Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine

8.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56421

⸱

31 januari 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine and Vancouver Costal Health Research Institute, University of British Columbia, 2Institute of Biomedical Technology, University of Tampere

In dit artikel

Samenvatting

Een nieuwe techniek voor snelle antigeen weergave op een bacteriële oppervlak wordt gepresenteerd, waarbij het oppervlak biotinylation gevolgd door blootstelling aan proteïnen van belang in fusie met monomere avidin. Laden van BCG met geselecteerde antigenen met succes verbetert de immunogeniciteit, suggereren dat oppervlakte decoratie traditionele genetische benaderingen kan vervangen.

Samenvatting

Tuberculose (TB) is een ernstige besmettelijke ziekte en de enige beschikbare vaccin M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) is veilig en effectief voor de bescherming tegen kinderen ernstige TB meningitis en sommige vormen van gedissemineerde TB, maar er niet in slaagt om te beschermen tegen pulmonaire TB, die de meest voorkomende vorm van de ziekte is. Veelbelovende strategieën ter verbetering van BCG momenteel rekenen op haar transformatie met genen coderend voor immunodominante M. tuberculosis (Mtb)-specifieke antigenen en/of complementeren met genen coderend voor cofactoren die antigeen zou stimuleren presentatie van cellen. Belangrijke beperkingen van deze benaderingen zijn lage efficiëntie, lage stabiliteit en het onzekere veiligheidsniveau van expressievectoren. In deze studie presenteren wij een alternatieve aanpak van vaccin verbetering, die bestaat uit BCG complementeren met exogene proteïnen van belang op het oppervlak van bacteriën, in plaats van transformatie met plasmiden codering van de bijbehorende genen. Eerst, eiwitten van belang worden uitgedrukt in fusie met monomere avidin in standaard E. coli expressiesystemen en vervolgens gebruikt voor het decoreren van het oppervlak van biotinyleerd BCG. Dierproeven met behulp van BCG oppervlak versierd met surrogaat ovoalbumine antigeen aantonen dat het gewijzigde bacterie is volledig immunogeen en specifieke T cel reacties teweeg kunnen. Over het geheel genomen ondersteunen de hier gepresenteerde sterk gegevens een roman en efficiënte methode voor het omvormen van de huidige BCG-vaccin dat de moeizame conventionele benadering van complementatie vervangen door exogene nucleïnezuren.

Inleiding

Diverse strategieën zijn voorgesteld ter vervanging van het huidige TB-vaccin BCG, met inbegrip van eiwit adjuvans systemen, virale vectored technologieën, verzwakte levende stammen van de M.tb en genetisch gemodificeerde stammen van de BCG, ofwel invoering van genen over het uitdrukken van BCG-antigenen die niet voldoende blijk tijdens de infectie1 of Mtb gegeven-specifieke antigenen niet aanwezig in de BCG2. Genetische manipulatie, echter geconfronteerd met vele belemmeringen met inbegrip van de onzekere niveau van veiligheid, het tijdrovende proces en het lage rendement van4,5van de vectoren van de expressie. Met betrekking tot de verbetering van de BCG, is een alternatieve aanpak nodig ter verbetering van de immunogeniciteit zonder de noodzaak voor onzekere genetische afwisseling.

In deze studie introduceren wij een nieuwe strategie voor de weergave van recombinante eiwitten van de rente over het celoppervlak BCG, dat is gebaseerd op de interactie van de bekende avidin van hoge-affiniteit met biotine. Deze benadering biedt snelle en reproduceerbare gehechtheid van recombinante avidin fusion eiwitten op het oppervlak van biotinyleerd BCG, dat brede manipulaties van BCG vergemakkelijkt op een maximale verbetering van zijn werkzaamheid met behoud van haar uitstekende veiligheid opnemen, die gedurende tientallen jaren van gebruik.

Avidin affiniteit voor Biotine is extreem hoog (K,d = 1015 M) en eenmaal gevormd, het Biotine-avidin-complex is zeer stabiel en slechts onder voorwaarden6denaturering kan worden verstoord. Echter, voor dit soort interactie om te dienen als een gen alternatief voor de methode van de overdracht, op lange termijn maar omkeerbare weergave van recombinante eiwitten is vereist. Zo introduceerden we hier een lage affiniteit monomeer avidin (K,d = 10−7 M) dat leidt tot de omkeerbare release van eiwit van het oppervlak versierd BCG eenmaal ingenomen binnen antigeen presentatie van cellen. We getest om te voorzien van een proof of concept, deze methode met behulp van een monomeer avidin chimeer eiwit overeenkomt met een surrogaat-antigeen afgeleid van ovoalbumine (OVA)7,8. De resultaten toonden aan dat het celoppervlak BCG kan gemakkelijk en snel met worden verfraaid monomere avidin fusion eiwitten en dat deze binding aan de oppervlakte van de BCG stabiel en reproduceerbare zonder waarneembare veranderingen in de bacteriële groei en overleving is. Ook vonden we dat BCG versierd met monomere avidin gefuseerd met eicellen (AviOVA) kan veroorzaken een immuunrespons die vergelijkbaar is met die geïnduceerd door BCG genetisch uiting te geven aan het zelfde antigeen zowel in vitro als in vivo. Deze technologie van omkeerbare display van eiwitten van de rente over het bacteriële oppervlak is daarom een doeltreffende vervanging van traditionele gene transfer benaderingen en kan een platform bieden voor brede manipulaties van BCG en verdere toepassingen in vaccin ontwikkeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren werden onderhouden overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies aan de University of British Columbia. Experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies en uitgevoerd volgens de Canadese Raad op Animal Care Guidelines. Het dierlijke verzekering welzijn nummer is A11-0247.

1. generatie van monomere Avidin Fusion eiwitten uiting van plasmiden

  1. Sub kloon monomere avidin reeks12 in pDEST17 plasmide tussen de "CTC" en "GAA" sites die correspondeert met 133-134bp. (dat wil zeggen, tussen de 6-histag en de pDEST17 Attr1 recombinatie site) te verkrijgen p17-Avi.
    Opmerking: De monomeer avidin DNA-sequentie is hieronder weergegeven. De drie mutaties in wild-type Avidin om de monomeer avidin geïntroduceerd worden in vette letters weergegeven.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    OOAGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. Inleidingen geflankeerd met AttB1 en B2 Attsites die overeenkomt met de eicellen polypeptide757-1035 ontwerpen (ik-A-b- en H-2_Kb-beperkt epitopes) opeenvolging van DNA. Primer sequenties zijn: Attb1-eicellen
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT en Attb2-eicellen
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 en b2-sequenties van Attzijn vet).
    1. PCR-versterken eicellen polypeptide757-1035 DNA-sequentie met de inleidingen boven het pUC57-eicellen plasmide als sjabloon gebruiken.
    2. Het klonen van de PCR producten in pDONR-221 door een sitespecifieke in vitro recombinatie reactie (b.v., BP Clonase) pDONR-eicellen te verkrijgen.
  3. Breng het gen van belang in p17-Avi met behulp van de reactie van LR Clonase p17-Avi-eicellen te verkrijgen.
    Opmerking: Voor details van BP en LR recombinatie klonen, zie de handleiding van de fabrikant.

2. de monomeer Avidin Fusion eiwit expressie, zuivering en uiteinde

  1. Transformeren p17-Avi-eicellen plasmide in E. coli BL21 en veroorzaken 250 mL van E. coli cultuur van de BL21 met IPTG (0,1 M) gedurende 3 uur bij 37 ° C.
  2. Lysis van bacteriën en integratie instanties solubilisatie
    1. De 250 mL van geïnduceerde BL21 cultuur pellet door 30 min van centrifugeren op 4.000 x g en bij 4 ° C.
    2. Verzamelen van pellets in 10 mL lysisbuffermengsel (50 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 6 M Guanidine-HCL, pH 1,5-2,5) en incubeer gedurende 15 min bij 95 ° C. Na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur op een rotator.
    3. Centrifuge 30 min op 15.000 x g en 4 ° C en verzamelen supernatant.
  3. Zuiveren van Avi-eicellen van Supernatant (ontbindend opneming organen Fractie) met Ni-NTA kolommen.
    1. Verdun opneming organen 1:2 met lysis-buffermengsel.
    2. Gebruik 4 mL Ni-NTA hars per 250 mL cultuur afkomstige integratie-organen.
    3. 3 x met 10 mL lysisbuffermengsel (pH 7.0) wassen.
    4. Elueer met 10 mL elutie buffer (lysis buffer pH 7.0 met 250 mM imidazol).
  4. Refold geëlueerd eiwit door geleidelijke verdunning (1:10) en snelle vortexing in Tris buffer (pH 7.5) met 1 mM DTT, 200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0,5 mM, Tween 80, arginine 500 mM en 200 mM NaCl gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  5. -Zout en buffer uitwisseling refolded eiwit uit Tris buffer in PBS met eiwit concentrators volgens de protocollen van de fabrikant.
  6. Verwijderen van aggregaten door centrifugeren gedurende 30 minuten bij 3500 x g en bij 4 ° C, en op te slaan aliquots oplosbaar eiwit bij-20 ° C.

3. Biotinylation van BCG celoppervlak

  1. Groeien van BCG in Middlebrook 7H 9 bouillon met 10% OADC (oliezuur, albumine en dextrose oplossing) en 0.05% Tween 80 bij 37 ° C op een shaker platform op 50 rpm tot OD = 0,5-1.
    Opmerking: BCG is een ziekteverwekker van bioveiligheid niveau 2 en alle experimenten betreffende BCG moeten gebeuren in een kabinet met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bioveiligheid.
  2. Wassen 109 BCG 3 keer met 500 µL ijskoude endotoxine gratis PBS plus 0,1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). Schorten BCG pellet in steriele endotoxine gratis PBS.
  3. Onmiddellijk vóór gebruik, bereiden 1 mL 10 mM Sulfo-NHS SS Biotine in steriele gefilterd water.
    1. Incubeer bacteriën met 1 mL 0,5 mM van Sulfo-NHS SS Biotine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  4. Wassen gelabelde bacteriën 3 keer met 500 µL van iced koude PBST verwijderen niet hebben gereageerd biotinylation reagens.
    1. Resuspendeer de pellet in 1 mL PBST.
  5. Om te beoordelen biotinylation efficiëntie, vlek 108 biotinyleerd BCG met daar-FITC (1:100, 25 µL) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    1. Incubeer gebeitst bacteriën in 1 mL 2% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens niveaus van biotinylation te onderzoeken door stroom cytometry analyse.

4. fenotype van biotinyleerd Mycobacteria: groei en overleving

  1. Groeien van BCG stammen in Middlebrook 7H 9 bouillon met 10% OADC (oliezuur, albumine en dextrose oplossing) en 0.05% Tween 80 bij 37 ° C op een shaker platform op 50 rpm.
    1. De optische dichtheid (OD600) van de bacteriecultuur opnemen over een periode van 8 dagen.
  2. Gebruiken BCG-Luc (eerder beschreven9) voor het detecteren van bacteriën overleven in macrofagen.
    1. RAW264.7 cellen met biotinyleerd BCG-Luc (MOI 10:1) infecteren of onbehandeld BCG-Luc (control) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende een 48u periode.
    2. Cel monolayers wassen en vervolgens lyse met 0,025% SDS om ingenomen bacteriën vrij te geven.
    3. Maatregel bioluminescentie productie met Luciferase assay systeem en luminometer.
      Opmerking: Luminescentie signaal is kenmerkend voor bacteriële levensvatbaarheid. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor meer informatie over luciferase assay.

5. de binding van de monomeer Avidin-fusieproteïne te biotinyleerd BCG oppervlak

  1. Meng 5 x 108 biotinyleerd BCG met Avi-eiwit (10 μg/mL finale in PBS-T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op shaker platform.
  2. Wash bacteriën 3 keer met 500 µL van iced koude PBST en vlek met konijn anti-avidin antilichaam (Ab) (1:100 verdunning, eerder beschreven10) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens met FITC geconjugeerd geit anti-konijn IgG Ab onder dezelfde omstandigheden.
  3. Wassen van bacteriën 3 keer met PBST 500 µL en analyseren door stroom cytometry te evalueren in welke mate van oppervlakte decoratie.

6. lyofilisatie van mycobacteriën

  1. Biotinylate-bacteriën volgens stap 3.1-3.4 en jas biotinyleerd bacteriën met Avi-eicellen volgens stap 5.1.
  2. Aliquot biotinyleerd en gecoate bacteriën (108), wassen met PBS en resuspendeer in 0,5 mL lyofilisatie media (1,5%, 25% Sauton medium en 75% H2O nb-glutamaat).
  3. Bacteriën overbrengen in glazen flesjes en bevriezen in een vriezer-80 ° C's nachts.
  4. Lyophilize gevulde en bevroren glazen flesjes voor 24 h met gebruikmaking van een bevriezing van de droger.
  5. Opslaan van gedroogde monsters bij kamertemperatuur en reconstrueren in PBS wanneer nodig.
  6. Herhaal stap 3.5 biotinylation en oppervlakte coating stabiliteit te evalueren.

7. fagocytose Assay

  1. RAW 264.7 macrofaag cellen in 10 cm diameter cultuur gerechten in DMEM medium met 5% FCS, 1%, elke van L-glutamine, HEPES, niet-essentiële aminozuren, en penicilline en streptomycine groeien tot 70-80% confluentie.
  2. Zaad van 2 x 106 RAW 264.7 macrofaag cellen in een 6-well-plate. Cellen te houden 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2toestaan.
  3. Genereren van DsRed BCG (eerder beschreven9) versierd met Avi-eicellen (DsRed BCG-Avi-OVA) volgens stappen 3.1-3.4 en 5.1.
  4. Infecteren ruwe cellen met DsRed BCG-Avi-eicellen of onbehandeld DsRed BCG op MOI 20:1 gedurende 24 uur bij 37 ° C.
  5. Spoel de cellen driemaal en trypsinize met 1 mL van 0,25% trypsine bij 37 ° C gedurende 10 minuten te verwijderen van gedeeltelijk vrijstaande bacteriën.
  6. Positiebepaling in 2,5% PFA in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  7. 3 x met PBS wassen en analyseren door stroom cytometry.

8. intracellulaire handel in eicellen ingericht biotinyleerd BCG in macrofagen

  1. Fluorescentie microscopie
    1. Beënt, 3 x 105 RAW 264.7 macrofaag cellen op coverslips in een 24-well-plate. Cellen te houden 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2toestaan.
    2. Macrophage cellen met mycobacteriën (MOI 10:1) in onderhoud media zonder antibiotica bij 37 ° C en 5% CO2 voor 4 tot en met 24 h infecteren.
    3. Wassen van de cellen en trypsinize om te verwijderen van oppervlakte geschakelde, niet-ingenomen bacteriën zoals in stap 7.5.
    4. Fix geïnfecteerde cellen in 2,5% PFA in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door 3 wasbeurten met PBS.
    5. Permeabilize cellen in blokkeren/permeabilization buffer (0,1% Triton X-100, 3% BSA in PBS) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      1. Gebruik specifieke antilichaam van belang (bijvoorbeeldanti-avidin Ab konijn) bij 10 μg/mL in permeabilization buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door secundair antilichaam (bijvoorbeeldFITC-geit anti-konijn IgG) voor 20 min.
    6. Wash cellen 3 x met PBS, een keer met water, en mount op dia's in 10 μL van waterige montage medium om te minimaliseren van de fluorescentie photobleaching.
    7. Onderzoeken van de dia's door digitale confocale microscopie met behulp van een Microscoop van de epifluorescence uitgerust met 63 x / 1.4 Plan-Apochromat doel. Record beelden met behulp van een digitale camera gekoppeld aan de Microscoop software.
  2. Immunogold kleuring en elektronenmicroscopie
    1. Zaad van 2 x 106 RAW 264.7 macrofaag cellen in 6-Wells-platen.
    2. Herstellen van BCG geïnfecteerde macrofagen met 4% PFA gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
    3. Wassen monsters tweemaal met PBS.
    4. Monsters in 4% lage smeltpunt agarose insluiten en uitdrogen in 70% ethanol.
    5. Monsters overbrengen in acryl hars en polymeriseren bij 50 ° C.
    6. 60 nm secties met microtome uitgesneden en verzamelen van secties op nikkel rasters.
    7. Label monsters met 10 μg/mL avidin antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C's nachts in incubatie oplossing (PBS en 0,1% BSA) en daarna wassen met incubatie oplossing goud-geconjugeerde F(ab')2 van ultra-kleine geit-anti-konijn IgG (1/20) gedurende 1 uur op de kamer temperatuur in incubatie oplossing.
    8. Secties in gedistilleerd water wassen, vlekken in 2% Glutaaraldehyde wassen opnieuw, droge lucht en onderzoek met de elektronenmicroscoop.

9. dierlijke immunisering en orgel Processing

Opmerking: Alle stappen moeten worden gedaan in een kabinet bioveiligheid.

  1. Pass biotinyleerd en eiwit gecoat bacteriën via 271/2G naald 10 keer om één celsuspensie.
  2. Neem 1 x 106 bacteriën in 100 μl van endotoxinen-vrije PBS en immuniseren een vrouwelijke C57BL/6 muizen (-A,b, H - 2 Kb, 5-6 week oud) subcutaan in het nekvel van de nek.
    1. Injecteren controle muizen met 100 μl van PBS alleen.
  3. Euthanaseren geïmmuniseerde muizen 20 dagen na immunisatie bij CO2 inademing gevolgd door cervicale dislocatie.
    1. Isoleren van de milt en breng het in RPMI media.
  4. Pureer de milt door een zeef van de cel 70 µm met een zuiger van de spuit 5 mL.
    1. Wassen met 5 mL RPMI. Centrifuge (800 x g, 3 min) te isoleren van de schorsing van een enkele cel.
    2. RBC met muis Biotine positieve selectie kit met biotine-Ter119/Erythroid cellen Ab afbreken.
    3. Centrifuge en resuspendeer de cellen in 10 mL van de volledige RPMI (10% FCS, 1% L-glutamine, penicilline van 1%, 1% streptomycine en 50 μM 2-ME).

10. ik-Ab tetrameer kleuring te bepalen de frequenties van antigeen-specifieke CD4+ T-cellen en intracellulaire Cytokine vlekken te bepalen frequenties van antigeen-specifieke T cellen vrijgeven van Cytokines in geïmmuniseerd dieren

  1. Tetrameer kleuring
    1. Vlekken van splenocytes van controle en geïmmuniseerde muizen (~ 20 x 106 cellen) met PE-geconjugeerde ik-A-b-eicellen323-339 tetramers (in de verdunning 1/12,5) gedurende 1 uur bij 37 ° C in bindende buffer (PBS met 2% FCS en 0,1% NaN3).
    2. AF647 CD4 Ab (1:25) en 7-AAD (te sporen dode cellen) toevoegen aan splenocytes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Het analyseren van monsters met stroom cytometry.
    4. Verwerven van 500.000 gebeurtenissen in de CD4-positieve regio om te bepalen van de frequentie van tetrameer positieve gebeurtenissen.
      Opmerking: Totale splenocytes worden gedefinieerd door de wetenschappelijke stuurgroep/FSC dot blot, levende cellen door uitsluiting van de 7-AAD positieve gebeurtenissen en CD4 deelverzamelingen door gating AF647 positieve gebeurtenissen.
  2. Frequentie van antigeen specifieke intracellulaire Cytokine vrijgeven van T cellen
    1. Overdracht ongeveer 1 × 107 splenocytes in 4 mL voor volledige RPMI medium in zes-Wells-platen met of zonder recombinante eicellen (10 µg/mL) en incubeer gedurende 16 h.
    2. Cellen met Brefeldin A (1:1, 000) voor een extra 5 h behandelen.
    3. Wassen met PBS en onder voorbehoud van intracellulaire cytokine kleuring als volgt:
      1. Vlek celsteekproeven met PE-CD8 of PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 in bindende buffer) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
      2. Vast in 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
      3. Permeabilize met behulp van de permeabilization oplossing, volgens de instructies van de fabrikant.
      4. Wassen cellen en label met AF647-geconjugeerde IFN-γ Ab (1:50) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Wassen van de cellen en onderworpen aan stroom cytometry analyse zoals hierboven beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De algemene procedures beschreven, werd de haalbaarheid van BCG oppervlakte biotinylation en decoratie met surrogaat antigeen eicellen onderzocht. De immunogeniciteit van de gemodificeerde BCG destijds getest in vivo. De bacteriële oppervlak was gemakkelijk gelabeld met biotine voor snelle weergave van de chimeer antigenen avidin zonder enige detecteerbare veranderingen in bacteriële fenotypen. De resulterende gewijzigde BCG efficiënt wordt ingenomen door antigeen presentatie cel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie meldden wij een niet-genetische aanpak voor snelle en effectieve weergave van exogene eiwitten op BCG oppervlak om toe te voegen specifieke antigenen of specifieke functionele eigenschappen verwacht om efficiënt de immunogeniciteit van de bacterie. We toonden aan dat het celoppervlak BCG biotinyleerd voor ogenblikkelijke oppervlakte decoratie met avidin fusion eiwitten gemakkelijk zou kunnen zijn. De totale procedure kan worden uitgevoerd binnen de 2 uur, terwijl genetische transformatie en selectie van po...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. R Stokes voor de BCG Pasteur stam en A. Talal voor technische ondersteuning. Wij danken GenScript voor hulp bij gene synthese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Endotoxin-free RPMI 1640StemCell Technologies 36750
Sulfo-NHS SS biotinThermo Fisher 21328
FITC-conjugated streptavidinSigma-AldrichS3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer MBL International TS-M710-1
7-AADBD Pharmingen559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin Clontech635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4BD Bioscience 557681
AF647 rat anti-mouse IFN-gBD Bioscience 557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-EBD Bioscience 562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4BD Bioscience 552775
PE rat anti-mouse CD8 AbBD Bioscience 561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kbBD Bioscience562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibodyThermo Fisher31635
AF 647 rat anti-mouse CD4BD Bioscience 557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgGElectron Microscopy Sciences25100
Middlebrook 7H9 brothBD Diagnostic Systems271310
OADCBD Diagnostic SystemsB11886
Tween 80Sigma-AldrichP1379
RAW 264.7 murine macrophage cell linesAmerican Type Culture Collection
pDEST17 plasmid Invitrogen11803012
pUC57-OVA plasmid GenScriptSD1176
BP clonase Invitrogen11789020
LR clonase Invitrogen11791043
pDONR221 plasmidInvitrogen12536017
Ni-NTA columns Qiagen31014
Pierce protein concentrators Thermo Fisher 88527
FlurosaveCalbiochem-Novabiochem345789
Axioplan II epifluorescence microscopeCarl Zeiss Inc
CCD digital camera Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope FEI CompanyG2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer Thermo Fisher 87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit StemCell18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibodyBioLegend116203
Brefeldin ABD Pharmingen555029
Cytofix/Cytoperm kit BD Pharmingen554714
Bright-Glo Luciferase assay systemPromegae2620
Turner Biosystem luminometer PromegaTD-20/20
Leica EM UC6 microtome Leica MicrosystemsUC6
Novalyphe NL 500 freeze dryerSavant Instruments NL 50
Wheaton boroscilicate glass vialsWheaton VWR 66011-675

Referenties

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833(2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Prote ne expressieflowcytometrieimmunogeniciteitT celresponsantigeenpresentatieMHC moleculenfagocytose assay
Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.