors). Houd de buis op ijs. Pipet zachtjes te voorkomen dat de kernen.
  6. Snel nemen 10 µL en cellen met een geautomatiseerde cel teller tellen terwijl de microtube met lysed cellen op het ijs is. Deze stap mag niet meer dan vijf minuten om te voorkomen beschadiging van de kernen. Ten minste 80% van de cellen moeten worden lysed.
  7. Doorgaan onmiddellijk met de reactie van de omzetting. Houd de bereid kernen op de ice.

3. Omzetting reactie

Opmerking: In deze stap, geïsoleerde kernen worden geïncubeerd met prokaryote Tn5 transposase (TDE1) geladen met adapters voor NGS sequencing. Hyperactieve Tn5 gelijktijdig fragmenten van DNA en ligates adapters in toegankelijke regio's van het genoom (tagmentation proces). De verhouding tussen de kernen en Tn5 transposase is essentieel voor preferentiële decollete op toegankelijk chromatine. Dit protocol is gekalibreerd voor 100.000 kernen in een 100 μl reactie volume. Echter, de reactie kan worden teruggeschroefd.

  1. Temperatuur instellen in een thermische shaker tot 37 ° C.
  2. Transfer 100.000 kernen naar een microtube 1,5 mL.
  3. Centrifuge op 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en zachtjes de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
  4. De omzetting reactie onderdelen toevoegen aan de kernen als aangegeven in tabel 1.
  5. Resuspendeer door zachte pipetteren.
  6. Laat de reactie van de omzetting in een thermische shaker bij 37 ° C gedurende 30 minuten inwerken met zacht schudden (500 rpm).
    Opmerking: DNA Cleanup wordt uitgevoerd door solid-phase omkeerbare immobilisatie kralen 19 (Zie Tabel van materialen/uitrusting) of PCR zuivering kolommen. Aan het einde van het opruimen, elueer de DNA fragmenten in 20 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 8. EDTA voorkomen in de buffer elutie.

4. PCR verrijking van ATAC-seq bibliotheken

Opmerking: deze stap is gericht op het versterken van de ATAC-seq bibliotheek d.w.z., DNA-fragmenten met ingevoegde adapters. Dat het mengen van verschillende ATAC-seq-bibliotheken in de dezelfde volgorde van de volgende generatie lane (" multiplex ") gebruik geïndexeerde Primer 1 (Ad1_noMx) 1 voor alle monsters, en een andere geïndexeerd (barcoded) Primer 2 (Ad 2.1-2.24) 1 voor elk monster. De primer sequenties vindt u in de aangevuld Tabel van materialen/uitrusting.

  1. Eerste PCR versterking
    Opmerking: de concentratie van de werken van Primer 1 (Ad1_noMx) en Primer 2 is 25 µM. Alle de inleidingen zijn verdund uit oorspronkelijke voorraad van 100 µM tot 25 µM. In elk van de PCR reacties, Primer-1 (Ad1_noMx) en slechts één van de geïndexeerde Primer 2 te gebruiken.
    1. De componenten van de PCR reactie als aangegeven in tabel 2 toevoegen aan een steriele PCR buis.
    2. Plaats PCR buisvideo in een thermische cycler en het uitvoeren van PCR versterking met behulp van de fietsen voorwaarden gedetailleerd in tabel 3.
  2. Beoordeling van aantal extra versterking cycli
    Opmerking: het aantal extra cycli van PCR voldoende hoeveelheid bibliotheek fragmenten f moet opleverenof een succesvolle sequencing van de volgende generatie uitvoert, terwijl geminimaliseerd om te vermijden GC en grootte bias 20. De bepaling van het aantal PCR cycli (N) vereist voor optimale bibliotheek fragment versterking ervan gebeurt door kwantitatieve PCR (qPCR).
    1. Verdun inleidingen 1 (Ad1_noMx) en 2 (gebruikt voor de versterking van de eerste bibliotheek) van 25 µM tot 6,25 µM.
    2. Aan optiektubus PCR of een plaat de onderdelen toevoegt, zoals vermeld in tabel 4.
    3. Plaats in een qPCR-instrument en de cyclus als aangegeven in tabel 5.
    4. Voor het inschatten van het vereiste aantal extra versterking cycli (N), plot cyclus nummer op de x-as en de relatieve fluorescentie (RFU) op de y-as.
    5. Het aantal extra versterking cycli (N) is 1/3 van het aantal cycli waartegen de reactie van qPCR het plateau bereikt. Figuur 2 geeft voorbeelden voor drie ATAC-seq-bibliotheken die plateau op ~ 2,350 relatieve fluorescentie eenheden, RFU (dikke groene lijn bereikt). Het aantal cycli van PCR waarin een derde van het maximale bedrag (783 RFU, gemarkeerd op y-as) wordt versterkt komt overeen met 8 cycli voor twee van de bibliotheken (rood en blauw amplificatie curven) en 9 cycli van PCR voor de derde bibliotheek (roze).
  3. Laatste PCR versterking
    1. versterken de resterende 45 µL van het PCR-reactie. Plaats een buis van de PCR versterking reactie van stap 4.1.2 in een thermische cycler met. Voer het programma van de PCR beschreven in tabel 6. Gebruik de vooraf bepaalde (stap 4.2.5) aantal amplificatie cycli (N).

5. Het formaat van de selectie van de bibliotheken van de ATAC-Seq

Opmerking: In onze ervaring, grootte selectie van versterkte ATAC-seq bibliotheken verbetert volgende-generatie rangschikkend resultaten omdat het elimineert ultrahoog moleculair gewicht bibliotheek fragmenten uit de definitieve ATAC-seq library.
Opmerking: De magnetische kralen opwarmen tot kamertemperatuur 30 min vóór gebruik toestaan.
Bereiden van verse 70% ethanol in nuclease-vrij water.

  1. Resuspendeer de magnetische kralen door het mengen van.
  2. Nuclease-gratis water toevoegt aan de bibliotheken van de ATAC-seq (verkregen in stap 4.3.1.) en breng 100 µL.
  3. Toevoegen 50 µL (0,5 x) van de geresuspendeerde DNA-bindende magnetische kralen aan 100 µL van versterkte bibliotheken. Meng door pipetteren op en neer ten minste 10 keer. Monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Indien nodig, snel spin down de slangen.
  4. Plaats de buis op een passende magnetische stand gedurende 2 minuten om te scheiden van de magnetische kralen van de bovendrijvende substantie. Na 2 min, overbrengen in het supernatant een nieuwe microtube.
  5. Meet het volume van het supernatans dat door pipetteren en toevoegen van 0.7 x van magnetische kralen. Meng door pipetteren op en neer ten minste 10 keer.
  6. Laat 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Plaats op een magnetische staan gedurende 2 minuten
  7. Na de 2 min incubatie, verwijder het supernatant. Toevoegen van 200 µL vers gemaakte 70% ethanol te wassen van de kralen, terwijl de buizen zijn op de magnetische stand.
  8. Houden de microtube aan de magneet voor 30 s en vervolgens negeren de ethanol. Herhaal stap 5.7.for twee definitieve ethanol wast.
  9. Verwijderen van de resterende ethanol en laat die de kralen luchtdroog gedurende 5 minuten, terwijl de buis aan de magneet is. Indien nodig, kort draaien de microtube. Verwijderen van de sporen van ethanol met een uiteinde van de pipet p10.
  10. Verwijder de microtube uit de magneet en voeg 22 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 8. Doen niet elueer de ATAC-seq bibliotheken in buffer met EDTA.
  11. De buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur incuberen en plaatst u vervolgens op de magnetische stand.
  12. Wanneer de oplossing duidelijk is, 20 µL van geëlueerd bibliotheken overbrengen in een nieuwe steriele microtube.
  13. Winkel de grootte geselecteerd ATAC-seq bibliotheken bij -20 ° C.

6. Analyse van de kwaliteit van de ATAC-Seq-bibliotheken

  1. validatie van de kwaliteit van ATAC-seq bibliotheken door Real-Time PCR
    Opmerking: het is belangrijk om te evalueren van de signaal / ruisverhouding van de bibliotheken van de ATAC-seq voorafgaand aan de volgende generatie sequencing. Dit wordt gedaan door het bepalen van de relatieve hoeveelheid DNA-fragmenten van toegankelijk en ontoegankelijk loci met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR). De ontoegankelijke loci (negatieve controle, chr1:48, 137, 860-48,137,934 en chr1:193, 093, 748-193,093,827) zijn versterkt door primerparen 1 en 2. De toegankelijke loci (positieve controle, chr19:30, 336, 166-30,336,253 en chr19:11546154-11546237) zijn versterkt door primerparen 3 en 4. Positieve en negatieve loci werden van chromatine toegankelijkheid (DHS-seq) profielen van menselijke CD4 + cellen (ENCODE toetredingen ENCSR000EQE en ENCSR000EQG) gedefinieerd. Negatieve primer 1 is gelegen in een grote hétérochromatique intergenic regio (230 kb van TRADB2 en 88 kb van FOXD2). Negatieve controle regio 2 is in binnen de eerste intron van CDC73 gen. Positieve primer paar 3 is in een regio van de open chromatine stroomafwaarts van het gen cycline E (CCNE1) terwijl positieve primer paar 4 is gecentreerd in de promotor van proteïne kinase C substraat 80K-H (PRKCSH). Nog belangrijker is, vertonen deze controle loci een vergelijkbaar patroon van toegankelijkheid andere menselijke celtypes van het coderen project 3, suggereren dat ze kunnen worden toegepast om te controleren van ATAC-seq bibliotheken uit een breed spectrum van menselijke celtypes. Primer efficiëntie en specificiteit van alle primerparen werd gecontroleerd door de qPCR op een seriële verdunning van genomic DNA (van menselijke Th-cellen) en een smeltende kromme analyse van verkregen versterkte producten.
    1. Isoleren van genomic DNA met behulp van een commercieel beschikbare kit (Zie Tabel van materialen/uitrusting).
    2. Verdun de versterkte ATAC-seq bibliotheek 1:10 (1 µL bibliotheek + 9 µL van nuclease-gratis water) en genomic DNA te ~ 5 ng/µL.
    3. Bereiden reactiemengsel (tabel 7) voor elk paar positieve en negatieve controle primer, rekening houdend met dat de reacties worden uitgevoerd in drievoud.
    4. In qPCR thermische cycler volgens het protocol aanbevolen door qPCR master mix leverancier Incubate.
    5. Analyseren de resultaten in qPCR instrument ' s software (Zie Tabel van materialen/uitrusting). Kies genomic DNA als controlemonster. De verkregen waarden vertegenwoordigen een verrijking van toegankelijke regio's (versterkt door positieve controle inleidingen). Een voorbeeld is weergegeven in tabel 8.
      Opmerking: Schatting van de gemiddelde bibliotheek grootte en concentratie: de grootteverdeling van DNA-fragmenten van ATAC-seq bibliotheken wordt bepaald door de hoge gevoeligheid geautomatiseerde elektroforese systemen volgens de fabrikant ' s instructies. Het is raadzaam voor het meten van de concentratie van het monster op een Fluorimeter met behulp van dsDNA ultragevoelige kit en ten minste 2 µL van elk DNA-monster.
      Opmerking: Next-generation sequencing - voorafgaand aan de bibliotheken multiplexing, de molarity van elke ATAC-seq-bibliotheek te berekenen met behulp van de formule: (ng/µL x 10 6) / (660 x gemiddelde bibliotheek fragment lengte). Streven naar > 30 miljoen leest van elke ATAC-seq-bibliotheek te beoordelen van de open chromatine regio's in menselijke specimens. Als u bepalen wilt of de bibliotheek goed genoeg voor NGS sequencing is, in eerste instantie streven naar 10 miljoen ~ leest (5% van de sequencing baan op DNA sequencing instrument in snelle run modus). Houd er rekening mee dat als u wilt afleiden nucleosoom positionering, gekoppeld-eind rangschikken nodig 1 is.

7. Analyse van de resultaten verkregen Next-Generation Sequencing

  1. afleiden van de kwaliteit van de sequencing leest door de inspectie van de FastQC bestanden, afzonderlijk voor elke bibliotheek.
  2. Uitlijnen de leest aan menselijke referentie genoom (hg19 assemblage) met behulp van Bowtie 21 software in de Unix/Linux omgeving. De opdracht is ' bowtie -m 1 - q -S genoom directory reads.fastq output_aligned.sam '. Genoom directory staat voor de map waarin de genoom-indexen van Bowtie zijn opgeslagen. De parameter -m 1 is voor het niet toestaan van uitlijning van leest om meer dan één locus in het genoom - q voor het invoerbestand dat fastq opgemaakt zijn moet, -S is voor de uitvoer in SAM indeling.
  3. Verwijder dubbele leest met SAMtools 22 rmdup optie in de Unix/Linux omgeving. De opdrachten zijn ' samtools bekijken -S output_aligned.sam -b | samtools sorteren -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
    samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. De eerste opdracht, weergave, wordt de opmaak van de SAM in BAM-formaat dat is vervolgens gesorteerd op volgorde. De optie van rmdup wordt vervolgens toegepast op de gesorteerde BAM-bestand. Optioneel kunt een het luidt voor het transposon invoeging site, zoals beschreven in de oorspronkelijke ATAC-seq papier 1. Dit wordt gedaan met BEDtools opdrachten 23 in de Unix/Linux omgeving. De opdrachten zijn ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g genoom > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. De eerste opdracht, bamTobed, wordt de opmaak van de BAM naar BED formaat, die vervolgens kan worden gebruikt voor de opdracht shiftBed. Het genoom-bestand is een bestand met scheidingstekens tabblad waarin de lengte van elk chromosoom in het genoom. Het bestand wordt meestal toegevoegd in de map BEDtools.
  4. Uitvoeren piek bellen met behulp van model-gebaseerde analyse van ChIP-seq (MACS2) 24 software in de Unix/Linux omgeving op het verplaatste bestand van het BED met de volgende parameters:--nomodel--extsize 75--shift -30. Deze parameters worden gebruikt het luidt als volgt aanpassen zodat de transposon invoeging site in het midden van elke volgorde lezen is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het eindresultaat van dit protocol is een bibliotheek van de ATAC-seq van meestal 3-20 ng/µL. Wanneer uitvoeren op een systeem voor de analyse van de integriteit van het DNA (Zie Tabel van materialen/uitrusting), ze tonen ladder-achtige verschijning2 (figuur 3A). De gemiddelde grootte van DNA-fragmenten is meestal ~ 450-530 bp.

Goede controle van de kwaliteit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol van de ATAC-seq hier beschreven is met succes werkzaam zijn voor de analyse van toegankelijk chromatine in primaire cellen (menselijke Th1, Th2 cellen en B-cellen) alsmede de gekweekte cellijnen (MCF10A van menselijke borstkankercellen en U261 glioblastoma cellen). ATAC-seq toe te passen op andere celtypes kan eisen sommige protocolverbetering, vooral in de lysis stap. Als de concentratie van niet-ionogene wasmiddel te hoog is, is er mogelijk een hoger percentage van mitochondriaal DNA besmetting. Dit kan wo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de Israël Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie integratie verlenen (CIG) - FP7-mensen-20013-CIG-618763 en CORE programma van de Planning en budgettering Comité en The Israel Science Foundation verlenen nr. 41/11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
50 mL tubesLumitronLUM-CFT011500-PKan van andere leveranciers zijn.
MicrotubesAxygen IncMCT-175-CKan van andere leveranciers zijn.
25 mL serologische pipettenCorning Costar4489Kan van andere leveranciers zijn.
WeefselkweekkolfLumitronLUM-TCF-012-250-PKan van andere leveranciers zijn.
Countes Automated Cell CounterInvitrogenC10227
NucleoSpin TissueMACHEREY-NAGEL740952.5
Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC)ATCC PCS­800­011Kan van andere leveranciers zijn.
RPMI 1640 MediumBiological Industries01-103-1AKan van andere leveranciers zijn.
L-Glutamine-oplossing (200 mM)Biological Industries03-020-1BKan van andere leveranciers zijn.
Penicilline-StreptomycineBiological Industries03-031-1BKan van andere leveranciers zijn.
Fetaal bovien serum (FBS), Hitte-geïnactiveerd, Europese kwaliteitBiological Industries04-127-1Kan van andere leveranciers zijn.
MACS CD4 microbeads, humanMiltenyi Biotec130-045-101
MACS MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Anti-Human CD4 FITCBiogems06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITCBiogems44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3)Tonbo biosciences40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE PurifiedBiogems10311-25
Recombinant Human IL2Peprotech200-02
Recombinant Human IL4Peprotech200-04
Recombinant Human IL12 p70Peprotech200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)Tonbo40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γBioLegend506513
NaCl, analytische kwaliteitCarlo Erba479687Kan van andere leveranciers zijn.
Magnesiumchloride, hexahydraat, moleculaire biologie kwaliteitCalbiochem442611Kan van andere leveranciers zijn.
EDTAMP Biomedicals800682Kan van andere leveranciers zijn.
Tris, ultra zuiver, 99,9% zuiverMP Biomedicals819620Kan van andere leveranciers zijn.
NP-40 alternatief (Nonylfenyl Polyethyleen Glycol)Calbiochem492016Kan van andere leveranciers zijn.
Protease InhibitorsSigmaP2714Deze protease-remmercocktail is een poeder. Om een 100 x oplossing te maken, verdun in 1 mL water van moleculaire biologie kwaliteit.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beadsBeckman63881
PCR-zuiveringskitHyLabsEX-GP200Kan van andere leveranciers zijn.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase en TD buffer)IlluminaFC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master MixNew England BioLabsM0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543
SYBR Green I InvitrogenS7585
 CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBio-rad185-5200Kan van andere leveranciers zijn.
CFX Manager SoftwareBio-rad1845000
mastermix voor qPCR: iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-rad172-5124Kan van andere leveranciers zijn.
Qubit fluorometer 2.0InvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32854
Magneet voor eppendorfbuisjesInvitrogen12321DKan van andere leveranciers zijn.
Zwenkbokaalcentrifuge met de emmers voor 15 mL falconbuisjes en eppendorfbuisjesThermo Scientific75004527Kan van andere leveranciers zijn. Het is belangrijk dat het emmers voor eppendorfbuisjes heeft.
Thermo-shakerMRCKan van andere leveranciers zijn.
High Sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
High Sensitivity D1000 ReagentsAgilent Technologies5067-5585
4200 TapeStation systeemAgilent TechnologiesG2991AATape-based platform voor  elektroforese
High Sensitivity DNA kitAgilent Technologies5067-4626Reagens voor hooggevoelige TapeStation-analyse
Primernaam en -sequentieBedrijf
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
AGATGTG-3'		IDTAd1-noMx: 5'-P5 sequentie-transposase sequentie-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.1_verwachte indexsequentie-lezen: 5'-P7 sequentie-[indexsequentie]-transposase sequentie-3'
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'		IDTAd2.2_verwachte indexsequentie-lezen: 5'-P7 sequentie-[indexsequentie]-

Referenties

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
  3. Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  4. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
  5. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  6. Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
  7. Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
  8. Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030(2016).
  9. Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
  10. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41(2016).
  11. Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
  12. Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
  13. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  14. Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  15. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
  16. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  17. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  18. Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
  19. DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18(2011).
  21. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  22. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  23. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  25. Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  26. He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
  27. Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
  28. Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
  29. Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284(2015).
  30. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Chromatine toegankelijkheidprimaire T lymfocytenisolatie van kernentranspositiereactielibrary amplificatiekwaliteitscontrolemaatregelenpeak calling analyseDNA reinigingsstapzuivering met magnetische korrels
Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.