Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Summary

Een protocol voor de structurele analyse van polysacchariden door elektroforese van het gel (PACE), met behulp van mannan als voorbeeld is beschreven.

Abstract

Plant celwand polysacchariden zijn notoir moeilijk te analyseren, en de meeste methoden vereisen dure apparatuur, gekwalificeerde operators en grote hoeveelheden van gezuiverde materiaal. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het verkrijgen van gedetailleerde polysaccharide structurele informatie, met inbegrip van resolutie van structurele isomeren. Polysaccharide p.a. door elektroforese van het gel (PACE), is de celwand plantmateriaal gehydrolyseerd met glycosyl hydrolases specifiek voor de polysaccharide van belang (bijvoorbeeld mannanases voor mannan). Grootformaat polyacrylamide gels worden vervolgens gebruikt om te scheiden van de vrijgegeven oligosacharide, die hebben fluorescently het label. Gels kunnen worden gevisualiseerd met een gewijzigde gel imaging systeem (Zie Tabel van materialen). De resulterende oligosaccharide vingerafdruk kan ofwel worden vergeleken kwalitatief of, met replicatie, kwantitatief. Koppeling en vertakkende informatie kunnen worden vastgesteld met behulp van extra glycosyl hydrolases (bijvoorbeeld mannosidases en galactosidases). Terwijl dit protocol een methode beschrijft voor het analyseren van de structuur van de glucomannaan, kan het worden toegepast op elke polysaccharide waarvoor gekenmerkt glycosyl hydrolases bestaan. Anderzijds kan het worden gebruikt te karakteriseren van roman glycosyl hydrolases met behulp van gedefinieerde polysaccharide substraten.

Introduction

Polysaccharide analyse door elektroforese van het gel (PACE) is een methode voor de gedetailleerde karakterisering van polysacchariden^1,2,3. Plant celwand polysacchariden zijn notoir moeilijk te analyseren, en de meeste methoden vereisen dure apparatuur, gekwalificeerde operators en grote hoeveelheden van gezuiverde materiaal. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het verkrijgen van gedetailleerde polysaccharide structurele informatie, met inbegrip van resolutie van structurele isomeren.

Begrip plant celwand polysaccharide structuur is nodig voor deze onderzoekers het verkennen van de plant celwand biosynthese of de rol van de celwand van de planten in de ontwikkeling van planten. Onlangs, echter, plant celwand samenstelling geworden interessant om een bredere groep van onderzoekers als gevolg van de focus op het gebruik van biomassa van de plant (in wezen de celwand) als een grondstof voor de productie van biobrandstoffen en biochemicaliën⁴. Als voorbeeld vereist efficiënte enzymatische saccharification van dit materiaal een gedetailleerd inzicht in de structuren van de polysacharide, zodat geoptimaliseerde enzymatische cocktails geselecteerde^{5 kunnen}.

TEMPO heeft diverse voordelen ten opzichte van alternatieve methoden waardoor het ideaal is voor de snelle analyse van complexe glycan structuren. Ten eerste, het vereist geen zuivering van de polysacharide in kwestie, zoals is vereist voor oplossing staat nucleaire magnetische resonantie (NMR)⁶. In de tweede plaats tempo structurele isomeren, in tegenstelling tot massaspectrometrie kunt oplossen (MS, bijvoorbeeld matrix-bijgewoonde laser desorptie/ionisatie (MALDI) en electrospray ionisatie (ESI)), die kan ook lastig om uit te voeren door vloeistofchromatografie (LC) ⁷. in de derde plaats tempo is zeer gevoelig, met lage-picomole resolutie, in tegenstelling tot dunne-laag chromatografie (TLC) of papierchromatografie. Tot slot, het vereist geen dure apparatuur of specialistische kennis, zoals het geval is voor MS, NMR en LC.

De tempo-methode is afhankelijk van het specifieke karakter van glycosyl hydrolase (GH) enzymen, die gericht zijn op bepaalde glycosidic verbanden in een mengsel van polysacchariden. Wanneer het GH-enzym op de polysacharide keten handelt, blijkt het een reducerend einde die kan vervolgens worden chemisch derivatized, in dit geval met een fluorescerende label. Het unhydrolyzed gedeelte van het monster wordt door deze methode dus niet detecteerbaar weergegeven. De gelabelde oligosacchariden gescheiden dan in een groot formaat acrylamide gel door elektroforese. Dit geeft uitstekende resolutie van zeer gelijksoortige moleculen, bijvoorbeeld de trisacharide Glc-Man-Man en Glc-Man-Glc een verschillende R_fzal hebben.

TEMPO is uitgebreid gebruikt voor het karakteriseren van verschillende Xylaan structuren over plant soorten⁸, om zich te identificeren glycosyltransferase mutanten in Arabidopsis^6,9,10,11 , voor het uitvoeren van glycosyltransferase assays⁹en te karakteriseren roman GH-activiteiten-^12,13. We hebben ook onlangs gebruikt te karakteriseren gist celwand mannan (Mahboubi en Mortimer, in voorbereiding). Hier beschrijven we een methode voor het karakteriseren van de plant cel glucomannaan wandstructuur, op basis van eerdere verslagen^11,14.

Protocol

1. oogsten van plantmateriaal

1. oogst verse plantmateriaal (~ 20 mg) en onmiddellijk het onderdompelen in ethanol 96% (v/v) en Incubeer bij 70 ° C gedurende 30 minuten; dit deactiveert een celwand vernederende enzymen aanwezig. Voor droog materiaal, begin bij stap 2.
   Let op: Ethanol is ontvlambaar.
   Opmerking: Een enkele stengel of rozet blad zorgt voor genoeg materiaal voor analyse. Maar, minder fouten ontstaan als een grotere hoeveelheid weefsel is samengebracht en geanalyseerd omdat dit gemakkelijker is te weeg en behandelen.
2. Zorgvuldig opnemen weefseltype en ontwikkelingsstadium, zoals polysacharide structuur varieert met beide. Bijvoorbeeld met Arabidopsis thaliana (gebruikte hier), de fase van het weefsel volgens de methoden van Boyes et al. ¹⁵
   Opmerking: In dit protocol hebben we gebruikt de onderste helft van de steel van de bloeiwijze, waar de eerste Hauw is volledig langwerpige maar niet vergeling.

2. voorbereiding van Alcohol onoplosbare residu (lucht)

1. voorbereiden lucht, volgens de methode van Mortimer et al. ⁹ of een andere vergelijkbare methode, om te produceren een poeder ontbreekt oplosbare suikers, zoals sucrose en zetmeel.

3. Aliquoting en voorbehandeling van AIR

Opmerking: de exacte hoeveelheid lucht nodig voor elk monster van (a) de overvloed aan de polysacharide van belang in het materiaal en (b) de gemiddelde grootte van oligosacchariden uitgebracht afhangen zal door de GH. De methode wordt een enkel fluorescerende molecuul toegevoegd aan de vermindering van elke oligosaccharide, zodat het aantal oligosacchariden de gevoeligheid van het experiment bepaalt. Als richtsnoer geldt voor glucomannaan in Arabidopsis stengel verteerd met GH5-/ GH26 (zoals beschreven), 500 µg wordt aanbevolen ¹¹, overwegende dat voor Xylaan in Arabidopsis stengel verteerd met GH11, 100 µg is aanbevolen zoals Mortimer ' s studie ³.

1. weeg AIR (10-15 mg) in een centrifugebuis van 15 mL en H ₂ O toevoegen aan een definitieve concentratie van 2 mg/mL. Vortex te bereiken een zelfs schorsing. Als dit problematisch is, gebruikt om te helpen dit proces een glas homogenizer.
2. Aliquoot 500 µg in microfuge buizen. Droog aliquots met behulp van een vacuüm centrifuge (Zie de Tabel van materialen) overnachting op 30 ° C.
3. Pre-Treat lucht met 1 M NaOH (20 µL) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur; dit-acetylates de polysacchariden en zwelt de cellulose microvezels, verstoren de biomassa structuur en toegang van GH.
   Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen voor gezuiverde polysacchariden. Let op – sterk zuur/base.
   1. Omvatten een aliquoot gedeelte voor de luchtverkeersleiding van een neen-enzym (op dezelfde wijze behandeld als alle monsters, met uitzondering van stap 4.1. wordt uitgesloten).
4. Toevoegen 200 µL van H ₂ O en 20 µL 1 M HCl te neutraliseren. Test dat de pH ~ 6-7 is door het verwijderen van 1 µL en spotten het op papier pH-indicator strips.
5. Toevoegen 50 µL 1 M ammonium acetaat buffer, pH 6.0 (of welke pH is geschikt voor het GHs gebruikt in de studie) en H ₂ O te geven van een totaal volume van 500 µL.
   Opmerking: Ammoniumacetaat wordt gebruikt omdat het sublimeert bij het drogen, en dus het voegt geen extra zout toe aan het monster. Een overmaat aan zout kan leiden tot slechte band-vorm en resolutie op het tempo gel.

4. Hydrolyse van lucht met Glycosyl Hydrolases (GHs)

Opmerking: zoals vermeld in de discussie, de zuiverheid van het GHs is van cruciaal belang. Gebruik alleen geïnfecteerd uitgedrukt, affiniteit gezuiverd enzymen. Na ontvangst van elke partij van de fabrikant, gehydrolyseerd gedefinieerde aliquots van substraat (bijvoorbeeld 500 µg lucht) met toenemende hoeveelheden van GH's nachts (bijvoorbeeld 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 eenheden/µL). Wanneer een overmaat van GH aanwezig is, zal de tempo-vingerafdruk identiek kijken. Een overmaat van enzym is vereist voor het leveren van een reproduceerbaar resultaat omdat het moet er zeker van zijn dat de hydrolyse-reactie het eindpunt nadert.

1. Toevoegen een vooraf bepaald bedrag (zie hierboven) van mannanases (GH5 en GH26 ¹¹) om de lucht aliquots in de buffer uit stap 3.5, evenals een positieve controle (30 µg konjacglucomannaan), en een neen-AIR negatieve controle (enzym mix in een lege buis). Vortex en vervolgens draai kort voor het verzamelen van het reactiemengsel in de onderkant van de buis.
2. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C (of de juiste temperatuur voor de GH van keuze) met zachte agitatie (~ 100 rpm).
3. Zet de reactie stop door broeden bij 95 ° C gedurende 20 min.
   Opmerking: Cap sluitingen kunnen worden gebruikt voor het afdichten van flip-top microfuge buizen.
   1. Centrifugeer met behulp van een bank top microfuge op maximale snelheid gedurende 10 minuten, en behouden van supernatant.
4. Resuspendeer de pellet in 250 µL H ₂ O, centrifuge zoals hierboven, en behouden van supernatant.
5. Combineren beide supernatant en drogen in een vacuüm centrifuge (Zie de Tabel van materialen) bij 30 ° C (~ 3 h of 's nachts zonder verwarming).

5. Opstelling van Oligosaccharide normen

1. voorbereiden 1 mM voorraad oplossingen in H ₂ O van mannose (Man), mannobiose (Man ₂), mannotriose (Man ₃), mannotetraose (Man ₄), mannopentaose (Man ₅) en mannohexaose (Man ₆), alle β, 1-4 gekoppeld. Aliquot en opslag bij-20 ° C tot vereist.
2. 3 verschillende concentraties van een Man _1-6 mengsel te bereiden door het combineren van 1 µL (standaard S1), 2 µL (S2) of 5 µL (S3) van alle zes.
3. Droog in een vacuüm centrifuge (Zie Tabel van materialen) bij 30 ° C (~ 1 h).

6. Derivitization van oligosacchariden

1. voorbereiden een stamoplossing van 0,2 M MIEREN (8-Aminonaftaleen-1,3,6-trisulfonic zuur) in H ₂ O: azijnzuur 17:3. Warme voorraad naar 60 ° C tot het volledig los van de vaste stof. Opslag bij-20 ° C, beschermd tegen licht, voor 2-3 maanden.
2. Bereiden een 0,2 M stockoplossing van 2-Methylpyridine boraan (2-PB) in DMSO. Dit is zeer hygroscopisch, resuspendeer dus onmiddellijk alle poeder na ontvangst in DMSO. Aliquot, en winkel bij-20 ° C gedurende 1-2 jaar. Ontdooien aliquots als vereist (winkel bij 4 ° C gedurende 2 weken, en vervolgens ontdoen).
3. Bereiden de buffer van de bewerking van H ₂ O: acetic acid: DMSO op 17:3:20.
4. Aan elk monster, voeg 5 µL van MIEREN, 5 µL van 2-PB en 10 µL van bewerking buffer. Spin kort te verzamelen in de onderkant van de buis, vortex grondig, en draai vervolgens kort opnieuw. Zie afbeelding 1 voor reactie beschrijving.
5. Incubate monsters overnachting bij 37 ° C, beschermd tegen licht.
6. Droog in een vacuüm centrifuge (Zie Tabel van materialen) bij 30 ° C (~ 2 h).
7. Resuspendeer monsters en standaard in 100 µL 3 M ureum. Opslag bij-20 ° C, beschermd tegen het licht totdat vereist.

7. Voorbereiding van tempo gels

Opmerking: vergadering van de gel gieten apparatuur zal afhangen van het merk. Hier wij use een verticale elektroforese-systeem (Zie Tabel of Materials), uitgerust met 18 x 24 cm glazen platen en 1,5 mm afstandhouders.

1. Monteren gel gieten apparatuur per de fabrikant ' s instructies.
2. Make 10 x tempo buffer (1 M Tris-boraat, pH 8.2) als volgt: Meng 121.14 g voor Tris-Base ~ 400 mL H ₂ O en mix te ontbinden. Breng de pH op 8.2 door toevoeging van solide boorzuur (ongeveer 60 g) en breng op volume maximaal 1 L.
3. Maak een 10% (m/v) ammonium persulfate (APS) voorraad in H ₂ O. Aliquot eenmaal opslaan bij-20 ° C. dooi aliquots bewaren bij 4 ° C en, na 2 weken negeren.
4. Maken en giet het oplossen gel. Voor de bovengenoemde apparatuur 1 gel gelijkstaan aan 50 mL. In een centrifuge tube van 50 mL, meng H ₂ O (20.2 mL), 5 mL 10 x tempo buffer, 24.6 mL 40% acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis). (Let op: giftig).
   1. 200 µL van APS en 20 µL van N, N, N, N´-tetramethyl-ethyleendiamine (TEMED) toevoegen. Omkeren voorzichtig te mengen (om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen). Giet de gel met een serologische of andere groot volume Pipet, ~ 4 cm onder de bovenkant van de glasplaten. Aandacht besteden aan de mogelijkheid van luchtbellen krijgen gevangen in de gel. Als ze doen, stop gieten en tilt/kraan de gel om hen vrij te geven.
5. De gel met isopropanol (Let op : brandbaar) of, zorgvuldig, met H ₂ O. toestaan gel te polymeriseren (20-30 minuten), dan giet af de bovenste laag bedekken. Als isopropanol werd gebruikt, daarna wassen 2 x met H ₂ O. droog iedere overtollige vloeistof met behulp van vloeipapier.
6. Maken en giet de stapelvolgorde gel. Meng 6.8 mL H ₂ O, 1 mL 10 x tempo buffer, 2,8 mL acrylamide/Bis-acrylamide (Let op: giftige), 80 µL APS en 8 µL van TEMED in een centrifugebuis 15 mL. Omkeren als u wilt mengen en overlay op de top van gepolymeriseerde oplossen gel. Zachtjes invoegen kammen, het vermijden van overlapping luchtbellen onder de kam tanden.
7. Toestaan gel om het polymeriseren (20-30 min), wikkel in vochtige weefsel en vervolgens in plastic omslag, en bewaren bij 4 ° C totdat vereist. Winkel met de kammen in plaats.
   Opmerking: Tempo gels kunnen worden opgeslagen voor een maximum van 2 weken (hoewel minder dan 1 week ideaal is), als ze worden gehouden vochtige.

8. Met een tempo Gel

1. gebruik van een permanent marker op het etiket van de goed posities op het glas, die helpen zal bij het bijhouden van de volgorde van laden, en in het identificeren van waar de putten zijn zodra de kam is verwijderd.
2. Verwijder de kam. De putjes vullen met 1 x tempo buffer.
3. Gebruiken een 10 µL microsyringe om te laden 2 µL van normen en monsters in putten. Vermijd het gebruik van de ultraperifere rijstroken, die de neiging om voorbeelden van slecht uitvoeren.
4. Monteren van het Hogerhuis van het gel-running-apparaat, en plaats de gel in een gekoeld (~ 10 ° C) lopende tank (10 ° C) met 1 x tempo buffer. Vul het Hogerhuis met 1 x tempo buffer.
5. Zet de macht, en run de gel bij 200 V (constante V) voor 30 minuten, waarna de verhoging van de spanning tot 1000 V voor 1 h 40 minuten. Gels beschermen tegen licht (bijvoorbeeld door inwikkeling van tanks in zwarte vuilniszakken).
   Opmerking: Controleer op de gels ~ 5 min na het inschakelen van de spanning, en dan nog eens 5 minuten na een stijging van de spanning tot 1.000 V. Als het aggregaat niet in staat om de spanning dan is er waarschijnlijk een buffer lek is. De gel uit de tank te verwijderen. Monteer het Hogerhuis, zorgvuldig controleren plaatsing van alle pakkingen. Een grote chip op de bovenrand van de glasplaat kan voorkomen dat de plaat vormt een goede afdichting met de pakking. Dit kan meestal worden tijdelijk opgelost door toevoeging van een daling van 5% (m/v) gesmolten agarose aan het afgestoken deel van het glas, voordat u toevoegt het Hogerhuis.

9. Visualiseren van een tempo gel

Opmerking: gebruik een gel imaging systeem uitgerust met langegolf UV lampen in de transilluminator, en een uitstoot-filter voor de camera die geschikt is voor de fluorophore, hier 530 nm. U kunt ook een laserscanner kan ook worden gebruikt, zoals beschreven in Goubet ².

1. Na de gel imaging systeem Stofdroog is door te vegen het met vochtige pluisvrije weefsel.
2. Verwijderen van de gel uit de tank tempo, en kort bekijken terwijl de gel nog steeds in de glazen platen is (< 80 ms) om te bepalen als de kleurstof voorzijde nog steeds op het gel is.
3. Opent de gel met een wig-gereedschap, en terwijl gel nog steeds op een glazen plaat is, een pizza cutter gebruiken om zowel de stapelvolgorde gel en, als de kleurstof voorzijde nog steeds op de gel, de onderkant van de gel is.
4. ~ 5 mL H ₂ O zet op het oppervlak van de transilluminator, en breng de gel rechtstreeks op de transilluminator. Het filter ingesteld op UV 605 en inschakelen van de lange golf UV-transilluminator (Zie Tabel van materialen) het softwarematig.
   Opmerking: De fluorophore van de MIEREN hier gebruikt heeft een excitatie/emissie van 353/520 nm.
5. Nemen verschillende afbeeldingen op verschillende tijdstippen van de blootstelling (bijvoorbeeld 100 ms tot en met 10 s). Zorg ervoor dat het UV-licht tussen afbeeldingen door te klikken op de knop UV licht (het om uit te schakelen) om te voorkomen dat de fluorescentie vernederende is uitgeschakeld. Ervoor zorgen dat ten minste 2 van de beelden geen verzadigde bands hebben (de gel beeldbewerkingssoftware zal dit aangeven).
Bestanden van het opslaan van de
6. als beelden van de hoge-resolution.tif.
   Opmerking: Afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met behulp van de software die wordt geleverd met de gel imaging systeem, of met behulp van vrij beschikbare beeld analysesoftware, zoals ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Zie het gedeelte ' resultaten ' voor een bespreking van de kwantificatie.

Results

Hier laten we zien een voorbeeld tempo gel voeren per het protocol, met daarnaast een beschrijving om te helpen bij de interpretatie van de gegevens en het oplossen van problemen, en dit wordt gevolgd door een algemene gids voor succesvol tempo^13,16van de interpretatie van de gel. Een representatieve gel van een standaard tempo kwantitatieve analyse van de celwand mannan inhoud is afgebeeld in Figuur 2, en wordt beschreven lane door lane.

Normen
Rijstroken 1, 2 en 3 tonen een ladder van commercieel aangeschafte oligosacchariden (Man₁- Man₆) op 5 (S1), 10 (S2) en 50 (S3) pmol concentratie. Wanneer u een nieuwe partij van een commerciële oligosaccharide ontvangt, is het belangrijk om te controleren de zuiverheid op een gel. Vele oligosacharide, met name tetrasacccharides en meer, kunnen aanzienlijke verontreiniging met oligosacchariden van andere graden van polymerisatie (DPs), zoals hier wordt weergegeven voor Man₆ (gemarkeerd met *). Terwijl een gel quantitating, is het belangrijk om ten minste 3 concentraties van de normen, omdat het noodzakelijk is voor de berekening van de standaard curve is. Berekening van de standaard curve kunnen ook nuttig zijn om ervoor te zorgen dat de bewerking reactie in wezen bij voltooiing is. Normen van bekende concentraties vergelijkingen tussen gels, en zijn een handig besturingselement voor scheiding en kwaliteit van de bewerking.

Positieve controle
Lane 4 toont een mannanase vertering van konjacglucomannaan. Konjacglucomannaan is commercieel beschikbaar, en terwijl het geen dezelfde structuur als die, bijvoorbeeld, gevonden in Arabidopsis, het dient twee doelen. Ten eerste, het is een belangrijk controle voor de enzymatische vertering. De onderzoeker moet vaststellen wat een commerciële substraat verteerd met hun GHs van keuze eruit wanneer verteerd tot voltooiing (dat wil zeggen, een grote overmaat van GH wordt toegevoegd aan de reactie). Als in de toekomst experimenten het patroon verandert, kan dit duiden op een verlies van activiteit of besmetting van de voorraad GH. Ten tweede dient het als een besturingselement voor de reactie van de bewerking in de aanwezigheid van het enzym en buffer zouten. Als de normen er goed uitzien, maar de positieve controle slecht, is dan dit erop wijzen kan dat een onderdeel van de hydrolyse-reactie remmende aan de bewerking is.

Wild type (WT) Arabidopsis vloeien voort lucht + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane-5 toont de tempo-vingerafdruk van de WT Arabidopsis stang (vergelijk met verwijzingen^11,14).

csla9 Arabidopsis vloeien voort lucht + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 6 toont toont de tempo-vingerafdruk van de stengel van een Arabidopsis plant ontbreekt de belangrijkste stammen mannan synthase¹¹. Vingerafdrukken te vergelijken met de WT en de negatieve controle. Terwijl de meerderheid van de mannan afwezig is in deze fabriek, een kleine hoeveelheid blijft, zoals blijkt uit de verminderde band intensiteiten voor alle mannanase afkomstige oligosacchariden dit wordt gesynthetiseerd door extra mannan synthases (CSLA2, 3)¹¹.

Negatieve controle - enzym alleen
Lane 8 toont bands op de gel die geen specifieke die afkomstig zijn van verontreinigingen in de mannanase cocktail, en van de analyse moeten worden uitgesloten (gemarkeerd met *).

Negatieve controle - WT lucht alleen
Lane 9 toont bands op de gel die niet specifiek zijn en moeten worden uitgesloten van de analyse (gemarkeerd met *).

Negatieve controle- csla9 Alleen AIR
Lane 10 toont bands op de gel die niet specifiek zijn en moeten worden uitgesloten van de analyse (gemarkeerd met *).

Pine hout lucht + mannanase cocktail (GH5 + GH26)
Lane 7 toont de tempo-vingerafdruk van grenen hout, waarin galactoglucomannan. Dit heeft duidelijk een ander patroon van vrijgegeven oligosacchariden aan Arabidopsis, als gevolg van de verschillende structuur.

Negatieve controle - Pine lucht alleen
Lane 11 toont bands op de gel die niet specifiek zijn en moeten worden uitgesloten van de analyse (gemarkeerd met *).

Interpretatie van een tempo gel is relatief eenvoudig, maar bewust te maken van de volgende punten vereist. Voor betrouwbare gegevens, is het aanbevolen om uit te voeren tempo op ten minste 3 onafhankelijk gegroeid biologische gerepliceerd, en het is raadzaam voor het uitvoeren van ten minste 2 technische wordt gerepliceerd op elke biologische repliceren. De besturingselementen beschreven staan kritisch tegenover voor interpretatie, zoals niet-specifieke banden moeten worden uitgesloten. We raden ook aan het laden van de monsters in een andere volgorde op repliceren gels, uit te sluiten van de effecten die uit ongelijke verlichting door de transilluminator voortvloeien. Nauwkeurige interpretatie vereist analyse van banden die niet zijn verzadigd. Aangezien sommige oligosaccharide vingerafdrukken beide zeer hoge en lage overvloed polysacchariden bevatten kunnen, raden wij analyseren meerdere belichtingen van de dezelfde gel. De normen kunnen worden gebruikt om te normaliseren tussen verschillende beelden.

Voor bepaalde typen experimenten, kan het wenselijk te kwantificeren van het bedrag van de polysacharide in de voorbereiding van de lucht. Terwijl het mogelijk is te kwantificeren van een tempo gel, het vereist kennis van de exacte moleculaire identiteit van elke oligosaccharide uitgebracht door het GHs en waar het is gelegen op het tempo gel. Dit is momenteel niet volledig bekend voor mannan, maar voor andere polysacchariden bv Xylaan³is vastgesteld. De normen bieden een manier van normaliseren tussen gels, zelfs wanneer de kwantificatie niet wordt uitgevoerd, en dus in elke kwalitatief of semi-kwantitatieve analyse zal helpen.

Identificatie van de structuur van individuele oligosacchariden kan worden bereikt met behulp van cocktails van GHs. opeenvolgend toevoeging van verdere GHs kan onthullen details over verbanden en vervangingen van de vrijgegeven oligosacchariden (b.v., toevoeging van β - 1,4 - glucosidase dat besluiten op het einde van niet-reducerende zal onthullen welke oligosachariden in het mengsel die functie bevatten). Beschikbare enzymen omvatten galactosidases, glucuronidases en glucosidases (Zie de CAZy database¹⁶ voor meer informatie); Zie Hogg, D. et al. ¹⁷ als voorbeeld.

Het bovenstaande protocol kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de activiteit van onbekende GHs. In dit geval moet een gedefinieerde biomassa, zoals Arabidopsis stam of konjac glucomannan, worden gebruikt om het scherm van de onbekende GHs-¹³.

Figuur 1 : Dit toont de regeling voor de fluorescerende bewerking van oligosacchariden met MIEREN. Vanaf Goubet²gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Vertegenwoordiger tempo gel tonen de mannan-vingerafdruk van Arabidopsis, pijnbomen en een mutant Arabidopsis (csla9) die heeft verminderde mannan biosynthese. AlR was gehydrolyseerd met een cocktail mannanase, en de vrijgegeven oligosacchariden waren derivatized met een fluorophore. De oligosacchariden werden gescheiden door de Elektroforese van het gel op basis van grootte, vorm en kosten. Een ladder van manno-oligosacchariden (Man1-6) wordt weergegeven om te helpen bij het identificeren van relatieve mobiliteiten van de vrijgegeven oligosacchariden en een hydrolyse van gezuiverde mannan (afgeleid van konjac) wordt weergegeven als een positieve controle. * = niet-specifieke banden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

TEMPO is een eenvoudige methode voor het karakteriseren van polysaccharide structuur. Het kan worden toegepast om een polysaccharide waarvoor er zijn bekende GHs met gekarakteriseerd activiteit, zie talrijke voorbeelden in de literatuur^1,6,9,11. TT is ook toegepast op de karakterisering van nieuwe GHs^12,13,18 en glycosyltransferases⁹, door gebruik te maken van gedefinieerde polysaccharide substraten en acceptanten.

Reproduceerbaar, interpreteerbaar resultaten zijn afhankelijk van drie belangrijke stappen. Als eerste moet het GHs gebruikt worden vrij van verontreiniging van de activiteiten. Dit is het beste bereikt door alleen met behulp van geïnfecteerd uitgedrukt, affiniteit gezuiverd enzymen. Ten tweede, voor de meeste experimenten is het belangrijk dat de enzymatische hydrolyse van de substraten bij voltooiing is. Dit zal ervoor zorgen dat het dezelfde biomassa gehydrolyseerd met de dezelfde GH de zelfde vingerafdruk in elk experiment geeft. Tot slot moet er een teveel aan fluorophore in de reactie van de bewerking. Dit zorgt ervoor dat de beschikbare reducerend uiteinden zijn geëtiketteerd op bijna 100%. Dit zal resulteren in hoge reproduceerbaarheid van de resultaten, alsmede kwantitatieve gegevens.

Gel en reagens kwaliteit zijn essentieel voor het waarborgen van reproduceerbare gegevens. Slechte kwaliteit buffers, vooral van onjuiste pH, luchtbellen in de gel en monsters met een overmaat aan zout kunnen alle invloed resolutie en retentie factor van de oligosacchariden. Opneming van de aanbevolen besturingselementen beschreven in de sectie Protocol en resultaten zullen echter inschakelen oplossen.

TEMPO wordt beperkt door haar vermogen om te identificeren oligosacchariden. Voor sommige experimenten is een eenvoudige vingerafdruk alles wat nodig is. Als u wilt werkelijk het kwantificeren van het bedrag van glucomannaan in een monster van de lucht, bijvoorbeeld, de identiteit van alle vrijgegeven oligosacchariden is echter vereist, dat is een tijdrovend proces. Dit is eenvoudiger voor minder complexe polysacchariden zoals Xylaan³. Aangezien er weinig oligosaccharide normen verkrijgbare, wellicht het altijd niet mogelijk of wenselijk is om te identificeren alle banden. TEMPO kan in dit geval zeer gratis gegevens aan massaspectrometrie (dat wil zeggen, MALDI-CID⁹ of ESI-MS⁷en NMR⁶) leveren. Voor deze methoden is het vaak handig om een grootschalige voorbereiding, scheiden door grootte-uitsluiting chromatografie en vervolgens analyseren elke breuk door beide tempo voorafgaand aan MS of NMR. Terwijl er werd gemeld dat de banden kunnen worden weggesneden en geïdentificeerd door MALDI-CID, in de praktijk gebleken dat dit een laag tarief voor succes (mogelijk te wijten aan interacties van de gelabelde oligosacchariden met de acrylamide gel heeft bij blootstelling aan UV-licht).

De andere grote beperking van tempo is doorvoer. Om goede kwaliteit, interpreteerbaar gels met de juiste besturingselementen, elke gel alleen ~ 10 experimentele monsters zal hebben, en een onderzoeker te lopen ~ 4 tempo gels per dag kunt verwachten. Een versie van gelijke tred met behulp van capillaire elektroforese (CE) heeft onlangs ontwikkelde¹⁹, waarmee de bereiding van de monsters in 96-wells-platen. Het is gebruikt met succes te karakteriseren glycosyltransferase enzym activiteiten en polysaccharide structuren^6,19, hoewel het vereist toegang tot een CE machine, die kan worden duur om te kopen en te onderhouden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligosaccharide Standards
Mannose	Sigma-Aldrich	CAS 3458-28-4
Mannobiose	Megazyme	CAS: 14417-51-7
Mannotriose	Megazyme	CAS: 28173-52-6
Mannotetraose	Megazyme	CAS: 51327-76-5
Mannopentaose	Megazyme	CAS: 70281-35-5
Mannhexaose	Megazyme	CAS: 70281-36-6
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)	Megazyme	P-GLCML
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other specialty chemicals
8-Aminonaphthaleen-1,3,6-trisulfonzuur	(Molecular probes) Thermo	A350
2-picoline boraan	TCI	B3018
40% acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)	Bio-rad	1610146
Name	Company	Catalog Number	Comments
Special Equipment
Gel gietkit	Hoefer	SE660 kit	18x24 cm glas platen, 0.75 mm ruimtemakers
Koelende recirculerende waterbad	Hoefer	RCB20-plus 115v	Moet in staat zijn om de temperatuur op ~10 C te houden
G:Box Chemi XRQ Imaging System	Syngene	05-GBOX-CHEMI-XRQ	Bestel met filters die geschikt zijn voor fluorforen, en transilluminator moet zijn uitgerust met langgolf UV-lichtbulbs
Hoogspanningsvoeding	Thermo	EC1000XL	1000V
Vacuumcentrifuge (Speedvac)	Savant	SPD131
Verticaal Gel elektroforese systeem	Hoefer	SE660
Glycosyl hydrolasen
Deze kunnen worden verkregen bij bedrijven, bijv. Megazyme (https://www.megazyme.com/) of Prozomix (http://www.prozomix.com/), of kunnen in huis worden geëxpresseerd door het plasmide aan te vragen bij de relevante onderzoeksgroep.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab supplies
15 ml Centrifugeerbuis (Falcon Centrifugeerbuizen, Polypropyleen, sterieel, Corning)	VWR	21008-918
50 ml Centrifugeerbuis (Falcon Centrifugeerbuizen, Polypropyleen, sterieel, Corning)	VWR	21008-951
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Gel beeldvorming software (Genesys)	Syngene