In deze studie presenteren wij een gemakkelijke en efficiënte procedure voor de beoordeling van de verstoring van de bloed - hersenbarrière neurodegeneratieve omstandigheden. Onze om doel te bereiken, we geïnfundeerd ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine in muis jugular ader en de lekkage in de hersenen parenchym door fluorescentie microscopie geëvalueerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit door intraveneuze infusie van FITC-geëtiketteerden albumine in een muismodel van neurodegeneratieve ziekte
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Verstoring van de bloed - hersenbarrière (BBB) integriteit is een gemeenschappelijk kenmerk voor verschillende neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen. Hoewel het samenspel tussen verontrust BBB homeostase en de pathogenese van hersenafwijkingen verder onderzoek moet, kunnen de ontwikkeling en validatie van een betrouwbare procedure nauwkeurig detecteren BBB wijzigingen doorslaggevend zijn en vertegenwoordigen een nuttig instrument voor het voorspellen van potentieel ziekte gerichte progressie en de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
Hier presenteren we een gemakkelijke en efficiënte procedure voor het beoordelen van BBB lekkage in een neurodegeneratieve aandoening zoals die voorkomen in een preklinische muismodel van de ziekte van Huntington, waarin gebreken in de doorlaatbaarheid van BBB zijn duidelijk waarneembaar precociously in de ziekte. In het bijzonder de ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine, die in staat is om over te steken de BBB alleen wanneer deze bijzondere waardevermindering heeft ondergaan, is acuut geïnfundeerd in de halsslagader van een muis en de distributie in de districten vasculaire of parenchymal vervolgens wordt bepaald door fluorescentie microscopie.
Accumulatie van groen fluorescent-albumine in de hersenen parenchym fungeert als een index van afwijkende BBB permeabiliteit en, wanneer de quantitated met behulp van J beeld processing software, wordt gerapporteerd als groene fluorescentie intensiteit.
Inleiding
Homeostase binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) is een voorwaarde voor de goede communicatie en de functie van de neuronale cellen. De CNS parenchym is strak afgesloten vanuit de periferie door het endotheel bloed - hersenbarrière (BBB), die vertegenwoordigt de interface tussen de perifere bloedbaan en de hersenen en speelt een centrale rol in de cross-talk tussen deze twee wijken1 ,2. De BBB is een complex en dynamisch driedimensionale structuur hoofdzakelijk samengesteld uit gespecialiseerde micro-schip endotheliale cellen (ECs) aan elkaar gekoppeld via intercellulaire regulates complexen - strakke kruispunten (TJs) - en omringd door pericytes, neuron uitgangen en Astrocyt voet processen1,2.
Onder fysiologische omstandigheden, de extreem lage permeabiliteit van de intact BBB zorgt voor de strikte regelgeving voor het vervoer van voedingsstoffen en andere moleculen in en uit de hersenen en de CNS biedt een unieke bescherming tegen veranderingen in de samenstelling van het bloed dat van invloed kan zijn op neurale activiteit en tegen potentiële perifere beledigingen1,2,3.
Verstoring van BBB integriteit en de verbeterde permeabiliteit heeft al lang bekend bij een sleutelelement vormen voor veel neurologische en neurodegeneratieve stoornissen4 met inbegrip van de ziekte van Huntington (HD)5,6, echter , een propagative gebeurtenis in de loop van de ziekte is nog steeds onduidelijk of deze een dysfunctie is een oorzakelijke fenomeen. De timing van BBB verdeling ook blijft ongrijpbaar, opkomende bewijs van onze fractie e.a. blijkt evenwel dat verstoord BBB integriteit niet leidt tot een late evenement in de progressie van de ziekte, maar eerder een begin stap6,7 , 8, die op lange termijn gevolgen kan hebben.
Met dit in gedachten is het belangrijk te onthullen precociously BBB verdeling in neurodegeneratie teneinde strategieën handig te voorspellen van de progressie van de ziekte en schade aan de hersenen en aan het ontwikkelen van alternatieve en meer gerichte interventies kunnen met succes beperking van de klinische gevolgen van een dergelijke verstoring. Betrouwbare beeldvorming van BBB bijzondere waardevermindering is daarom van groot belang in zowel experimenteel onderzoek en klinische behandeling van hersenziekten.
In deze paper beschrijven we een succesvolle en eenvoudige procedure voor de evaluatie van de permeabiliteit van de BBB in een muismodel HD met behulp van de ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd-albumine (FITC-albumine). Extravasation van FITC-albumine, die normaal gesproken niet de barrière, in de hersenen parenchym kruisen werd gemeten als een index van BBB lekkage. Deze techniek is gemakkelijk aanpasbaar aan ratten en andere pathologische condities gekenmerkt door cerebrovasculature bijzondere waardevermindering9,10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
alle procedures op dieren werden goedgekeurd door de IRCCS Neuromed Animal Care Review Board en " Istituto Superiore di Sanità " (nummer toestaan: 1163/2015-PR) en werden overeenkomstig de richtsnoeren van de EU richtlijn 2010 / 63/EU voor dierproeven.
1. bereiding van FITC-albumine-oplossing voor injectie in de halsslagader
Opmerking: alle experimenten werden uitgevoerd in manifest (11 - week oud) HD R6/2-muizen en in leeftijd en geslacht-matched wild-type (WT) controle nestgenoten.
- Los FITC-albumine poeder (Zie Tabel van materialen) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 10 mg/ml.
Opmerking: Voor een optimaal resultaat dit moet voorbereid zijn zoet elke etikettering reactie.
2. Voorbereiding van apparatuur om te worden gebruikt tijdens operatie
- Lay-out de eerder gesteriliseerde met autoclaaf chirurgische instrumenten (Zie Tabel of Materials).
- Schoon de chirurgische bankje met alcohol (70% ethanol oplossing). Voorbereiden van het chirurgische gebied (45 x 45 cm) met een chirurgische steriele wegwerp handdoek draperen en het opzetten van de operationele stereomicroscoop.
3. Chirurgische ingreep voor de FITC-albumine infusie in de halsslagader
- opnemen muis lichaamsgewicht voor anesthesie.
- Verdoving muis met een intraperitoneale injectie (i.p) een passende dosis van Ketamine (100 mg/kg) - xylazine (10 mg/kg) oplossing.
- Monitor dierlijke sedatie door zachte teen snuifje terugtrekken reflex zoals aangetoond in Walantus et al. 11 , 12.
- plaats van de narcose muis in een liggende positie van de gezicht-omhooggaande en herstellen van de vier poten en de staart op de chirurgische werkbank met plakband.
- Nadat de muis is beveiligd, zorgvuldig scheren de juiste chirurgische marge op de hals met een elektrisch scheerapparaat (Zie Tabel van materialen) en het desinfecteren met Povidon-jodium oplossing en 70% ethanol.
- Droog het blootgestelde geschoren oppervlak met katoenen wissers.
- Voorzichtig optrekken het geschoren huid en maken een 1,5 cm lange longitudinale insnijding door scalpel, in de midclavicular lijn vanaf midden op de thorax en uit te breiden tot net onder de hals.
- Zorgvuldig apart bindweefsel te rekken met een tang onder microscopische observatie (5 X vergroting) om de externe halsslagader bloot.
- Zorgen voor een voldoende ruimte aan de rechterkant en aan de linkerkant van de halsslagader ter vergemakkelijking van het inbrengen van de naald van de 30½ G voor de infusie van de FITC-albumine oplossing.
- Het dier intraveneus injecteren (rechts halsslagader) langzaam (meer dan 3 min) met 100 µL van 10 mL/kg FITC-albumine met behulp van de 30½ G naald.
- Na 15 minuten de muis door onthoofding euthanaseren, snel verwijderen van de hersenen van de schedel als eerder beschreven 13 en dompel het gedurende 15 min. in minstens 10 x het volume van de hersenen zelf van vooraf gekoeld tolueen.
- De tolueen bevroren hersenen in een vooraf gekoeld buis verplaatsen en op te slaan in een vriezer-80 ° C tot histologische segmenteren.
4. Histologische afdelen van hersenen doordrenkt met FITC-albumine
- Embed bevroren hersenen in optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde (Zie Tabel van materialen) voorafgaand aan de cryostaat segmenteren.
- Serieel snijd de hersenen in 20 µm dik secties, met een cryostaat (Zie Tabel of Materials), en mount ze in Microscoop glas dia's.
- Voeren de FITC-albumine/laminin-kleuring voor de mede met behulp van een specifieke anti-laminin antistof (zie tabel van materialen) zoals eerder beschreven 6.
- Kort, incubeer secties met het primaire antilichaam anti-laminin (pAb 1:1000) afgelopen nacht en ga verder met passende secundair antilichaam geconjugeerd met Cy3.
- Dekglaasje aan dia's met montage medium dat 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (absorptie piek = 360 nm, uitstoot piek = 460 nm (Zie Tabel of Materials).
- Laat de dia aan droge overnachting bij 4 ° C in het donker.
- Observeren de fluorescentie kleuring onder een fluorescentie Microscoop (Zie Tabel van materialen) bij 20 X vergroting uitgerust met beide FITC (absorptie piek = 495 nm, uitstoot piek = 525 nm) en Cy3 filters (absorptie piek = 550 nm, emissie piek = 570 nm).
- Om de monsters te bekijken onmiddellijk na de kleuring, secure het dekglaasje aan op de hoeken gebruikmakend van nagellak en onderzoeken ze onder de Microscoop als hierboven (4.3.3).
5. Instelling van de fluorescentie Microscoop en verwerving van kleurenafbeeldingen
- de fluorescentie Microscoop als volgt instellen.
- Inschakelen de fluorescentie lamp ongeveer 10 minuten vóór gebruik. Inschakelen van de Microscoop, de aangesloten computer en de digitale camera. Uitvoeren van de software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel of Materials).
- Gebruik van de juiste doelstelling voor optimale signaal collectie en ruimtelijke resolutie, en selecteren van geschikte filters.
- Aanschaf voor kleurenbeelden
- de [live] opdracht in de software van de analyse van het beeld selecteren (Zie Tabel van materialen) en stel de parameters van de optimale verlichting voor elk filter.
- Selecteer de [freeze] opdracht om het kleurenbeeld enkellijns en toevoegen van de schaal-bar (' bewerken > branden schaal ')
- Slaat u elke afbeelding in de ' .tiff ' formaat.
- Kanalen samenvoegen in een enkele afbeelding door te selecteren ' bestand > samenvoegen kanaal ' en sla het in de
- tiff ' formaat.
- Verwerven een minimum van vier vierentwintig bitskleuren pictures (2200 µm x 3400 µm) per segment van de hersenen (6 afdelingen per dia).
6. Beoordeling van FITC-albumine Extravasation
- analyseren van de intensiteit van de fluorescentie voor elk één kanaal met behulp van de vrij beschikbare ImageJ 14 , 15.
- De totale fluorescent signaal intensiteit van de FITC-albumine door de totale CY3-Laminin fluorescerende intensiteit per elke afbeelding te normaliseren en verslag van de extravasated albumine buiten de vaartuigen als groene fluorescentie intensiteit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Juiste infusie van FITC-albumine in de halsslagader resultaten in de extravasation van de groene fluorescentie-tracer uit de bloedbaan in de parenchymawhen van de hersenen die de BBB is gecompromitteerd6. Onder fysiologische omstandigheden, distributie van geïnfundeerd fluorescerende albumine is beperkt tot de binnenkant van de bloedvaten van de hersenen en geen signaal in de omliggende gerelateerde gebied en/of hersenen parenchym is aantoonbaar (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De techniek die we hier beschrijven is vooral handig voor het opsporen van BBB lekkage onder ziekten van de hersenen. BBB disfunctie is het verkrijgen van aandacht als een gemeenschappelijk kenmerk van diverse neurologische aandoeningen,4. Wij vroeger deze aanpak voor het beschrijven van de vervroegde derangement van BBB integriteit in een muismodel van een zeldzame neurodegeneratieve ziekte zoals HD6.
Deze methode neemt voordeel van de relatieve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang om bekend te maken
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door "Fondazione Neuromed" en gefinancierd door het Italiaanse ministerie van gezondheid "Ricerca Corrente" aan V.M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Albumine-fluorescine isothiocyanaatjeugde | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminine | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-konijn gemaakt in geit | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Dekglasjes 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Montage Media | VECTOR | H-1500 | Montage media met DAPI |
| iNSu/Light Insulin Wegwerpinjectiespuit | RAYS Health & Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Naald voor wegwerpinjectiespuit voor insuline |
| Scalpelgreep | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Wegwerp scalpelblad | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fijne Iris schaar 10,5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont pincet #5745 45° 0,10 x 0,06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe pincet 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont pincet #5 0,1 X 0,06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medische pleister | Medicalis | 34788 | |
| Steriele wegwerpdoek | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopisch microscoop | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optische verlichter LED-licht (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optische verlichter voor stereoscopisch microscoop |
| Eclipse Ni-U Microscoop | Nikon | 932162 | Epifluorescentiemicroscoop |
| Microscoop digitale camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscoopcamera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscooplamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysesoftware |
| Elektrisch scheerapparaat | Gemei | GM-3007 |
Referenties
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40(2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316(2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615(2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239(2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404(2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419(2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
