Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.

Samenvatting

Studies op het gebied van de microbiologie, is afhankelijk van de uitvoering van een breed scala aan methoden. In het bijzonder bijdraagt de ontwikkeling van geschikte methoden aanzienlijk aan het verstrekken van uitgebreide kennis van het metabolisme van micro-organismen groeien in chemisch welbepaalde media met unieke stikstof en koolstof bronnen. Daarentegen blijft het beheer via metabolisme van meerdere nutriënten bronnen, ondanks hun grote aanwezigheid in natuurlijke of industriële omgevingen, vrijwel onontdekte. Deze situatie is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan geschikte methoden, die onderzoek belemmert.

Wij rapporteren een experimentele strategie kwantitatief en grondig verkennen hoe metabolisme werkt als een nutriënt wordt geleverd als een mengsel van verschillende moleculen, dat wil zeggen, een complexe bron. Hier beschrijven we de toepassing ervan voor de beoordeling van het partitioneren van meerdere bronnen van stikstof via het metabolische netwerk van gist. De werkstroom combineert informatie verkregen tijdens stabiele isotoop tracerproeven met geselecteerde ¹³C- of ¹⁵N-geëtiketteerden substraten. Het eerste bestaat uit parallel en reproduceerbare fermentatie in hetzelfde medium, waarin een mengsel van N-bevattende moleculen; een geselecteerde stikstofbron heet echter elke keer. Een combinatie van analytische procedures (HPLC, GC-MS) wordt uitgevoerd om te beoordelen van de labeling patronen van gerichte verbindingen en te kwantificeren van de consumptie en het herstel van substraten in andere metabolieten. Een geïntegreerde analyse van de volledige dataset geeft een overzicht van het lot van verbruikte substraten binnen cellen. Deze aanpak vereist een nauwkeurige protocol voor het verzamelen van monsters – vergemakkelijkt door een robot-assisted systeem voor online bewaking van fermentatie- en de verwezenlijking van talrijke tijdrovende analyses. Ondanks deze beperkingen toegestaan het begrip, voor de eerste keer, het partitioneren van meerdere bronnen van stikstof tijdens het metabolische netwerk van gist. Wij toegelicht van de herverdeling van stikstof uit meer overvloedige bronnen naar andere N-verbindingen en de metabole oorsprong van vluchtige moleculen en Proteïnogeen aminozuren bepaald.

Inleiding

Begrip is hoe microbiële metabolisme werkt een belangrijke kwestie voor het ontwerp van efficiënte strategieën ter verbetering van fermentatieprocessen en het moduleren van de productie van fermenterende verbindingen. Ontwikkelingen in de genomica en functionele genomica in deze laatste twee decennia in belangrijke mate bijgedragen tot het verruimen van de kennis van de topologie van metabole netwerken in vele micro-organismen. Toegang tot deze informatie heeft geleid tot de ontwikkeling van onderwijsleermethoden die tot doel voor een uitgebreid overzicht van cellulaire functie^{1 hebben}. Deze methodologieën is vaak afhankelijk van een model-gebaseerde interpretatie van meetbare parameters. Deze experimentele gegevens omvatten, aan de ene kant metaboliet opname en productie, en aan de andere kant, kwantitatieve intracellulaire informatie die wordt verkregen uit de isotoop tracer experimenten. Deze gegevens, verschaffen essentiële informatie voor de aftrek van de in-vivo -activiteit van verschillende routes in een gedefinieerde metabolische netwerk^2,3,4. Op dit moment de beschikbare analytische technieken alleen inschakelen voor de nauwkeurige detectie van labeling patronen van moleculen bij het gebruik van een isotoop van één element en eventueel wanneer mede labelen met twee isotopische elementen. Bovendien onder de meeste omstandigheden van de groei bestaat de koolstofbron alleen uit één of twee-verbindingen. Bijgevolg waren benaderingen gebaseerd op de C-isotopische traceurs ¹³uit koolstof ondergronden breed en met succes toegepast voor de ontwikkeling van een compleet begrip van de koolstof metabolische netwerk operaties^{5,6,7 ,8}.

Daarentegen in veel natuurlijke en industriële omgevingen, de beschikbare stikstof resource dat microbiële groei ondersteunt vaak bestaat uit een breed scala van moleculen. Bijvoorbeeld, tijdens de wijn of bier gisting, wordt stikstof geleverd als een mengsel van 18 aminozuren en ammonium bij variabele concentraties⁹. Deze array van N-verbindingen die toegankelijk voor anabolism zijn maakt deze complexe media voorwaarden sterk verschilt van de gangbare waarden voor fysiologische studies, zoals de laatste worden bereikt met behulp van een unieke bron van stikstof, meestal ammonium.

Over het geheel genomen geïnternaliseerd stikstof verbindingen kunnen direct worden opgenomen in eiwitten of catabolized. De structuur van het netwerk van stikstof metabolisme in vele micro-organismen, met inbegrip van de gist Saccharomyces cerevisiae, is zeer complex overeenkomstig de diversiteit van substraten. Schematisch, is dit systeem gebaseerd op de combinatie van de centrale kern van stikstof metabolisme die de interconversion van glutamine, glutamaat en α-ketoglutarate^10,11, met transaminases en deaminases katalyseert. Via dit netwerk, amine groepen uit ammonium of andere aminozuren worden verzameld en α-keto zuren uitgebracht. Deze tussenproducten zijn ook synthetized via centrale koolstof metabolisme (CCM)^12,13. Dit groot aantal vertakte reacties en tussenproducten, betrokken bij zowel het katabolisme van exogene stikstof bronnen en het anabolisme van Proteïnogeen aminozuren, vervult de anabole eisen van de cellen. De activiteit via deze verschillende met elkaar verbonden routes resulteert ook in de uitscheiding van metabolieten. In het bijzonder, kunnen α-keto zuren worden omgeleid via de Ehrlich pathway hogere alcoholen en hun acetaat ester derivaten¹⁴, die essentiële bijdragen aan de zintuiglijke profielen van producten te produceren. Vervolgens, speelt de werking van stikstof metabolisme een belangrijke rol in de productie van biomassa en de vorming van vluchtige moleculen (aroma).

De reacties, enzymen en genen die betrokken zijn in stikstof metabolisme zijn uitvoerig beschreven in de literatuur. Echter heeft de kwestie van de verdeling van meerdere bronnen van stikstof tijdens een metabolische netwerk nog niet aangepakt. Er zijn twee belangrijke redenen die dit gebrek aan informatie verklaren. Ten eerste, gezien de belangrijke complexiteit van het netwerk van stikstof metabolisme, een grote hoeveelheid van de kwantitatieve gegevens is vereist voor een compleet begrip van de werking ervan die niet beschikbaar was tot nu toe. Ten tweede, vele experimentele beperkingen en beperkingen van analytische methoden voorkomen de uitvoeringvan benaderingen die voorheen werden gebruikt voor de opheldering van CCM functie.

Om deze problemen, kozen we voor een systeem-niveau-aanpak die is gebaseerd op het combineren van gegevens uit een groot aantal isotopische tracerproeven te ontwikkelen. De workflow omvat:
-Een set van fermentatie uitgevoerd onder de dezelfde milieu-omstandigheden, terwijl een andere geselecteerde nutriënten bron (substraat) telkens heet.
-Een combinatie van analytische procedures (HPLC, GC-MS) voor een nauwkeurige bepaling, in de verschillende stadia van de gisting, van de resterende concentratie van gelabelde substraat en de concentratie en de isotopische verrijking van stoffen die zijn afgeleid van het katabolisme van het gelabelde molecuul, met inbegrip van afgeleide biomassa.
-Een berekening van het saldo van het massale en isotopische voor elk verbruikt gelabelde molecuul en een verder geïntegreerde analyse van de dataset te verkrijgen van een globaal overzicht van het beheer van meerdere nutriënten bronnen door micro-organismen door middel van de bepaling van flux ratio 's .

Voor de toepassing van deze methode, moet aandacht worden besteed aan het reproduceerbare gedrag van de stam/micro-organisme tussen culturen. Monsters uit verschillende culturen moeten bovendien worden genomen tijdens de dezelfde welomschreven gisting vooruitgang. In de experimentele werk die zijn gerapporteerd in dit manuscript, wordt een robot-assisted-systeem gebruikt voor online bewaking van fermentatie ter verantwoording voor deze beperkingen.

Bovendien is het essentieel om een reeks van gelabelde substraten (samengestelde aard en positie van het label) die geschikt is om het wetenschappelijke probleem van de studie te kiezen. Hier, ¹⁵N-geëtiketteerden ammonium, glutamine en arginine uitgekozen als de drie grote stikstof bronnen gevonden in druivensap. Hierdoor konden beoordelen van het patroon van stikstof herverdeling van verbruikte verbindingen naar de Proteïnogeen aminozuren. Wij ook gericht op het onderzoeken van het lot van de ruggengraat van de koolstof van de verbruikte aminozuren en hun bijdrage aan de productie van vluchtige moleculen. Om te voldoen aan deze doelstelling, uniform ¹³C-gelabeld leucine, werden isoleucine, threonine en valine opgenomen in de studie als aminozuren die zijn afgeleid van grote tussenproducten van het leertraject Ehrlich.

Over het geheel genomen verkenden we kwantitatief hoe gist beheert een complexe stikstof resource door herverdeling van exogene stikstof bronnen om te voldoen aan haar anabole eisen hele gisting tijdens het bovendien het verwijderen van de overdaad aan koolstof precursoren als vluchtige moleculen. De experimentele procedure gemeld in dit document kan worden toegepast om te onderzoeken van andere meerdere nutriënten bronnen gebruikt door een andere micro-organismen. Het lijkt een adequate aanpak voor de analyse van de gevolgen van genetische achtergrond of omgevingsfactoren op de metabolische gedrag van micro-organismen.

Protocol

1. gisting en bemonstering

1. Voorbereiding van de media en fermentoren
   Opmerking: Alle de fermentatie zijn uitgevoerd in parallel, met behulp van dezelfde stam en hetzelfde chemisch gedefinieerde synthetische medium (SM, samenstelling in tabel 1gegeven), waarin een mengsel van ammonium en aminozuren zoals stikstof^{15 bronnen}. Voor elke gisting, een enkele stikstof samenstelling vindt u uitsluitend in een uniform gelabelde ¹³C of ¹⁵N formulier (100%), terwijl de anderen labelloze blijven. Voor elke stikstofbron van gelabelde die in de reeks experimenten wordt gebruikt (hier: ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-Gln, U -¹³C6-Leu, U -¹³C5-Val, U -¹³C6-Ile, U -¹³C4-Thr), twee fermentoren worden bereid. Voor elke voorwaarde, is dubbele gisting uitgevoerd met behulp van alleen labelloze moleculen (7 controle fermentatie).
   1. Voor elke N-bron te worden bestudeerd, bereiden van 500 mL voor SM medium dat alle bronnen van de stikstof vermeld in tabel 1, met uitzondering van de verbinding bevat moet worden gebruikt bij 100% label formulier.
      Opmerking: Het gelabelde molecuul wordt toegevoegd in de volgende stappen.
   2. Pasteuriseren van elk medium in een maatkolf van 1 L (10 min, 100 ° C) met een magnetische roeren bar. Weeg de juiste hoeveelheid gelabelde molecuul te bereiken de uiteindelijke concentratie die wordt vermeld in tabel 1 en los het op in het medium.
   3. Steriliseren het medium gebruik een wegwerp vacuüm filtratie-systeem (celluloseacetaat membraan, 0,22 µm). Met behulp van een steriele maatcylinder, verdeel het medium tussen twee vooraf gesteriliseerd fermentoren (250 mL) die bevatten een magnetische roeren bar en zijn uitgerust met sloten van de gisting om te voorkomen dat de toetreding van zuurstof maar toestaan dat de release van CO₂.
   4. Verwarm de gisting kolven tot 28 ° C door ze te plaatsen op de incubatie-kamer voor 1 nacht (temperatuur ingesteld op 28 ° C).
2. Inoculatie en monitoring van fermentatie
   1. Groeien S. cerevisiae stam in steriele buizen met 10 mL van YPD medium bij 28 ° C met schudden (150 rpm) voor 12u. Pipetteer vervolgens 1 mL van YPD preculture en het overbrengen van 10 mL voor SM medium (in 15 mL steriele buizen). Incubeer de cultuur voor 12u bij 28 ° C met schudden (150 rpm).
   2. Klik onder laminaire flow, een aliquoot preculture verzamelen en kwantificeren van de bevolking van de cel met behulp van een elektronische deeltjes teller die is uitgerust met een 100 µm-diafragma. Centrifugeer het preculture (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) en Suspendeer de pellet in een passende hoeveelheid steriel water om een eindconcentratie van 2.5 x 10⁸ cellen/mL. Inoculeer elke gister met 1 mL van de celsuspensie.
      Opmerking: De robot-systeem waarmee de voortgang van de gisting is beschreven in Figuur 1.
   3. Het fermentatie-platform voor te bereiden door het installeren van de fermentoren in de gidsen van de steun die naar behoren zijn geplaatst op de opzwepende platen van 21-positie en het opzwepende tempo vastgesteldop 270 rpm. Om te beginnen de on-line monitoring van elke gisting, de robot-control toepassing start, vervolgens klikt u op "begin test" en selecteer het volume van de gisting (300 mL) worden uitgevoerd.
   4. De weergegeven interface staat de vermelding van het aantal en de positie van fermentoren op het platform. Om ervoor te zorgen dat dit gebeurt, klik met de rechtermuisknop op de locatie van de sleuf en kies "enable" om te activeren het toezicht van de gister gelegen op deze positie.
   5. Initialiseer de calculatiesoftware, permanent uitgevoerd op het systeem, voordat de overname van het gewicht. Klik op de "Initialiser"-knop en bevestig met "ok". Klik op de knop"Start" van de toepassing van de robot-controle om te beginnen met de acquisities van gewicht.
3. Bemonstering
   Opmerking: Voor elke gister, monsters worden genomen wanneer de CO₂ productie (waarde on-line op de computer met de calculatiesoftware) de vereiste set-punt bereikt: 5, 10, 40 en 90 g/L in deze studie.
   1. Bemonstering procedure voor culturen met gelabelde verbindingen.
      1. Centrifugeer twee 6 mL monsters (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Opslaan en opslaan van de bevroren supernatant in twee aliquots bij-80 ° C. Wassen van de pellets tweemaal met 5 mL gedestilleerd water en winkel bij-80 ° C voor de meting van isotopische verrijking.
   2. Bemonstering van de procedure voor culturen zonder gelabelde verbindingen
      1. Oogst 10 mL van de cultuur, die zal worden gebruikt voor de bepaling van het droog gewicht. De cellen van twee monsters van 10 mL pellet door middel van centrifugeren (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). De pellets tweemaal met 10 mL gedestilleerd water wassen en bewaar ze bij-80 ° C voor de bepaling van eiwit en amino acid content.

2. kwantificering van verbruikte stikstof bronnen

1. Enzymatische bepaling van de concentratie van de resterende ammoniak
   Opmerking: De bepaling van de concentratie ammoniak in supernatant wordt uitgevoerd met behulp van een commerciële enzym gebaseerde kit; alle de reagentia worden geleverd door de fabrikant.
   1. Een standaard ammoniakoplossing (61.4 mg/L) voor te bereiden door het oplossen van 25 mg nauwkeurig gewogen (NH₄)₂dus₄ in een maatkolf van 100 mL.
   2. Om te voldoen aan de instructies van de fabrikant, voert u een verdunning 1:2 van de monsters die zijn genomen vóór gisting en bij 5 g/L van CO₂ vrijgegeven. Breng de pH van de monsters naar ongeveer 8 door toevoeging van 1 M KOH. Neem nota van het toegevoegde volume en daarmee rekening in de verdunningsfactor.
   3. In 4 mL spectrofotometer cuvettes, mix 100 µL van monster (verdund indien nodig), gedistilleerd water of standaard ammoniumhydroxide-oplossing met 2 mL reagens 1 (0,75 mM ADP en 30 U/mL Glutamaat dehydrogenase in pH 7,8 buffer) en 500 µL van het reagens 2 (1.3 mM NADH). Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en lees NADH absorptie bij 340 nm (A1).
   4. Voeg 500 µL van het reagens 3 (60 mM α-ketoglutaraat in pH 8 buffer), Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en lezen de NADH absorptie bij 340 nm (A2).
   5. Bereken met behulp van ammoniak concentratie:
      C_ammoniak (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)_monster- (0.839 x A1-A2)_{gedestilleerd water}]
   6. Controleer of de juiste concentratie wordt verkregen met de standaard oplossing.
2. Chromatografische bepaling van residuele aminozuur concentraties
   Opmerking: De bepaling van aminozuur concentraties in supernatant wordt bereikt met behulp van een systeem voor de analyse van specifieke aminozuur dat is gebaseerd op ionenwisselingschromatografie met post kolom bewerking van N-verbindingen met ninhydrine, waarmee hun Colorimetrische detectie.
   1. Bereid een referentie-oplossing door het toevoegen van 200 µL van een commerciële mengsel van neutrale en zure aminozuren, 200 µL van een commerciële mengsel van fundamentele aminozuren en 200 µL van 2.5 mM glutamine aan 400 µL van 200 mM lithium citraat buffer, pH 2.2. Deze oplossing chemisch welbepaalde verwijzing wordt behandeld als een monster.
   2. Voeg toe 200 µL van 25% (m/v) sulfosalicylic zure oplossing waarin 2.5 mM norleucine (interne standaard) aan 800 µL van monster, tot het verwijderen van moleculen met een hoog molecuulgewicht. Incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C, centrifuge (3000 x g, 10 min, 4 ° C) en filter door een membraan porie-grootte nitrocellulose 0.22-µm (spuit systeem).
   3. In de programmeur software, klik op de knop "Uitvoeren" om te beginnen de vloeistofchromatografie (LC) analyses met de analyzer uitgerust met een catie-wisselingskolom (lithium formulier). Elueer de aminozuren met opeenvolgende lithium buffers maken zowel een pH verloop en een verloop in Contra ion concentratie in combinatie met een temperatuurgradiënt (tabel 2).
   4. Kwantificeren van de stikstofverbindingen na ninhydrine bewerking door een spectrofotometrische detector bij 570 nm (paarse kleur: reactie tussen ninhydrine en amine groep aminozuren) en 440 nm (gele verkleuring: reactie tussen ninhydrine en imine groep Proline).
   5. Het uitvoeren van een één-punt interne kalibratie met behulp van de referentie-oplossing en norleucine als een interne standaard voor het berekenen van de concentraties van aminozuren in de monsters met behulp van software van de fabrikant.

3. kwantificering van Proteïnogeen aminozuren

1. Meting van droge cel gewicht
   1. 10 mL van de cultuur wordt gefiltreerd door een nitrocellulose filter (porie grootte 0,45 µm) dat is vooraf gewogen in een aluminium beker, met behulp van een vacuüm apparaat. Wassen tweemaal met 50 mL gedestilleerd water.
   2. Plaats de filter in de aluminium cup en drogen in een oven van warmte bij 105 ° C gedurende 48 h (totdat geen verdere verandering in gewicht wordt geconstateerd) voordat het filter in de beker tegenonderzoek. Bereken het gewicht verschil.
   3. Bereken het gemiddelde van ten minste 3 onafhankelijke metingen nauwkeurig bepalen het gewicht van de droge cel van de gist-cultuur.
2. Kwantificering van het eiwitgehalte van cellen
   Opmerking: De kwantificering van de eiwitoplossing van de cellen wordt uitgevoerd ten minste in drievoud met behulp van labelloze cel pellets die zijn verkregen als beschreven in punt 1.3.2.
   1. Pak van eiwitten door toevoeging van 1 mL van DMSO oplossing (50% v/v) voor bevroren pellets en Incubeer bij 105 ° C gedurende 1 uur in een oven van droge hitte.
   2. Kwantificeren van het eiwitgehalte in de extracten van DMSO met behulp van de biochemische colorimetrische bepaling die is gebaseerd op de reductie van proteïnen van Cu⁺⁺ tot Cu⁺ fosfaationen die verder zijn neergeslagen door bicinchoninic zuur in een blauwe complex (BCA assay).
3. Bepaling van de relatieve bijdragen van aminozuren in eiwitten
   Opmerking: Het profiel van Proteïnogeen aminozuren geschiedt ten minste in drievoud van labelloze cel pellets (1.3.2.).
   1. Bereid een geoxideerde uittreksel door het opschorten van de cel pellet in 200 µL van permierenzuur zuur (90% mierenzuur, 10% waterstofperoxide). Incubeer gedurende 4 uur bij 4 ° C en stop de reactie door de toevoeging van 33,6 mg natriumsulfaat.
      Opmerking: De oxidatie stap is vereist voor het omzetten van cysteïne en methionine in methionine sulfon en cysteische zuur, dat verder zal worden gekwantificeerd door ionenwisselingschromatografie. Echter, sommige aminozuren (tyrosine, fenylalanine, histidine en arginine) worden gedenatureerd tijdens de behandeling van de oxidatie. Bijgevolg worden twee hydrolysaten (met en zonder oxidatie) bereid.
   2. 800 µL 6N HCL toevoegen aan cel pellets of uittreksel geoxideerd en Incubeer het monster in een hermetisch gesloten glazen buis voor 16 h bij 110 ° C in een oven van droge hitte. Voeg 200 µL van 2.5 mM norleucine en HCl verwijderen met een stikstofstroom. Wassen (resuspending van het gedroogde extract en vervolgens het verwijderen van de vloeistof met een stikstof-stream) tweemaal met 800 µL van gedistilleerd water en daarna met 800 µL van ethanol. Duren in 800 µL van 200 mM lithium acetaat buffer, pH 2.2.
      Opmerking: Aandacht moet uitgaan naar de incubatietijd voor de hydrolyse zoals sommige aminozuren niet stabiel onder zure omstandigheden zijn. De Fractie van de tryptofaan in eiwit wordt geschat uit gegevens gevonden in de literatuur¹⁶, zoals dit aminozuur is volledig gedenatureerd tijdens HCl hydrolyse.
   3. Een standaard hydrolysaat voorbereiden op de interne single-punts kalibratie. 160 µL van een commerciële oplossing van gehydrolyseerde aminozuren aan 840 µL van 200 mM lithium acetaat buffer, pH 2.2, waarin 625 µM methionine sulfon, 625 µM cysteische zuur en 625 µM norleucine toevoegen.
   4. Het bepalen van de relatieve concentraties van aminozuren in eiwitten met de chromatografische methode beschreven in punt 2.2.
4. Berekeningen
   1. Bereken het percentage van de gewicht van elk aminozuur in eiwitten door de gemeten bedrag van elk aminozuur (mg/L) te delen door het totale bedrag van aminozuur dat werd gemeten in het eiwit extract (som in mg/liter).
   2. Dit percentage te vermenigvuldigen met de concentratie van proteïnen toe in de cultuur (mg/L), dat wil zeggen, het product tussen het eiwitgehalte van de biomassa en de droge stof, om te beoordelen van de concentratie van elk Proteïnogeen aminozuur in de cultuur (mg/L).

4. meting van isotopische verrijking van Proteïnogeen aminozuren

Opmerking: Voor het meten van isotopische verrijking van Proteïnogeen aminozuren, gebruiken de gelabelde cel pellets. Drie verschillende agenten worden gebruikt voor de bewerking stap te kwantificeren van de isotopische verrijking van aminozuren. De intensiteiten van cluster ionen zijn gemeten voor het inschatten van de labeling patronen van de aminozuren. Het signaal van de ion van elk cluster komt overeen met de overvloed van de massale isotopomers (m₀ = zonder etikettering, m_{+ 1} = 1 gelabelde atoom,...) van een aminozuur-fragment. Een voorbeeld van een chromatogram dat wordt verkregen na de DMADMF procedure vindt u in Figuur 2.

1. Biomassa hydrolyse
   1. De pellets van de cel (overeenkomend met 1-2 mg gedroogde biomassa) hydrolyseren door toevoeging van 1,2 mL 6 M HCl en het monster gedurende 16 uur bij 105 ° C in gesloten glazen buizen in een oven van droge hitte aan het broeden.
   2. Voeg 1.2 mL gedestilleerd water en centrifuge bij 3000 x g gedurende 5 min cellulaire puin te verwijderen. De bovendrijvende substantie over zes 400 µL breuken in open glazen buizen verdelen. Droog de breuken in een oven van warmte bij 105 ° C totdat ze de consistentie van siroop (4-5 h).
2. Ethylchloroformate (ECF) bewerking
   1. Los van het gedroogde hydrolysaat in 200 µL van 20 mM HCl; dan, voeg 133 µL van pyridine: ethanol (1:4). Voeg 50 µL van ECF derivatize de aminozuren te wachten totdat alle CO₂ heeft geweest vrijmaking. Breng het mengsel te centrifugeren buizen die 500 µL van dichloormethaan uitpakken van de derivatized stoffen bevatten.
   2. Vortex de buizen voor 10 s en centrifuge hen voor 4 min bij 10.000 x g; verzamelen de lagere organische fase met een pipet van Pasteur en overdracht GC flesjes die conische inzetglas bevatten zodat de monsters kunnen rechtstreeks worden geïnjecteerd in de GC/MS-instrument.
3. (N, N)-Dimethylformamide dimethyl Acetaal (DMFDMA) bewerking.
   1. Los van het gedroogde hydrolysaat in 50 µL van methanol en acetonitril 200 µL. Voeg 300 µL van DMFDMA. Vortex de buis en overdracht van de monsters naar GC autosampler flesjes waarin conische inzetglas.
4. N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) bewerking
   1. Het hydrolysaat opschorten in 200 µL van acetonitril. Voeg 200 µL van BSTFA, de glazen buis hermetisch te sluiten en incubeer gedurende 4 uur bij 135 ° C vóór de overbrenging van het extract rechtstreeks naar GC flesjes.
5. GC-MS-analyse
   1. Het analyseren van monsters met een gaschromatograaf die is uitgerust met een autosampler injector en is gekoppeld aan een massaspectrometer.
      1. Instrumentspecifieke software gebruiken om te controleren van het instrument en de chromatogrammen analyseren. In het "Sequence"-menu, klik op de "Log voorbeeldtabel" als het monster lijst wilt maken en klik op de knop "Run" om te beginnen met de injecties.
         Opmerking: De gaschromatograaf is voorzien van een 30 m x 0,25 mm apolaire silica capillaire kolom met een 0,15 μm-laagdikte. De massaspectrometer vierpolige temperatuur instellen bij 150 ° C en houd de transferregel bij 250 ° C voor alle analyses. Drie analytische programma's, elk een specifieke aan elke bewerking agent, worden gebruikt.
      2. ECF derivaten: Gebruik helium als de mobiele fase met een stroom van 1,2 mL/min. de temperatuur van de inlaat vastgesteldop met 230 ° C en die van de bron bij 250 ° C. Programma de autosampler te injecteren 1 µL van monsters met een split-ratio van 3:1. Uitvoeren van de analyses, geleidelijk de oventemperatuur als volgt: 130 ° C gedurende 3 minuten; helling van 15 ° C/min. tot 260 ° C; Handhaaf de temperatuur bij 260 ° C gedurende 20 min.
      3. DMFDMA derivaten: Gebruik helium als de mobiele fase met een constante stroom van 1,2 mL/min. de temperatuur van de inlaat vastgesteldop met 230 ° C en die van de bron bij 250 ° C. Programma de autosampler te injecteren 1 µL van monsters met een split-ratio van 3:1. Uitvoeren van de analyses, geleidelijk de oventemperatuur als volgt: 60 ° C gedurende 1 min; helling van 20 ° C/min. tot 130 ° C; tweede verloop van 4 ° C/min. tot 260 ° C; Handhaaf de temperatuur bij 260 ° C gedurende 10 minuten.
      4. BSTFA derivaten: Gebruik helium als de mobiele fase met een constante stroom van 1,2 mL/min. de temperatuur van de inlaat vastgesteldop met 275 ° C en die van de bron bij 300 ° C. De analyses worden uitgevoerd (injectie: 1 µL), geleidelijk verhogen van de oventemperatuur als volgt: 110 ° C gedurende 1 min; eerste verloop van 2 ° C/min. tot 154 ° C; tweede verloop van 5 ° C/min. tot 300 ° C; Handhaaf de temperatuur bij 300 ° C gedurende 10 minuten.
      5. Detectie procedure: Voor elke bewerking, injecteren van een steekproef (1 µL) u in SCANMODUS werkt met positieve elektron effect ionisatie op 70 eV en neem nota van de retentietijd van elk aminozuur.
      6. Deze waarden gebruiken om te definiëren van de Vensters van de tijd in het chromatogram en voor de verschillende geselecteerde ionen, die kenmerkend zijn voor elk aminozuur en vermeld in tabel 3; deze waarden moeten worden opgenomen voor elk aminozuur. Deze informatie opnemen in de SIM-programma voor virusopsporing en uitvoeren van de analyses in de SIM-toegangsmodus met positieve elektron effect ionisatie op 70 eV.
   2. Verzamelen van de uitkomsten van de analyses; namelijk, elk aminozuur, opnemen een cluster van intensiteiten die overeenkomen met zijn verschillende massa isotopomers. Verwerken van de gegevens met behulp van de dedicatedsoftware¹⁷ te corrigeren voor het labelen van de natuurlijke en berekenen de isotopische verrijking van de Proteïnogeen aminozuren (gedefinieerd in de gelabelde breuk van een aminozuur met betrekking tot het totale bedrag in het eiwit monsters).
      Opmerking: De isotopische verrijking van een molecule (IE), uitgedrukt als een percentage, wordt berekend bij het verdelen van de som van de gecorrigeerde intensiteiten van de massale isotopomers met labeling (m₁, m₂,.. .m_n) de som van de gecorrigeerde intensiteiten van alle isotopomers van de massa (m₀, m-₁m₂,... m_n):
      I. E. = (m₁ + m₂ +... + m_n) / (m₀ m₁+ m₂ +... + m_n)

5. kwantificering en isotopische verrijking van vluchtige stoffen

1. Extractie van gelabelde vluchtige stoffen
   1. Voeg 10 µL van Halfzwaar interne standaarden tot 5 mL van het supernatans (eindconcentratie van Halfzwaar verbindingen: 100 µg/L) in een tube van 15 mL glas. Voeg 1 mL dichloormethaan, strak sluit de buizen en schud ze op een rockende platform voor 20 min. Centrifuge voor 5 min op 3000 x g en verzamelen de lagere organische fase in een tube van 15 mL glas. Herhaal de winning van dichloormethaan.
   2. Droog het organische extract meer dan 500 mg van watervrij natriumsulfaat en verzamelen van de vloeibare fase met een pipet van Pasteur. Het extract concentreren door een factor vier onder stikstof flux en overbrengen naar een GC autosampler flacon.
2. GC-MS kwantificering van vluchtige stoffen
   1. De gaschromatograaf met een capillaire kolom van gesmolten siliciumdioxide 30 m x 0,25 mm voorzien van 0.25 μm laagdikte en toepassen van een constante helium stroom van 1,0 mL/min. greep de injector en de transferregel bij 250 ° C.
   2. Injecteer 2 µL van het monster met een split-ratio van 10:1 en scheiden de uitgepakte vluchtige moleculen met behulp van de volgende oven temperatuursprofiel: Houd de temperatuur gedurende 3 minuten bij 40 ° C, verhogen door 4 ° C/min. tot 220 ° C en vervolgens houden de oven op 220 ° C gedurende 20 minuten.
   3. Detecteren van de verbindingen met behulp van een massaspectrometer met de temperatuur van de bron instellen op 230 ° C en de massaspectrometer vierpolige temperatuur ingesteld op 150 ° C. Het opnemen van de massaspectra in geselecteerd Ion Monitoring (SIM) modus met positieve elektron effect ionisatie op 70 eV en met behulp van de ion clusters specifiek om de vluchtige stoffen die worden vermeld in tabel 4.
   4. Gebruik een externe 7-punts kalibratie te kwantificeren van de concentraties van vluchtige moleculen van de bedragen van de intensiteiten van de bijbehorende ion-cluster. Het bereiden van stamoplossingen van elke verbinding (10 g/L) in 100% ethanol. Vervolgens, standaardoplossingen voor elke categorie van vluchtige moleculen (ethyl esters, acetaten, alcoholen en zuren) door het mengen van stamoplossingen worden bereid. Ten slotte, Verdun verschillende hoeveelheden van de standaardoplossingen in een 12%-hydroalcoholic oplossing met 5 gram per liter wijnsteenzuur, wordt verhoogd met de pH aangepast aan 3.3 ter voorbereiding van de ijkoplossingen.
   5. Parallel, corrigeren voor de natuurlijke etikettering van de intensiteiten van elk cluster ion en berekenen de isotopische verrijking van vluchtige stoffen, die is gedefinieerd in de gelabelde breuk van de moleculen en wordt uitgedrukt als een percentage met behulp van de speciale software ¹⁷.

6. de berekeningen voor een geïntegreerde analyse van de Dataset

1. Collectie van de ruwe gegevens
   1. Met behulp van de werkbladen weergegeven in tabellen 5, 6, 7, en 8, voert u de waarden van de ruwe gegevens die overeenkomen met de concentratie van de extracellulaire aminozuren, cel drooggewicht, eiwitgehalte van cellen, concentratie van vluchtige moleculen, en isotopische verrijking van Proteïnogeen aminozuren en vluchtige moleculen.
      Opmerking: De gegevens die in tabellen weergegeven worden uitgedrukt in mM. Alle resultaten zijn eveneens uitgedrukt in mg/L door het vermenigvuldigen van de waarden in mM door het molecuulgewicht van elke molecuul of in mg N/L door te vermenigvuldigen met de millimolar concentratie van een Proteïnogeen aminozuur de atoommassa van stikstof (14 u) en door het aantal stikstof ato MS die worden geleverd door het katabolisme van dit molecuul.
   2. Bereken de massa percentage van elk aminozuur in eiwitten door het bedrag in mg/L in het hydrolysaat te delen door het totale bedrag van de aminozuren (hun som in mg/liter).
   3. Bereken middelen, standaarddeviaties en standaardfouten van het gemiddelde van de gegevens die zijn verkregen in de onafhankelijke experimenten.
   4. Bereken de concentratie (mg/L) van de Proteïnogeen voor elk aminozuur door vermenigvuldiging van het percentage van deze aminozuren in eiwitten (mg aa/g eiwitten) door de eiwitoplossing in de biomassa (g eiwitten/g DW) en het droge gewicht-inhoud (de productie van biomassa) in de medium (g DW/L).
2. ¹⁵ N isotopische tracerproeven
   1. Met behulp van de werkbladen die zijn opgenomen in tabel 9, berekenen de gelabelde en labelloze fracties van stikstof die aanwezig zijn in de Proteïnogeen aminozuren (uitgedrukt in mg N/L) van de totale concentraties (uitgedrukt in mg N/L) en hun isotopische verrijking. Voor elk aminozuur, de gelabelde fractie komt overeen met het product tussen de totale concentratie en haar isotopische verrijking, en de labelloze deel is het verschil tussen het totaal en de gelabelde bedragen.
   2. Vervolgens bepalen de breuk van stikstof totaal in proteïnen die is opgenomen in de Proteïnogeen aminozuren gekwantificeerd in deze studie door optelling van de totale hoeveelheid Ala, glycine, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, zijn, Glu en Arg (in mg N/L) en het totaal te delen een Mount stikstof aanwezig in eiwitten door dit bedrag.
   3. Berekenen van de stikstof die geboden door glutamine, arginine en ammonium dat werd teruggevonden in de Proteïnogeen zuren gekwantificeerd in deze studie door optelling van de gelabelde fractie (in mg N/L) van Proteïnogeen aminozuren die werden gekwantificeerd in de studie (Ala Glycine, Val, Asp, PHE Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, zijn Glu en Arg) tijdens experimenten in aanwezigheid van ¹⁵N-geëtiketteerden arginine, glutamine, of ammonium en dit label-stikstof breuk delen door de totale hoeveelheid stikstof in de gekwantificeerde Proteïnogeen amino zuren.
   4. Beoordeling van de bijdrage van de 3 meest voorkomende aminozuren aan de intracellulaire pool van stikstof gebruikt voor DOVO biosynthese door het combineren van gegevens uit de ¹³C en ¹⁵N isotoop tracerproeven (werkblad in tabel 7).
   5. Van het totale bedrag (uitgedrukt in mM) van Proteïnogeen Val, Leu, Ile of Thr, aftrek van het deel dat is afgeleid van de directe integratie van verbruikte verbindingen (¹³C experimenten) en het deel dat was DOVO synthetized met behulp van stikstof uit de 3 belangrijke bronnen om te beoordelen van de breuk die was DOVO synthetized met behulp van stikstof uit de andere aminozuren.
   6. Vervolgens berekent de verhouding tussen de hoeveelheid aminozuur DOVO synthetized met behulp van stikstof door Gln, Arg en NH₄⁺ (som uitgedrukt in mM) geleverd aan de totale hoeveelheid Proteïnogeen aminozuren (in mM) te kwantificeren van de bijdrage van arginine, glutamine en ammonium aan de intracellulaire stikstof-pool.
3. ¹³ C isotopische tracerproeven
   1. Berekend van de gelabelde en labelloze breuken van de aminozuren Proteïnogeen van concentraties uitgedrukt in mM en isotopische verrijking van Proteïnogeen aminozuren die zijn verkregen tijdens proeven in aanwezigheid van het ¹³C-gelabeld Leu, Val, Ile of Thr. (zie 6.2.1, tabel 10).
   2. Berekend van de gelabelde en labelloze breuken van vluchtige stoffen uit concentratie uitgedrukt in mM en isotopische verrijking van vluchtige stoffen die zijn verkregen tijdens proeven in aanwezigheid van het ¹³C-gelabeld Leu, Val, Ile of Thr ( Tabel 10).

Resultaten

Figuur 3 geeft een schematisch diagram van de workflow die werd uitgevoerd voor het onderzoek naar het beheer door de gist van de meerdere bronnen van stikstof die zijn gevonden tijdens de wijn gisting.
Voor verschillende punten van de bemonstering, de kenmerken van de biologische parameters – groei, stikstof consumptiepatronen en het profiel van Proteïnogeen aminozuren – Toon een hoge reproduceerbaarheid onder fermentatie (Figuur 4

Discussie

Kwantificeren van compartimentering van de verbindingen via metabole netwerken met isotopische tracerproeven is een veelbelovende aanpak voor het begrip van de werking van het microbiële metabolisme. Deze methodiek, niet kan terwijl succesvol toegepast met één of twee gelabelde substraten, momenteel worden uitgevoerd om te studeren metabolisme van verschillende bronnen met behulp van meerdere gelabelde elemental isotopen (dat wil zeggen, meer dan twee substraten). Inderdaad, de beschikbare analytische technieken...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich