Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hydrodynamische Renal bekken injectie voor niet-virale expressie van eiwitten in de nier

18.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56324

⸱

8 januari 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Healthcare System, 2Departments of Medicine and Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Medicine, Baylor University College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om te injecteren plasmide DNA in de nier van de muis via de renal bekken te produceren transgenic expressie specifiek in de nier.

Samenvatting

Hydrodynamische injectie creëert een lokale, hogedruk omgeving om te transfect verschillende weefsels met plasmide DNA en andere stoffen. Hydrodynamische staart veneuze injectie, bijvoorbeeld, is een gevestigde methode waarbij de lever kan zijn transfected. Dit manuscript wordt beschreven van een toepassing van de beginselen van de hydrodynamische door injectie van de nier van de muis rechtstreeks met plasmide DNA voor nier-specifieke genexpressie. Muizen zijn verdoofd en de nier wordt blootgesteld door een flank incisie gevolgd door een snelle injectie van een plasmide DNA-bevattende oplossing direct in het bekken renal. De naald is op zijn plaats gehouden gedurende tien seconden en de site van de incisie is ingehecht. De volgende dag, live dierlijke imaging, westelijke vlek, of immunohistochemistry kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van genexpressie of andere tests die geschikt is voor de transgenic van keuze worden gebruikt voor detectie van de proteïne van belang. Gepubliceerde methoden te verlengen van genexpressie omvatten transposon-gemedieerde transgenic integratie en cyclofosfamide behandeling om de immuunrespons remmen aan de transgenic.

Inleiding

De hydrodynamische staart veneuze injectietechniek uitgegroeid tot een veel gebruikte manier om hoge niveaus van genexpressie in muis lever1,2te bereiken. De nieren zijn ook door deze techniek op een veel lager niveau, ongeveer 100-fold minder3transfected. De injectie van de hydrodynamische renal bekken hier beschreven biedt een eenvoudige manier om te controleren de specificiteit van orgel expressie via fysieke middelen met behulp van de hydrodynamische beginselen die eerder zijn vastgesteld in de lever4,5 , spier6en andere organen7,8. Deze methode transfects cellen in levende dieren in vivo met behulp van druk en snelheid te dwingen vloeistof met DNA in de cellen, gelijktijdig inducerende schade aan het orgaan dat is snel opgelost9. Met behulp van gevestigde chirurgische technieken om te visualiseren van de nier via een flank incisie10 samen met een enkele injectie door insuline spuit, hebben we gevonden succesvol transfectie van verschillende soorten nier cellen, voornamelijk interstitiële fibroblasten, tubuli en verzamelen kanaal11. Dissectie van deze muizen heeft aangetoond dat andere organen niet hoog genoeg om te visualiseren door luciferase imaging technieken11niveau zijn transfected. Aangezien de techniek niet-virale is, toelaat gebruik van plasmide DNA voor Transfectie snel en gemakkelijk voorbereiding van de reagentia die nodig zijn voor de injectie.

We zijn gewend geraakt gelokaliseerde hydrodynamische injecties geven de antioxidant glutathione S-transferase A4, de insuline-achtige groeifactor-1-receptor en het hormoon Erytropoëtine in de nier, allemaal met de verwachte biologische effecten11, 12 , 13. gedetailleerde evaluatie van de wijze van toediening, geïnjecteerde volume, DNA dosering, en promotor keuze geweest uitgevoerde11. Bovendien is zowel de piggyBac transposon systeem en/of cyclophosphamide behandeling te onderdrukken de immune reactie op de transgenic gebleken om op lange termijn gen expressie resultaten11. Andere onderzoekers hebben een renale ader aanpak in rat met succes, het bereiken van hoge transfectie efficiëntie voor perioden van meer dan een maand14gebruikt. Echter, genetische correctie van fenotypen nabootsen van ziekten bij de mens worden gewoonlijk uitgevoerd bij muizen eerst als een bewijs-van-concept aangezien meest zoogdieren genetische modellen Muismodellen. We vergeleken renale veneuze injectie renal bekken injectie en vond dat de injectie in het bekken renal superieur aan de renale ader voor genexpressie (ongeveer tien keer hoger) en survival11 was. Het bekken renal is een ideale route van binnenkomst in de nier, want het is flexibel genoeg om het dulden van schommelingen in de productie van urine en is vaak kunnen handhaven van de structurele integriteit zelfs wanneer uitgezet tijdens hydronephrosis. Bovendien, injectie in het bekken renal toegang hebben tot de nier zonder het piercing de capsule van de nier, waardoor de ingespoten vloeistof zichtbaar door de nieren beter dan intraparenchymal injectie worden bewaard. Andere organen muis beschikt niet over een route van binnenkomst dan de therapieën, maar de urine ruimte van de nieren is een ideale injectieplaats. Bovendien injectie in de renale ader leidde tot lekkage van bloed in de buikholte. Het volume van de totale nier van wild-type muis nieren is geschat door magnetische resonantie beeldvorming worden ongeveer 0.2 cm3, zodat het volume van een één nier ongeveer gelijk aan de hoeveelheid vloeistof die geïnjecteerd door renal bekken hydrodynamische is injectie (100 µL)15. Hierin, hebben wij beschikbaar gesteld alle van de gedetailleerde nuances van het hydrodynamische renal bekken injectie protocol om reproduceerbare transfectie van de nier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUCs) van Baylor College of Medicine en Vanderbilt University Medical Center.

1. bereid de DNA-oplossing voor injectie

  1. Selecteer de plasmid(s) wil de transgene(s) zorgvuldig om te maximaliseren van de wenselijke kenmerken ter verbetering van de efficiëntie van de transfectie en transgenic expressie.
    Opmerking: Hydrodynamische renal bekken injectie van plasmiden, wil de fluorescerende markering TdTomato hormoon Erytropoëtine (Epo) en firefly luciferase geweest eerder beschreven11. Als er niet een goed ontwikkelde assay voor Transfectie efficiëntie voor de transgenic, voeren levende dieren beeldvorming van luciferase door de invoering van 10 µg luciferase-uiten plasmide zoals verbeterde firefly luciferase tot het verdunde DNA voor injectie.
    1. Kies de kleinste plasmide dat praktisch is voor de toepassing.
      Opmerking: Kleine plasmiden transfect over het algemeen beter dan grote plasmiden cellen. Bijvoorbeeld, zijn de zeomycin weerstand gen en de R6K oorsprong van replicatie klein, dus met behulp van deze elementen in de plasmide ruggengraat plasmide verkleinen zullen.
    2. Express de transgenic van een zoogdieren promotor.
      Opmerking: De nier celtype transfected, lengte van genexpressie en sterkte van genexpressie zal alle worden beïnvloed door de keuze van de promotor. Zie Woodard et al. voor een vergelijking van cytomegalovirus (CMV; constitutieve virale), rek factor-1 alpha (EF-1α; constitutieve endogene), gamma-glutamyl transferase (γGT; zaadvormende-specifieke) en podocin (NPHS2; podocyte-specifieke)11.
    3. Een niet-virale integratie systeem zoals transposons dienst als hoger niveau voor lange termijn gen expressie wenselijk11,16. Voor studies met vroege uitlezingen minder dan 5 dagen na injectie is de integratie van de transgenic overbodig.
  2. Plasmide DNA voorbereiden injectie via een commerciële methode zoals een endotoxine-gratis maxiprep-kit. Zorgvuldig vermijden invoering van endotoxines via labware.
    Opmerking: Aanwezigheid van endotoxines in de DNA-oplossing zal ontlokken een ernstige immuunrespons bij het onderwerp dier, afbreuk te doen aan het experiment en eventueel het doden van het dier.
    1. Nadat de laatste DNA isolatie wassen stap voltooid is, controleert u of dat geen ethanol niet door visueel onderzoek en geur. Gebruik gel-laden tips voor het verwijderen van zichtbaar druppels. Droog de buisjes met het DNA-pellet ondersteboven op laboratorium delicate taak wisser weefsels bij kamertemperatuur of in een oven van 37-60 ° C met constante controle. Resuspendeer de pellet onmiddellijk nadat residuele ethanol Voorkom uitdrogen van de pellet is verdampt.
      Opmerking: Residuele ethanol interfereert met de spectrofotometer lezing van de DNA-concentratie en inleiding tot de nier is niet wenselijk.
    2. Resuspendeer de pellet van DNA in de dezelfde buffer zoals zal worden gebruikt voor injectie (hydrodynamische levering buffer; 100-300 µL) te beperken van de variatie in de chemische samenstelling van de DNA-bufferoplossing tussen groepen.
      Opmerking: Niet resuspendeer de pellet van DNA in de elutie-bufferoplossing die bij de kit wordt meegeleverd. De chelaatvormer EDTA voorkomende in "TE" buffer preparaten kan van invloed zijn op nier- en cardiovasculaire functie. Afhankelijk van de grootte van de pellet, Elueer in 100-300 µL van de buffer van de hydrodynamische levering aan het bereiken van een hoge concentratie. De uiteindelijke concentratie van het volledig verwaterde DNA zal worden tussen 100 ng/µL (10 µg/muis dosis) en 500 ng/µL (50 µg/muis dosis) dus moet de voorraad DNA-concentratie deze overschrijden.
    3. Volledig resuspendeer de pellet van DNA in de buffer. Laat de pellet in hydrodynamische levering buffer in de originele buis bij kamertemperatuur gedurende ten minste één uur of 's nachts bij 4 ° C voordat u overdraagt aan een steriele microfuge buis om ervoor te zorgen dat het DNA volledig is opgelost.
    4. Lees de plasmide-DNA-concentratie op een spectrofotometer of door een andere gevestigde methode.
      Opmerking: Lezingen moet worden in tweevoud met extra replicatieonderzoeken indien nodig. Als de verhouding tussen de 260/280 lager dan de 1.8 is, de voorbereiding is verontreinigd met RNA of een andere stof dus verwerpen en bereiden het DNA weer.
    5. Winkel plasmide DNA geresuspendeerde in injectie buffer bij-20 ° C in een doos in een handleiding ontdooi diepvries om te voorkomen dat de aantasting van het DNA.
      Opmerking: Opgeslagen op deze manier, zal de DNA-voorbereiding voor vele jaren duren. Controleer de integriteit van het DNA door beperking Verificatiesamenvatting en agarose gelelektroforese. DNA dat beneden de rijstrook is besmeurd verslechterd en kan niet worden gebruikt terwijl DNA dat scherpe bands van het juiste formaat produceert kan worden gebruikt voor injectie.
  3. Bereid de verdunde plasmide DNA oplossing voor injectie in het bekken renal.
    Opmerking: Overwegen controle groepen zorgvuldig. Voor vele studies zijn naïef en buffer geïnjecteerd-alleen besturingselementen opgenomen omdat de injectie zelf schade veroorzaakt en de experimentele resultaten11kan beïnvloeden.
    1. Ontdooi de endotoxine-gratis DNA geëlueerd in hydrodynamische levering buffer bij kamertemperatuur op de Bank.
    2. Berekenen van de hoeveelheid DNA die nodig zijn voor de injecties en het verdunde DNA voorbereiden in elke groep. 10-50 µg plasmide DNA gebracht om een totaal volume van 100 µL met hydrodynamische levering buffer per muis beheren.
      Opmerking: Voor een voorbeeld, de berekeningen te injecteren 3 muizen met 10 µg/muis van een DNA plasmide dat een concentratie van 0,5 µg/µL heeft zijn als volgt.
      1. Bereid de oplossing van genoeg DNA dat ongeveer 20% extra voor het laden van de spuiten en de dode ruimte in de naald. Voor 3 muizen, bereiden een mix op 3.5 x. Bereken de massa van DNA in µg die in de oplossing worden moet. Het zou hier 10 µg x 3,5 = 35 µg.
      2. Bereken het totale volume van de oplossing wensen voor injecterende 100 µL per muis. In dit geval lijkt het me 100 µL x 3,5 = 350 µL totale volume.
      3. Bereken het volume van voorraad plasmide DNA toe te voegen aan de oplossing. Het zou in dit geval 35 µg / 0,5 µg/µL = 70 µL van voorraad plasmide DNA.
      4. Bereken het volume van de buffer toe te voegen aan de verdunde oplossing van DNA door de hoeveelheid voorraad DNA toegevoegd (stap 1.3.2.3) van het totale volume van de verdunde DNA dat gewenste (stap 1.3.2.2) af te trekken. In dit geval zou het 350 µL - 70 µL = 280 µL hydrodynamische levering buffer.
    3. Oplossingen in steriele microfuge buizen met behulp van commercieel verkrijgbare filter Pipetteer tips met steriele techniek op de lab-Bank voor te bereiden.
      Opmerking: DNA oplossingen kunnen worden bereid en bewaard bij kamertemperatuur voor injecties die dag had ingesteld. Injecteren muizen niet met een koude oplossing, zoals dit zal hun lichaamstemperatuur lager, maar geen onnodige opwarming van de aarde is.

2. uitvoeren van de hydrodynamische renal bekken injectie chirurgie

  1. Selecteer muizen zorgvuldig voor chirurgie.
    Opmerking: Stam-specifieke verschillen nog niet zijn nagekomen, maar mogelijk. De meeste injecties zijn geweest op de C57BL/6 of FVB achtergronden. Renal bekken injecties werken het beste in muizen die 6-12 oud weken. In muizen groter is dan 16 weken, tot een 50% mislukkingstarief door luciferase is imaging het mogelijk om onduidelijke redenen. Dus dit kan een algemene beperking met betrekking tot het beginsel van de hydrodynamische injectie toestaat, wordt hier de dezelfde leeftijdsgebonden mislukkingstarief voor hydrodynamische staart ader injecties aan de lever geconstateerd. Langs dezelfde lijnen, anderen hebben aangetoond dat hydrodynamische staart veneuze injectie in fibrotische rat lever niet zo effectief als gezonde lever is, zodat het wellicht mogelijk dat in de instellingen van de renale fibrose de renal bekken hydrodynamische injectie niet zo effectief worden zal, maar Dit is niet getest direct17.
  2. Muizen en DNA spuiten voorbereiden door chirurgie.
    1. Anesthetize van de muizen met ketamine en xylazine.
      1. Zet op de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen vereist door het dier faciliteit, zoals nitril handschoenen, disposable lab schort en chirurgische gezichtsmasker.
      2. Werken met 2-4 muizen tegelijk, weeg elke muis in een plastic bekerglas van 500 mL op een schaal die is nauwkeurig tot op 0,1 g. berekent het juiste bedrag van 24 mg/mL verdund in normale 0.9% zout te beheren voor elke muis door intraperitoneale injectie van ketamine en 2 mg/mL xylazine (Zie waarnaar wordt verwezen video voor meer informatie over intraperitoneale injectie) 18. Gebruik de formule (50 µL + ((5 µL) x (gewicht (g))), of als alternatief berekenen volgens een andere formule na overleg met de lokale dierenarts team en IACUC.
      3. Injecteer de muis door intraperitoneale injectie door de standaardtechnieken. Totdat de muis immobiel is, plaatst u de muisaanwijzer in een emmer van papier.
        Opmerking: Muizen zijn klaar voor een operatie wanneer ze niet langer op de teen-snuifje-test reageert. Geef muizen die blijven reageren op de teen-snuifje test 20-30 min na de eerste injectie 20-60 µL meer verdoving, afhankelijk van de sterkte van het antwoord.
      4. Plaats de muis op een water-verspreid warmte pad is voorzien van een blauwe pad en plaats dierenarts zalf in beide ogen ter voorkoming van uitdroging van de cornea.
    2. De linkerkant van de achterkant van de muis vanaf de schouder aan de romp en flank aan ruggengraat scheren met een scheerapparaat ontworpen voor het verzorgen van het huisdier. Losse haren en puin te verwijderen.
    3. Een aparte spuit met 100 µL van verdunde DNA voor elke narcose muis, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen zijn voor te bereiden.
      1. Gebruik een steriele 29G x ½" 0,5 mL U-100 insuline spuit met een permanent aangesloten naald zonder een veiligheid.
        Opmerking: Het type van de spuit is van cruciaal belang. Deze meter zorgt voor een snelle injectie. De permanent aangesloten naald voorkomt dat de oplossing lekt. Aanwezigheid van een veiligheid zal belemmeren de toegang tot de renal bekken. De spuiten die is opgegeven in de tabel materialen glijden gelijkmatiger tijdens injectie dan andere merken getest.
      2. Laden van de injectiespuit op ~ 120 µL en trek de plunjer naar beneden maken een ruimte boven. Tikken met een pen totdat alle bubbels weg naar de top lucht. Houd de naald omhoog en zorgvuldig druk de plunjer Schakel alle lucht totdat een druppel op het puntje van de naald vormt. Er mag geen eventuele zichtbare belletjes aanwezig is, omdat dit kunnen leiden tot een embolie lucht die van het dier doden zal.
      3. Afwerking de plunjer deprimerend totdat er 100 µL in de injectiespuit door overtollige DNA oplossing leeg te maken in de oorspronkelijke microfuge buis. Zorgvuldig etiket indien nodig en plaats de geladen spuiten op een steriele gordijn voor het behoud van de steriliteit als de faciliteit waar werk wordt uitgevoerd kan geen recapping van naalden.
  3. Injectie chirurgie uitvoeren.
    1. De site voorbereiden voor chirurgie. Plaats een steriele draperen over de warmte pad en lege steriele chirurgische hulpmiddelen op de steriele gordijn zonder ze aan te raken. Pak de muis en plaatst u deze in het gezichtsveld. Passen verlichting om te verlichten van het gebied.
    2. Drie 3.15% chloorhexidine gluconaat en 70% isopropyl alcohol huid antiseptische swabs uit de pakketten verwijderen en plaatsen in de buurt van het dier.
    3. Omzetten in steriele chirurgische handschoenen. Werken in een cirkelvormige beweging begin op de site van de incisie, doekje het dier met een nieuwe chloorhexidine/alcohol doekje driemaal.
    4. Ga naar de site van de incisie zoals weergegeven in figuur 1A. Het knijpen van de huid met een pincet, laag gebruik schaar een snede aanbrengen op de huid ongeveer 1 cm van de rug en onder de ribbenkast. Zodra de gesneden site ongeveer 1 cm lang is, maak een gelijkaardige geknipte plaats hieronder, in de spier laag.
      Opmerking: Controleer de incisie de juiste lengte om de nier te gewoon nauwelijks komen via de incisie en vervolgens op hun plaats worden gehouden door de snede zelf. Te klein een ingesneden en de nier niet kunnen worden blootgesteld; te groot en de nier zal voortdurend uitglijden terug in de buikholte.
    5. Zoek de nier.
      Opmerking: Het kan zijn zichtbaar onder wit vetweefsel. De milt ligt ook aan de linkerkant van het dier. De kleur van deze organen kan visueel worden gedifferentieerd, zoals de milt een donker kastanjebruin is terwijl de nier een donker rood-oranje is. Het is niet wenselijk om te manipuleren van de milt, zoals het gemakkelijk kan worden gescheurd.
    6. Zonder het aanraken van de nier, zachtjes blootstellen van de buikholte door gestage, zachte druk op de buik met de vingers (figuur 2C). Gebruik gesloten pincet voorzichtig terug te duwen ongewenste organen in de buik indien nodig. Gebruik geen open pincet als dit schade aan de nieren of andere organen veroorzaken kan.
    7. Eenmaal de nier uit de buik, zachtjes afzonderlijk van de omringende vet net genoeg om te visualiseren de renal bekken, een kleine witte stip (figuur 1B). Overtollig vet duw naar één kant of indien nodig verwijderen. Zorg dat u niet te verwijderen van de bijnier, gelegen in de buurt van de bovenste pool van de nieren of de capsule van de nier.
    8. Met behulp van gesloten pincet duw omlaag aan de rechterkant van de nier, zodat het bekken renal blijft in het licht te begrijpen van de geladen insuline spuit met de rechterhand en houd deze evenwijdig aan het plateau met de naald die wees op de renal bekken (figuur 2E). Plaats de naald zorgvuldig in de renal bekken van de geïmmobiliseerdet nier zoals weergegeven in figuur 1B.
    9. Injecteer de oplossing snel binnen drie s. Ongeveer eenderde van de nier kan wissen en kleur veranderen naar wit.
      Opmerking: Het is gebruikelijk om het observeren van vocht ophoping in de nier capsule volgende injectie, alsmede de vorming van een hematoom. Wat schade is nodig om een voldoende niveau van DNA transfectie voor detectie.
    10. Houd de naald in plaats voor ongeveer 10 s om te voorkomen dat terugvoer van de oplossing. Zorgvuldig en langzaam Verwijder de naald. Het orgel aan de buikholte door voorzichtig rekken van de incisie-site en het gebruik van gesloten pincet retourneren
    11. Sutuur (geologie) de spier laag van het dier met 5-0 absorbeerbare hechtingen, het plaatsen van 2-4 onafhankelijke knopen.
    12. Sutuur (geologie) de huidlaag van het dier met 5-0 en 6-0 niet-absorbeerbare nylon hechtingen, plaatsen van 2-4 onafhankelijke knopen.
      Opmerking: Chirurgische instrumenten kunnen worden hergebruikt na het plaatsen in een steriele kraal bad en afgekoeld.

figure-protocol-1
Figuur 1. Juiste incisie site en naald plaatsing voor hydrodynamische renal bekken injecties. A) de incisie (rode lijn) moet gelegen ongeveer 1 cm van de rug en ongeveer 1 cm onder de ribbenkast van de muis. B) nadat de nier wordt blootgesteld via de flank incisie, moet de renal bekken bevinden als een kleine gelige clear/wit stip halverwege naar beneden van de nier. De injectie moet niet storen de renale ader, renale slagader of urineleider. De naald van de spuit insuline is geplaatst rechtstreeks in het bekken renal zoals tot een diepte van ongeveer 0,5 cm en snel gedeprimeerd in 2-3 s. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-protocol-2
Figuur 2. De chirurgische stappen uit te voeren van de hydrodynamische injectie renal bekken van plasmide DNA. A) pincet knijpen de huid zodat de chirurg maakt een incisie flank ~ 1 cm met een scalpel, eerst via de huidlaag, vervolgens door de spier laag. B) gebruiken twee paren van gesloten verlostang om te openen de chirurgische wond, de nier is gevisualiseerd in de buik, indien mogelijk. C) met zachte druk op de buik, zonder te raken alle organen direct, wordt de nier blootgesteld via de flank incisie. D) vet is zachtjes ontleed uit de nieren, verstoring van het zo weinig mogelijk om toegang tot de renal bekken. E) te drukken aan de rechterkant van de linker nier beter visualiseren de renal-bekken, de spuit wordt gehouden met de duim op de depressor en de naald wordt zorgvuldig maar stevig geplaatst in het bekken renal. F) volgende de < 3 s injectie, clearing kan worden waargenomen op het gebied van de nieren die het grootste deel van de injectie te ontvangen. G) steriele paarse vicryl absorbeerbare hechtingen worden gebruikt voor het maken van 2-4 onafhankelijke knopen in de spier laag. H) steriele blauwe nylon niet-absorbeerbare hechtingen worden gebruikt voor het maken van 2-4 onafhankelijke knopen in de huidlaag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. De terugwinning van chirurgie en postoperatieve bewaking.
    1. Muizen voorzien van pijnstiller volgens de instelling IACUC vereisten voor pijnbestrijding. Bijvoorbeeld beheren buprenorfine door subcutane injectie elke 8-12 h voor 48 h post-operatively als NSAID-gerelateerde nierschade dient te worden vermeden voor de studie.
    2. Houd de muizen op een warmte pad en bijgewoond door de onderzoeker tot volledig mobiel met sternale ligcomfort. Wanneer volledig is hersteld, kunt u de muizen terug naar een schone kooi met een kleine hoeveelheid beddengoed van hun kooi om stress te verminderen. Doen niet huis muizen onderworpen aan chirurgie met naïef muizen.
      Opmerking: De toestand van de muizen zullen snel verbeteren, verschijnen te hebben normale gedrag binnen 24-48 uur.
    3. Zoute vloeistoffen en verhoogde analgesie geven door muizen die verschijnen gestresst hun conditie te verbeteren. Als muizen niet snel herstellen, meet u het gewicht van de muis en euthanaseren van muizen die groter is dan 20% van hun aanvankelijke lichaamsgewicht hebben verloren. Euthanaseren verschijnen uremisch of anders stervende muizen. Mogelijke gezondheidsproblemen zijn gedetailleerd in tabel 1.
      Opmerking: Muizen soms verwijderen van hun buitenste hechtingen of de hechtingen losse vóór het sluiten van de wond komen. Arme wordt van de spier laag met een ongeschonden huid van een laag kan leiden tot een hernia op de site van de incisie, aangegeven door de bolling. In dat geval plaatst u de muisaanwijzer onder verdoving (Isofluraan is sneller dan ketamine/xylazine) en de chirurgische site met nieuwe hechtingen zo spoedig mogelijk te herstellen. Als niet-absorbeerbare huid hechtingen na 10-14 dagen blijven, verwijdert u deze uit. Muizen kunnen af en toe hun kooi-mates hechtingen verwijderen of vechten. Verwijder de agressor muizen naar hun eigen kooi met verrijking om hen te verhinderen de andere muizen kwetsen zodra dergelijk gedrag is vastgesteld.
    4. Wanneer gezondheid of experimentele eindpunten zijn bereikt, euthanaseren de muizen door kooldioxide inademing of Isofluraan overdosis gevolgd door een secundaire methode van euthanasie zoals cervicale dislocatie volgens de standaard gebruiksprocedure voor euthanasie in plaats van de instelling
OorzaakBeginAantal muizen beïnvloedSymptomenOnmiddellijke actieOplossing op lange termijn
DNA bevat endotoxines6-40 h na injectie.Mogelijke gevolgen voor elke muis die de verontreinigde DNA voorbereiding gegeven.Ademhalingsproblemen, tekenen van ernstige pijn, orgaanfalen, dood.De getroffen muizen euthanaseren. Test elke geïnjecteerd component voor endotoxines met Limulus Amebocyte Lysate.Endotoxine-vrije maxiprep kits en alleen steriele en nieuwe NaOH behandelde labware gebruiken. Gebruik een buffer commercieel gekocht, endotoxine-getest om te verdunnen van het DNA.
Anesthesie overdosisTijdens de operatie, hetzij vóór, hetzij na DNA injection.Alleen de jongere, kleinere of slankere muizen kunnen beïnvloeden.Staken ademhaling onderweg verwarming pad, urineren.Daling van de verdoving voor de resterende muizen.Controleer of de voorbereiding en protocol voor de nauwkeurigheid van de dosering. Uitsluiten "runts." Raadpleeg de dierenarts als passende dosis werd gebruikt.
Luchtbel in de spuit of naald gebruikt voor injectieDirect na de injectie renal bekken.Tenzij alle spuiten onzorgvuldig werden geladen, dit alleen van invloed op een muis.Happend naar adem.Controleer resterende spuiten voor tekenen van luchtbellen.Voorbereiding spuiten zorgvuldig, te tikken op de spuit om te bellen aan de onderkant verwijderen. Verbetering van de lichtomstandigheden aan de bubbels beter te visualiseren.
Opening van de chirurgische site12-72 uur na injectieEen of meer muizen. Soms de hele kooi.Gapende wond, meestal geen andere noodHerhaal wordt om te herstellen van de wond zorgvuldig onder Isofluraan verdoving met steriele techniek. Wellicht irrigeren met zoutoplossing of wond randen met een schaar verwijderen.Als alle muizen zeer korte of ontbrekende hechtingen hebben, is er mogelijk een muis te verwijderen, zodat muizen mogen worden gescheiden. Hechten techniek verbeteren. Onafhankelijke knopen te gebruiken.
Hernia op chirurgische site48 + h na injectieEen of meer muizen.Heuvel is zichtbaar op chirurgische site.Onder Isofluraan snijd anesthesie met steriele techniek, de genezen huid te onthullen van de hernia van spier laag. Vervangen van de organen in het buikvlies, herstellen van de spier laag met absorbeerbare draadjes en sluit de operatieplaats.Dit geeft aan arme wordt van spier laag. Hechten techniek verbeteren. Onafhankelijke knopen te gebruiken.
Nierfalen48 + h na injectieEen of meer muizen.Gewichtsverlies van > 20%, eventueel steeds uremisch, gebogen houdingSaline bieden en vergroten of analgesie verlengen. Indien geen verbetering wordt waargenomen, offeren de getroffen muizen.Veranderen de toestand van de ziekte van het dier te maken minder ernstig. Veranderen de transgenic minder sterke of afleidbare. Injecteren van muizen op een eerdere timepoint in de progressie van de ziekte.
Abces of infectieDagen tot weken na de operatieEen of meer muizen.Voelbaar abces of tekenen van sepsisDe getroffen muizen euthanaseren. Verzoek necropsie te bevestigen van vermoede infectie.Dit kan gebeuren wanneer de chirurgische voorwaarden en injecties niet voldoende steriel. De procedure is voor muizen met een normaal immuunsysteem maar verder moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen in het kader van immuungecompromitteerde dieren zoals die met cyclofosfamide behandeld.

Tabel 1. Tabel van potentiële gezondheidsproblemen die zich voordoen bij het protocol van de injectie renal bekken. Hoewel de genoemde gezondheidsproblemen niet gebruikelijk zijn, zijn er een aantal onderzoeker-gerelateerde fouten die in de loop van de procedure optreden kunnen. Deze tabel kan worden van hulp in preventie en de diagnose van gezondheidsproblemen, alsmede voor de uitvoering van mogelijke corrigerende maatregelen om dergelijke problemen in de toekomst te voorkomen. Met praktijk, moeten de onderzoekers verwachten zeldzaam gezondheidsproblemen en sterfte als gevolg van de procedure.

3. beoordeling van de injectie efficiëntie en transgenic effecten

  1. Een goed ontwikkelde assay voor het gewenste transgenic gebruiken om de efficiëntie van de Transfectie te beoordelen. Gebruik positieve en negatieve controles zorgvuldig om ervoor te zorgen dat de bepaling is specifiek.
    Opmerking: Afhankelijk van de keuze van de promotor, muizen zal waarschijnlijk hebben de sterkste transgenic expressie op dag 1; altijd binnen de eerste week na injectie.
  2. Levende dieren beeldvorming van luciferase uitvoeren door de invoering van 10 µg luciferase-uiten plasmide zoals verbeterde firefly luciferase tot het verdunde DNA voor injectie.
    1. Schoon alle oppervlakken die zijn blootgesteld aan muizen. Plaats de eerste kooi van muizen in de kamer en de zegel die op dicht. Zorgen dat er genoeg Isofluraan voor het experiment door het controleren van de gage; Als dat niet het geval is, Isofluraan toevoegen totdat het niveau de "max" lijn bereikt. De stroom van Isofluraan starten door te draaien aan de draaiknop Isofluraan naar 3.5 en de zuurstof aan 2.
    2. Injecteer elke muis door intraperitoneale injectie met 100 µL van ontdooide 30 mg/mL luciferine. Neem de tijd.
    3. Open de software om te controleren de imaging machine door te klikken op de oranje en gele muispictogram. Onder "Selecteer/Add User-ID" Kies de juiste initialen in het drop-down menu naast "User-ID". Klik op 'OK'. Op de bovenste menubalk, klik op "Verwerving" en selecteer "Autosave To..." in het drop-down menu. Selecteer de map of maak een nieuwe map voor het opslaan van de gegevens.
    4. Ga naar het afbeeldingsvenster acquisitie in de rechterbenedenhoek. Controleer of de automatische instellingen als volgt zijn: weggooien, drager wordt vastgelegd; F/Stop, 1 voor verlichte, 8 voor foto; Emissie Filter, open; Imaging modus, controleert alleen naast verlichtend, foto, Overlay en uitlijning. Klik op "initialiseren" om te initialiseren van het systeem en wacht voor initialisatie te voltooien, dan veranderen het "gezichtsveld" tot "E" om het imago van vijf muizen.
    5. Draai het ventiel voor de verdoving buizen zodanig dat de nosecones binnen de machine Isofluraan beheert. Plaats de dieren binnen de imaging machine in de gewenste volgorde op hun magen met hun rug geconfronteerd met de camera boven te visualiseren van de nier. Als meer dan één kooi is aan het image worden gemaakt, plaatst u de volgende kooi in de bedwelmingsruimte Isofluraan.
    6. 5-10 min na luciferine injectie, druk op "Verwerven" om de opname te maken.
    7. Klik op de "Tool palet" aan de rechterkant op "Afbeelding aanpassen." Onder "Kleurenschaal," door de "Min" Bar te verlagen totdat in expressie blijkt uit alle verwachte muizen, gevisualiseerd als paars boven elke nier muis. Als alle muizen geen expressie vertonen, terug van de muizen met 100 µL van luciferine en ten minste 3 min wachten reacquiring.
      1. Als de afbeelding is verzadigd pixels, verminderen de blootstellingstijd en opnieuw ophalen om het verkrijgen van een kwantitatieve beeld als de aanwezigheid van verzadigde pixels zal leiden tot onderschatting van de transfectie efficiëntie. De laagste mogelijke belichtingstijd is 0,5 s.
      2. Als de afbeelding alleen vaag genexpressie bij de eerste blootstellingstijd toont, verhoogt u de belichtingstijd tot 2 min en opnieuw ophalen. Telkens wanneer die de afbeelding is heroverd, zijn de gegevens autosaved in de gekozen map zodat alle afbeeldingen beschikbaar voor verdere analyse later zijn.
    8. Imaging Herhaal voor latere kooien van muizen.
    9. Verwijder de muizen uit de imaging machine. Uitschakelen van het gas. Schoon op de kamer, nosecones en imaging fase. Sluit het computerprogramma.
      Opmerking: De software wordt u gevraagd om te "Slaan Dataset." Dit verwijst naar de manipulaties aangebracht in de dataset, niet de gegevens zelf.
      1. Klik op "Ja" om de wijzigingen in de omvang en de regio's van belang (ROIs) opslaan. Klik op "Nee" als u wilt terugkeren naar de oorspronkelijke instellingen voor de afbeeldingen.
    10. Voor data-analyse, de software niet openen. Klik op de 'Tool palet"op"ROI Tools." Klik op het pictogram van de cirkel en klik op "1" in het drop-down menu om een nieuwe ROI in het afbeeldingsvenster zoals aangegeven door een rode ovaal met vier pleinen rond het. De grootte van de ROI aanpassen door het plaatsen van de muiscursor over een rood vierkantje en te slepen om het paarse gebied bedekken de ingespoten nier omsluiten.
      1. Met de cursor over een rode plein op de ROI, klik met de rechtermuisknop en selecteer "Dupliceren ROI" te maken van een nieuwe ROI in het afbeeldingsvenster en verplaats het naar de volgende muis. Herhaal de procedure totdat alle muizen in de afbeelding een ROI over de ingespoten nier.
      2. In het menu direct boven de afbeelding omzetten in "Eenheden" van "Graven" "Radiance (fotonen)." De ROI te exporteren gegevens, in de 'Tool palet', 'ROI Tools' Klik op het pictogram Potlood/liniaal om een werkblad van de metingen te maken. Gebruik de "Avg Radiance"-meting in de verdere analyse in de data analyse en statistiek programma van keuze.
  3. Verkleuring van de secties als beschreven11uitvoeren
    Opmerking: De injectie niet transfect de gehele nier even zodat verschillende afdelingen verschillende transfectie efficiëntie11zal vangen. Co injectie van parels zoals fluorescerende latex microsferen kan helpen identificeren van de regio's verwacht transgenic-positieve (figuur 3D)11. Optimalisatie van de kleuring protocol is uiterst belangrijk.
  4. Westelijke vlek ter identificatie van het gen van belang in de transfected nier uit te voeren.
    Nota: Oogst van organen voor eiwithoudende extracten moet gebeuren op het ijs. Opnieuw, gebruik niet een klein segment van het orgel als dit gebied kan niet hebben zijn transfected goed. Transfectie is ongelijk verspreid over het orgel dus combineren verschillende gebieden en bundelen van hen. Renal bekken hydrodynamische injectie van een plasmide produceren het hormoon Erytropoëtine resulteerde in een bescheiden toename van de hematocriet, dus de verwachting is dat secreted transgenic producten moeten worden gevonden in de omloop11.
  5. Voor langdurig op hoog niveau uitdrukking van transgenen, door een integratie vector-systeem te combineren met immunosuppressieve agenten zoals cyclophosphamide. De immuunrespons op de transgenic komt over de eerste verscheidene weken na injectie en is robuust11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De chirurgie en injectie techniek zijn eenvoudig uit te voeren, eenmaal beheerst, waarvoor geen belangrijke apparatuur of dure materialen. Als nieuw aan de flank-incisie nier chirurgie, worden één trainingsdag op verschillende muizen gepland voor euthanasie mag waarin de muizen niet herstelde volgende operatie zijn omdat de eerste poging tot deze operatie veel langer dan normaal duurt. Als alternatief, onderzoekers bekend zijn met soortgelijke technieken kunnen vinden het heel simpel. Vol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol wordt een robuuste methode om reproduceerbare genexpressie specifiek in de nier beschreven. We hebben het percentage van transfected door deze techniek worden in het bereik van 50-100%, afhankelijk van de leeftijd van de muis en de gevoeligheid van de uitlezing van de transgenic muizen gevonden in de handen van een matig ervaren chirurg. Het niveau van de genexpressie luciferase was boven achtergrond maandenlang in muizen piggyBac transposons ontvangen en volledig onderhouden wekenlang bij immuun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen en verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Een Career Development Award van het Department of Veterans Affairs [BX002797] gesteund L.E.W. en de National Institutes of Health [R01-DK095867] en American Heart Association [15GRNT25700209] gesteund J.C. De National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] en het Vanderbilt Center for Kidney Disease ondersteund M.H.W. Dit materiaal is het resultaat van werk ondersteund met middelen en het gebruik van de faciliteiten van het VA Tennessee Valley gezondheidszorg systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AnaSed XylazinePatterson Veterinary07-808-1947Verdovingsmiddel - Niet gecontroleerde stof
BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 InchCardinal Health309306Vereiste spuiten
BuprenexApotheker/DierartsAnalgesie - Gecontroleerde stof
Dynarex Wegwerpdoek DrapeThermo Fisher Scientific19-310-671Plaats over warmtepad
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Gebruik alleen endotoxine-vrij plasmide DNA
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positief ControlCharles RiverPC200Positieve controle voor endotoxinetest
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Enkele TestflesCharles RiverR13500Endotoxinetest
Extra Fijne Micro Dissectie SchaarRoboz Surgical InstrumentRS-5882Chirurgisch instrument
Fisherbrand Instant Sealing Sterilisatiezak - 9"Thermo Fisher Scientific01-812-51Voor het autoclaveren van chirurgische instrumenten
Gaymar WarmtepompParagon MedicalTP-700Watercirculerende warmtepomp
Germinator 500Roboz Surgical InstrumentDS-401Om chirurgische instrumenten tijdens de operatie te hergebruiken
Graefe ForcepsRoboz Surgical InstrumentRS-5136Chirurgisch instrument
Graefe WeefselforcepsRoboz Surgical InstrumentRS-5153Chirurgisch instrument
Halsey Naaldhouder, 5" LengteRoboz Surgical InstrumentRS-7841Chirurgisch instrument
Warmtepads - 15" x 21" - minimaal 3 nodigParagon MedicalTP22GVoor gebruik met Gaymar Warmtepomp
IsoFlo (Isoflurane, USP)Abbott Animal Health5260-04-05Voor beeldvorming en euthanasie
Isotec Isoflurane Delivery System VaporisorSmiths MedicalVCT3K2Voor beeldvorming en euthanasie
KetamineApotheker/DierartsVerdovingsmiddel - Gecontroleerde stof
KimwipesKimberly-Clark Professional34120Laboratoriumdoekjes
Living Image softwareCaliper Life SciencesVoor beeldvorming van levende dieren
LuciferinePerkin Elmer122796Voor beeldvorming van levende dieren
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000-US-CANSpectrofotometer voor DNA-meting
Prevantics WattensThermo Fisher Scientific23-100-110Voor huidchirurgie voorbereiding
Prolene 5-0 hechtdraad Taper 30"Thermo Fisher ScientificNC0256891Niet-absorbeerbare hechtdraad voor huid
Puralube Merk OogzalfPatterson Veterinary07-888-2572Om ogen vochtig te houden tijdens chirurgie
Trans IT - QR Hydrodynamische LeveringsoplossingMirus BioMIR-5240Hydrodynamische leveringsbuffer voor het verdunnen van DNA
Vicryl 5-0 Hechtingen J303HThermo Fisher ScientificNC9816710Absorbeerbare hechtingen voor spierlaag
Wahl Mini Arco ClippersMed-Vet International8787-1550Shaver voor huidvoorbereiding
Xenogen IVIS 200Caliper Life SciencesVoor beeldvorming van levende dieren

Referenties

  1. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  2. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
  3. Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233(2016).
  4. Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
  5. Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
  6. Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
  7. Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
  8. Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
  9. Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
  10. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
  11. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  12. Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
  13. Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
  14. Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
  15. Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
  16. Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
  17. Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
  18. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
  19. Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
  20. Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
  21. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Hydrodynamische injectieniertransfectieplasmid DNAlive animal imagingWestern blotimmunohistochemieflankincisiechirurgische proceduregenexpressie
Hydrodynamische Renal bekken injectie voor niet-virale expressie van eiwitten in de nier
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.