Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

Ivana Grbesa; Miriam Tannenbaum; Avital Sarusi-Portuguez; Michal Schwartz; Ofir Hakim

doi:10.3791/56313

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

17.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56313

⸱

13 november 2017

Ivana Grbesa¹ , Miriam Tannenbaum¹ , Avital Sarusi-Portuguez¹ , Michal Schwartz¹ , Ofir Hakim¹

¹The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

In dit artikel

Samenvatting

Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine in combinatie met high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een genoom-brede methode aan het licht brengen van toegankelijke chromatine. Dit is een stapsgewijze ATAC-seq-protocol, van moleculaire aan computationele uiteindelijk geoptimaliseerd voor menselijke lymfocyten (Th1/Th2). Dit protocol kan worden aangenomen door onderzoekers zonder voorafgaande ervaring in volgorde van volgende-generatie methoden.

Samenvatting

Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine met hoge gegevensdoorvoer sequencing (ATAC-seq) is een methode die wordt gebruikt voor de identificatie van open (toegankelijk) regio's van de chromatine. Deze regio's vertegenwoordigen regelgevende DNA elementen (bijvoorbeeld, initiatiefnemers, versterkers, locus controle regio's, isolatoren) welke transcriptie factoren binden. Toewijzing van het landschap toegankelijk chromatine is een krachtige aanpak voor blootleggen actieve regelgevende elementen over het genoom. Deze informatie dient als een onbevooroordeelde benadering voor het ontdekken van het netwerk van relevante transcriptiefactoren en mechanismen van de structuur van de chromatine waaraan gen expressie programma's. ATAC-seq is een robuuste en gevoelige alternatief voor DNase ik overgevoeligheid analyse in combinatie met de volgende-generatie sequentie (DNase-seq) en formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen (FAIRE-seq) voor genoom-brede analyse van de chromatine toegankelijkheid en de sequencing van micrococcal nuclease-gevoelige sites (MNase-seq) om te bepalen nucleosoom positionering. We presenteren een gedetailleerde ATAC-seq protocol geoptimaliseerd voor menselijke primaire immune d.w.z. CD4 +-lymfocyten cellen (T-helper 1 (Th1) en Th2 cellen). Dit uitgebreide protocol begint met de oogst van de cel, dan beschrijft de moleculaire procedure van chromatine tagmentation, bereiding van de monsters voor de volgende generatie sequencing, en bevat ook methoden en overwegingen voor de computationele analyses gewend het interpreteren van de resultaten. Bovendien, om te besparen tijd en geld, introduceerden we kwaliteitscontrole maatregelen voor de beoordeling van de bibliotheek van de ATAC-seq voorafgaand aan het rangschikken. Nog belangrijker is, kunnen de beginselen die in dit protocol gepresenteerd de aanpassing ervan aan andere menselijke immuun en niet-immuun primaire cellen en cellijnen. Deze richtsnoeren zullen ook bruikbaar zijn voor laboratoria die niet vakkundig met de volgorde van de volgende generatie methoden zijn.

Inleiding

ATAC-seq¹^,² is een krachtige methode waarmee identificatie van regelgevende³ open chromatine-regio's en nucleosoom positionering. Deze informatie wordt afgeleid van de locatie, identiteit en activiteiten van transcriptiefactoren toegepast. De gevoeligheid van de methode voor het meten van kwantitatieve verschillen in de structuur van de chromatine maakt de studie van de activiteit van de chromatine factoren, met inbegrip van chromatine remodelers modifiers, alsmede de transcriptionele activiteit van RNA polymerase II¹. ATAC-seq biedt dus een krachtige en onbevoor....