Methodenartikel

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

DOI:

10.3791/56358

⸱

3 december 2017

 , 
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GABAergic corticale interneuronen zijn een heterogene populatie van cellen die spelen een kritieke rol in de uitvoer van excitatory piramidale neuronen reguleren, alsmede het synchroniseren van de uitgangen van de piramidale neuron ensembles. Tekorten in interneuron functie zijn betrokken bij allerlei neuropsychiatrische aandoeningen, waaronder schizofrenie, autisme en epilepsie. De afleiding van corticale interneuronen vanaf embryonale stamcellen niet alleen voorziet in de studie van hun ontwikkeling en functie, maar verschaft inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van corticale interneuron-gerelateerde aandoeningen. Interneuronen ook de opmerkelijke capaciteit hebben om te overleven, migreren en integreren van host corticale circuits na transplantatie, waardoor ze ideale kandidaten voor gebruik in cel-gebaseerde therapieën. Hier presenteren we een schaalbare, uiterst efficiënte, bewerkt, embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde-methode voor de afleiding van de Nkx2.1-uiten interneuron progenitoren en hun nakomelingen van muis embryonale stamcellen (mESCs). De opdrachtregel Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever mESC, kunnen Nkx2.1 progenitoren of hun Lhx6-uiten na mitotische nakomelingen worden geïsoleerd via fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en vervolgens gebruikt in een aantal downstream toepassingen. We bieden ook methoden om te verrijken voor parvalbumin (PV) of Somatostatine (SST) interneuron subgroepen, die nuttig kan zijn voor het bestuderen van aspecten van lot bepaling of voor gebruik in therapeutische toepassingen die van interneuron deelgroep profiteren zouden-verrijkt transplantatiecentra.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In zowel mens als muizen, ongeveer de helft van alle corticale remmende interneuronen (CIns) hun oorsprong vinden binnen een voorbijgaande subcorticale structuur die bekend staat als de mediale ganglionaire eminentie (MGE), waar de neuroepithelial progenitorcellen van CIns en andere neuronale en gliale subgroepen express de transcriptiefactor Nkx2.11,2. CIn subgroepen of subtypen worden gedefinieerd door de doorsnede van de morfologische, neurochemical, elektrofysiologische en connectiviteit kenmerken3,4. De CIns MGE-afgeleid kunnen worden gegroepeerd in meestal niet-overlappende subgroepen op basis van hun uitdrukking van PV of SST, de uitdrukking van welke correlaten met name elektrofysiologische en connectiviteit tendensen5. Dysfunctie van interneuronen, vooral die in de PV deelgroep, heeft betrokken bij meerdere neuropsychiatrische stoornissen en ziekten6,7. Het algemene doel van deze methode is mitotische progenitoren stamcel-afgeleide en trekkende precursoren verrijkt voor PV of SST CIn lot voor de studie van biologie van de corticale interneuron en voor gebruik in cel-gebaseerde therapieën te produceren.

We hebben een schaalbare, uiterst efficiënte methode voor de afleiding van de Nkx2.1-uiten interneuron progenitoren en hun nakomelingen van mESCs ontwikkeld. Met behulp van een Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever mESC lijn8, Nkx2.1 progenitoren of hun Lhx6-uiten na mitotische nakomelingen kunnen worden geïsoleerd via FACS en vervolgens gebruikt in een aantal downstream toepassingen. Door het manipuleren van een aantal signaalroutes, duur van de cultuur, en de wijze van neurogenese, kunnen we miljoenen fluorescently geëtiketteerde interneuron precursoren geschikt voor tal van downstream toepassingen.

Hoewel er verschillende andere methoden bestaan voor het genereren van MGE-achtige voorlopercellen van mESCs9,10,11,12,13,14, onze werkwijze, die gebaseerd op de Wnt is antagonist XAV-939, is bijzonder efficiënt op het genereren van Foxg1/Nkx2.1 mede uiting van telencephalic voorlopercellen. Daarnaast verbetert de mogelijkheid om te kiezen voor interneuron progenitoren of hun post mitotische Lhx6-uiten nageslacht via ons systeem van de dubbele verslaggever, sterk het vermogen om verschillende progenitoren en hun nakomelingen te genereren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: De dubbele verslaggever mESC regel beschreven in dit protocol is beschikbaar op verzoek (sande@mail.med.upenn.edu).

1. Media voorbereiding

Opmerking: Warm alle media tot 37 ° C vóór gebruik in celkweek.

  1. Muis embryonale Fibroblast (MEF) media (voor het voorbereiden van 500 mL)
    1. Meng 50 mL foetale runderserum (FBS) 449 mL Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM), en filter via een 500 mL 0,22 µm porie filter eenheid.
    2. Voeg 1 mL antimicrobiële agent (50 mg/mL) na filtratie. Opslaan van de media bij 4 ° C voor maximaal 1 maand of aliquot en opslag bij ≤-20 ° C.
  2. N2 media (voor het voorbereiden van 500 mL)
    1. Voeg 5 mL L-alanine-L-glutamine (100 x) en 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) tot 489.5 mL DMEM: nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F-12), en filter via een 500 mL 0,22 µm porie filter eenheid.
    2. Voeg 1 mL antimicrobiële agent (50 mg/mL) en 5 mL N2 supplement-B na filtratie. Bewaar de media bij 4 ° C in het donker voor maximaal 1 maand.
  3. Serumvrij groeimedium (KSR) (voor het voorbereiden van 500 mL)
    1. Voeg 75 mL serumvrij middellange supplement, 5 mL L-glutamine (100 x), 5 mL MEM niet-essentiële aminozuren (MEM-NEAA) (100 x), en 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) aan 413.5 mL niet-glutamine met DMEM en filtreer door een 500 mL 0,22 µm porie filter eenheid.
    2. Voeg 1 mL antimicrobiële agent (50 mg/mL) na filtratie. Bewaar de media bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  4. Muis embryonale stamcellen media (voor het voorbereiden van 500 mL)
    1. Toevoegen van 75 mL stamcel rang FBS, 5 mL MEM-NEAA (100 x), 5 mL L-glutamine (100 x), en 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) aan 413.5 mL niet-glutamine met DMEM en filtreer door een 500 mL 0,22 µm porie filter eenheid.
    2. Voeg 1 mL antimicrobiële agent (50 mg/mL) na filtratie. Opslaan van de media bij 4 ° C in het donker voor maximaal 1 maand of aliquot en opslag bij ≤-20 ° C.

2. het kweken van mESCs

  1. Plaat mitotically inactieve MEF feeder cellen in MEF media op Weefselkweek behandeld platen op 3-4 x 104 cellen/cm2. Ten minste 12 uur voor hen te vestigen in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid en 5% CO2 voordat plating de mESCs toestaan. Als niet onmiddellijk wordt gebruikt, vervangt u de MEF media om de 3 dagen. Beschikken over MEFs als niet binnen 7 dagen van plating gebruikt.
  2. MESCs (dichtheid variëren van 1-4 x 104 cellen/cm2) toevoegen aan MEF platen in mESC media met muis leukemie remmende Factor (mLIF) (1000 U/mL). Incubeer de cellen bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid en 5% CO2.
  3. Passage van mESCs met behulp van trypsine-EDTA (0.05% trypsine) (1:5-1:10) zodra de schotel wordt ~ 70-80% heuvels of als de kolonies beginnen te raken. Dit meestal optreedt om de 2 dagen, maar kan duren tot 4 of 5 dagen afhankelijk van de dichtheid van de initiële beplating.
  4. Het handhaven van de mESCs op een MEF feeder laag in mESC medium te houden pluripotent.
  5. Voordat u begint differentiatie, passage de cellen ten minste eenmaal op gelatine gecoate platen zonder MEFs om te verdunnen uit de MEFs.
    1. Bereid gelatine gecoate platen door toevoeging van 0,1% gelatine in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca2 +/Mg2 + aan een schotel Weefselkweek behandeld en verlaten bij 37 ° C gedurende ten minste 1 h. plaat 1.5-2 x 106 cellen/10 cm plaat (2.7-3.6 x 104 cellen/cm2) en de cellen uit te breiden voor 2 dagen voor het begin van differentiatie toestaan.

3. differentiëren mESCs richting MGE-achtige van Telencephalic voorlopercellen

  1. Differentiatie dag (DD) 0 = "float cellen"
    1. Nadat de mESCs zijn gegroeid op gelatine gecoate platen voor 2 dagen, de media gecombineerd en wassen van de cellen een keer met PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. Voeg genoeg trypsine-EDTA (0.05% trypsine) om de dekking van het oppervlak van de plaat (meestal 4 mL trypsine-EDTA voor een 10 cm weefselkweek schotel) en plaats de cellen terug in de incubator bij 37 ° C met ≥95% relatieve vochtigheid en 5% CO2 voor 4 min.
    2. Na 4 min., doven de trypsine-EDTA 2 maal het volume met mESC media. De cellen overbrengen in een gepaste afmetingen centrifugebuis samen en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min. Na 5 min, verwijdert u de buis en gecombineerd de media zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 1 mL KSR:N2 media (1:1) met de BMP-remmer LDN-193189 (250 nM) en de Wnt remmer XAV-939 (10 µM).
    3. Het meten van de concentratie van de cel met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. Start cellen groeien als embryoid organen (EBs) door toevoeging van 75.000 cellen/mL in KSR:N2 media (1:1) met LDN-193189 (250 nM) en XAV-939 (10 µM) in niet-aanhanger weefselkweek gerechten. Incubeer de cellen bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid en 5% CO2.
  2. Bereiden op DD1, voor "landing" door coating Weefselkweek behandeld gerechten met poly-L-lysine (10 µg/mL in PBS met Ca2 +/Mg2 +) 's nachts cel (O/N) bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid of voor ten minste 1 uur.
  3. Op DD2, gecombineerd de poly-L-lysine en jas de platen met laminin (10 µg Fe/mL in PBS met Ca2 +/Mg2 +) O/N bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid.
    Opmerking: Terwijl O/N optimaal, zo weinig is 2 h kan volstaan. Als de platen worden niet gebruikt door de volgende dag, gecombineerd laminin vervangen door PBS zonder Ca2 +/Mg2 +en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.
  4. DD3 ("het land van cellen")
    1. Voordat u begint EB dissociatie, gecombineerd de laminin en laat de platen helemaal droog in de kap van een weefselkweek. Gebruik geen platen die glanzende of zichtbaar natte verschijnen. Breng de EBs met media in een tube van 15 mL en centrifuge voor 3-4 min op 15 x g of totdat de EBs hebben Ingehuld.
  5. De media gecombineerd en voeg 3 mL cell detachement oplossing met DNase (2 U/mL) en Incubeer bij 37 ° C met ≥ 95% relatieve vochtigheid en de buis elke 3 min 5% CO2 voor 15 min. zachtjes flick om te helpen bij EB dissociatie.
  6. Zodra de EBs zijn niet meer zichtbaar of 15 minuten zijn verstreken, toevoegen 6 mL KSR:N2 (1:1) met DNase (1 U/mL) en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g.
  7. Plaat van de cellen in de KSR:N2 (1:1) met LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 µM), en de Y-27632 van de ROCK-remmer (10 µM) op 4.5-5 x 104 cellen/cm2.

4. SST-verrijken Protocol: "DD12 GFP hoge Sonic Hedgehog (SHH)" (voortzetting vanaf stap 3.7)

  1. Wijzig op DD5, media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), en SSH (50 ng/mL).
  2. Weefselkweek platen voorbereiden opnieuw plating op dag 8 (stap 4.4) met behulp van de aanwijzingen in stap 3.2-3.3.
  3. Wijzig op DD7, media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), en SHH (50 ng/mL).
  4. Op DD8, plaat opnieuw de cellen.
    Opmerking: Terwijl deze stap niet noodzakelijk is, opnieuw plating de cellen kan verminderen vroeg-gesplitste, ongewenste celtypes. Opnieuw plating ook breekt ballen van cellen die stroomafwaarts immunohistochemische analyses te bemoeilijken, en verhoogt de efficiency van FACS op latere tijdstippen.
    1. Opnieuw plaat cellen, loskoppelen van de cellen van de plaat met trypsine-EDTA (0.05% trypsine) gedurende 5 minuten bij 37 ° C met ≥95% relatieve vochtigheid en 5% CO2. Doven van de trypsine-EDTA 2 maal het volume met KSR:N2 en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. filtert de cellen door een buis 40 µm filter om eventuele klontjes. Opnieuw plaat de cellen op 250.000 cellen/cm2 in N2/KSR (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), en Y-27632 (10 µM) met SHH (50 ng/mL).
      Opmerking: Als in plaats daarvan, de beslissing wordt genomen niet om opnieuw de cellen in de DD8 plaat, wijzigt u de media met KSR:N2 met SHH (50 ng/mL) elke 2 dagen vanaf DD7 tot DD12 en blijven toevoegen van IGF-1 (20 ng/mL) en FGF-2 (10 ng/mL) tot DD9.
  5. Op DD10, veranderen de media met KSR:N2 met SHH (50 ng/mL).
  6. Op DD12, voor het verkrijgen van cellen die zijn verrijkt voor SST subtypen, gebruiken FACS te isoleren van de Lhx6::GFP-slechts uiting geven aan de cellen.
    1. Als u wilt loskoppelen van de cellen, gebruiken in een niet-trypsine bevat cel-dissociatie reagens in plaats van trypsine-EDTA. Wassen cellen een keer met PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. Toevoegen van voorverwarmde niet-trypsine bevat cel-dissociatie reagens met DNase (2 U/mL) aan de cellen. Plaats ze in de incubator bij 37 ° C met ≥95% relatieve vochtigheid en 5% CO2 voor 10-30 min of totdat de cellen hebben losgemaakt. Tik zachtjes op de platen elke 5 min om te helpen de dissociatie.
      Opmerking: Voor DD11-12 culturen, slechts 10-15 min kan noodzakelijk zijn. Voor DD15-16 culturen, kan 30 min of meer worden verlangd voor volledige dissociatie.
    2. Zodra de cellen hebben volledig aan de plaat getild, gaan met FACS isolatie gebruikt standaard protocollen of gebruiken van de cellen in andere stroomafwaartse analyses.

5. PV-verrijken Protocol: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (voortzetting vanaf stap 3.7)

  1. Wijzig op DD5, de media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL) en IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Weefselkweek platen voorbereiden opnieuw plating op DD8 3.2-3.3 (stap 4.4) met behulp van de instructies beschreven in stappen.
  3. Wijzig op DD7, de media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL) en IGF-1 (20 ng/mL).
  4. Op DD8, plaat opnieuw de cellen zoals beschreven in stap 4.4 met de volgende uitzonderingen: wanneer opnieuw plating de cellen, vervangen SHH egaliseren agonist (SAG; 30 nM) en atypische PKC-remmer (aPKCi; 2 µM) toe te voegen. Samen genomen, de opnieuw identificatietekens media is nu N2/KSR (1:1) bevattende FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), en aPKCi (2 µM).
  5. Op DD10, door de media met KSR:N2 met aPKCi (2 µM) te veranderen.
  6. DD11
    Opmerking: op dit punt, Nkx2.1::mCherry+ cellen zijn verrijkt om PV CIns.
    1. Loskoppelen van de cellen van de plaat voor FACS met behulp van hetzelfde protocol beschreven in stap 4.6. Als de beslissing wordt genomen om te verzamelen van Nkx2.1::mCherry+ cellen op een latere dag van differentiatie, negeren deze stap.
  7. Op DD12, door de media met KSR:N2 met aPKCi (2 µM) te veranderen. Op DD14, door de media met KSR:N2 met aPKCi (2 µM) te veranderen. Op DD16, door de media met KSR:N2 met aPKCi (2 µM) te veranderen. Op DD17, verzamelen de cellen van de Nkx2.1::mCherry+ met behulp van hetzelfde protocol beschreven in stap 4.6.

6. PV-verrijken Protocol: "DD17 mCherry laag SHH" (voortzetting vanaf stap 3.7)

  1. Wijzig op DD5, de media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL) en IGF-1 (20 ng/mL). Wijzig op DD7, de media met KSR:N2 (1:1) met FGF-2 (10 ng/mL) en IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Wijzig op DD9, de media met KSR:N2 (1:1). Vanaf dit punt verder zijn geen extra groeifactoren nodig.
    1. Blijven veranderen de media om de 2 dagen tot het oogsten van de cellen op DD17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschreven in dit document is een gewijzigde versie van onze gepubliceerde protocollen15,16,17 en is geoptimaliseerd voor gebruik met onze Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC lijn. Door het toevoegen van de Wnt-remmer XAV-939 van DD0-5, gecombineerd met het opnieuw plating op DD8, bereiken wij robuuste Nkx2.1 inductie, waarin meer dan 50% van alle DAPI + kernen in cultuur oo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel deze methode is zeer effectief bij patronen J1-afgeleide mESCs (SCRC-1010), hebben we ervaren variabele succes met andere mESC lijnen en klonen isolaten. Bijvoorbeeld, Foxg1::venus mESCs (EB3-afgeleid; Danjo et al. 13) reageren slecht bij dit protocol en de Foxg1 inductie door DD12 is meestal over de volgorde van 1-2%. Om redenen die wij niet volledig begrijpen, produceert een andere Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever kloon (zogenaamde JQ59) dat werd geïsoleerd gelijktijdi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar Qing Xu voor de ontwikkeling van de Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual verslaggever mESC lijn evenals Jennifer Tyson Asif Maroof en Tim Petros voor hun vroege werk op het helpen ontwikkelen van dit protocol. Wij danken ook de CHOP stroom cytometry kern voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund door een NIH R01 MH066912 (nv) en de F30 MH105045-02 (DT).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bottle-top vacuum filter systemCorningCLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap CapThermoFisherCorning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)MTI-GlobalstemGSC-6101G1 vial van 7M MEFs is voldoende voor vier 10-cm TC-platen. Referenties: 29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2Ook bekend als antimicrobieel middel. Niet filteren met basismedium -- toevoegen na filtratie. Referenties: 9,11,36,37
N2 supplement-BStemcell Technologies7156Niet filteren met basismedium -- toevoegen na filtratie
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061Ook bekend als L-alanine-L-glutamine. Referenties: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR)ThermoFisher10828028Ook bekend als serumvrij mediumsupplement. Referenties: 9,11
L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018Ook bekend als glutaminevrij DMEM. Referenties: 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578Ook bekend als stamcelkwaliteit FBS. Referenties: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm)BD Falcon353003
Non-adherent steriele petrischaal (10cm)VWR25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF)ChemiconESG1107Niet invriezen, bewaar bij 4'C. Referenties: 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1% Gelatine oplossingATCCATCC PCS-999-027
LaminineSigmaL2020
Poly-L-lysineSigmaP6282
Trypsine-EDTA (0,05%)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501Ook bekend als celdissociatiereagens zonder trypsine. Referenties: 9,11
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074Opschorten in DMSO en bewaar bij -80'C in single-use aliquoten
XAV939Stemgent04-0046Opschorten in DMSO en bewaar bij -80'C in single-use aliquoten
rhFGF-2R&D Systems233-FBOpschorten in PBS met 0,1% BSA en bewaar bij -80'C in single-use aliquoten
rhIGF-2R&D Systems291-G1Opschorten in PBS met 0,1% BSA en bewaar bij -80'C in single-use aliquoten
ROCK-remmer (Y-27632)Tocris1254Opschorten in DMSO en bewaar bij -80'C in single-use aliquoten
Smoothened-agonist (SAG)Millipore566660-1MGOpschorten in H20 en bewaar bij -80'C in single-use aliquoten
rm Sonic Hedgehog/SHHR&D Systems464-SH-025Opschorten in PBS met 0,1% BSA en bewaar bij -80'C in single-use aliquoten
PKCζ Pseudosubstraatremmer, MyristoylEMD Millipore539624Opschorten in H20 en bewaar bij -80'C in single-use aliquoten

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841(2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956(2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622(2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron DifferentiationNkx2 1 ProgenitorsFluorescence Activated Cell SortingEmbryoid Body Monolayer MethodParvalbumin Interneuron EnrichmentSomatostatin Interneuron SubgroupsDual Reporter mESC LineCell Transplantation ProtocolNeural Fate Determination

Gerelateerde artikelen