Methodenartikel

Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

DOI:

10.3791/56436

⸱

28 december 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gekweekte knaagdier hersenen segmenten zijn handig voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire werking van neuronen en glia in een omgeving die veel van hun normale in-vivo -interacties onderhoudt. Segmenten die zijn verkregen uit een verscheidenheid van transgene muis lijnen of gebruik van virale vectoren voor expressie van fluorescently tagged proteïnen of verslaggevers in wild type hersenen segmenten toestaan voor hoge resolutie beeldvorming door fluorescentie microscopie. Hoewel verschillende methoden zijn ontwikkeld voor de beeldvorming van de hersenen segmenten, segment cultuur te combineren met de mogelijkheid voor het uitvoeren van heeft repetitieve high-resolution beeldvorming van specifieke cellen in levende segmenten over lange perioden problemen opgeleverd. Dit is vooral waar wanneer virale vectoren worden gebruikt voor de expressie van exogene eiwitten omdat dit het best in een gesloten systeem gebeurt ter bescherming van gebruikers en voorkoming van kruisbesmetting. Eenvoudige modificaties aan de roller buis hersenen segment cultuur methode die voor de repetitieve high-resolution beeldvorming van segmenten in vele weken in een gesloten systeem zorgen worden gemeld. Het kweken van segmenten op photoetched coverslips staat het gebruik van fiducial merken snel en nauwkeurig verplaatsen in het werkgebied naar het identiek veld image na verloop van tijd vóór en na verschillende behandelingen. Voorbeelden staan voor het gebruik van deze methode in combinatie met specifieke neuronale kleuring en meningsuiting te observeren van veranderingen in het hippocampal segment platform, virale-gemedieerde neuronale expressie van fluorescente proteïnen en de ontwikkeling van cofilin pathologie, die werd eerder waargenomen in de hippocampus de ziekte van Alzheimer (AD) in reactie op de behandeling van het segment met oligomeren van amyloid-β (Aβ) peptide.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primaire cultuur van gedissocieerde neuronen uit regio's van knaagdier hersenen is een belangrijk instrument dat wordt gebruikt door onderzoekers te observeren van de reacties op pathologically betrokken prikkels. Dergelijke studies hebben echter het nadeel van neuronen in enige 2D en zonder hun gliale steunregeling kijken. Bovendien, tenzij geteeld onder omstandigheden van zeer hoge dichtheid (640 neuronen/mm2 of ongeveer 16% van de oppervlakte) waarin het onmogelijk is te volgen de willekeurige uitvloeisel van een dendriet of axon voor meer dan een korte afstand van de cel lichaam, hippocampal neuronale levensvatbaarheid daalt meer dan 4 weken aanzienlijk1, beperking van het gebruik van gedissocieerde culturen voor uitgebreide studies van leeftijdsgebonden aandoeningen. Het kweken van segmenten van knaagdier hersenen bereid is een aantrekkelijke optie die deze beperkingen overwint door het behoud van een georganiseerde cel architectuur en levensvatbaarheid voor weken of maanden. Voorwaarden voor het behoud van vele verschillende regio's van knaagdier hersenen in segment cultuur geweest beschreven2.

Twee methoden worden veel gebruikt voor langetermijnkweek van hersenen segmenten: kweken op membranen op de lucht-liquid interface3 of kweken op coverslips in verzegelde buizen kan draaien in een incubator van de roller om beluchting4. Segmenten gekweekt op membranen kunnen rechtstreeks worden beeld met hoge-resolutie fluorescentie microscopie via een rechtop Microscoop en water onderdompeling doelstellingen5. Als alternatief, plakjes gekweekt op membranen zijn overgedragen aan glazen bodem gerechten om goede oplossing van dendritische spines met behulp van een omgekeerde Microscoop6te bereiken. Echter zijn beide methoden van imaging segmenten geteeld op membranen open systemen die vereisen middellange wijzigingen en vaak Antimycoticum en/of antibiotica te gebruiken om te voorkomen of verminderen van verontreiniging5,6. Segmenten op een membraan op de lucht-medium-interface onderhouden uitstekende morfologie en overleving, maar terug te keren naar exacte locaties tijdens herhaalde beeldvorming bij hoge vergroting is uiterst moeilijk, tenzij het experiment alleen kleine groepen van cellen volgt geeft uiting aan een fluorescerende marker. Hoewel segmenten geteeld op membranen zijn gebruikt met virale-gemedieerde expressie van transgenen5,6, vereist bioveiligheid protocollen een gesloten cultuur-systeem worden gebruikt voor bepaalde virale vectoren die worden gebruikt voor uitdrukken van fluorescently geëtiketteerde eiwitten en verslaggevers van celfysiologie. Bovendien vereisen de onderdompeling doelstellingen decontaminatie tussen monsters die wordt gevolgd in cultuur5. Een belangrijke toepassing van membraan interface culturen is het combineren van high-resolution beeldbewerking met electrofysiologie op keer punten7.

De roller buis methode met coverslips in de kunststof buis niet elke electrofysiologie of hoge resolutie imaging zonder het verwijderen van het dekglaasje aan toe. Dus, deze methode is meestal vereffend langetermijnstudies waarin na fixatie opmerkingen hebben gesteld8. Hier wordt beschreven, is een methode die maakt gebruik van de roller techniek voor de cultuur van de buis maar op geboord-out buizen met plakjes op coverslips die herhaaldelijk beeld kan worden voor zo lang als de culturen worden gehandhaafd. Het gesloten systeem vereist geen middellange verandering voor imaging en maakt gebruik van photoetched coverslips om fiducial merken waarmee imaging op hoge vergroting, na dagen of weken, de precieze velden eerder beeld.

Wij hanteren deze methode te onderzoeken van wijzigingen in het knaagdier zeepaardje, een grote hersenen regio betrokken bij geheugen en leren. De knaagdieren hippocampus is vaak bestudeerd als een model voor pathologische of leeftijd-gerelateerde veranderingen waargenomen tijdens de ontwikkeling van cognitieve stoornissen9, zoals die zich in AD voordoen. Onze methode is bijzonder goed geschikt voor het bestuderen van pathologische veranderingen die zich binnen een enkel sneetje na verloop van tijd in reactie op veranderingen in het milieu, zoals verhogingen in Aβ peptides ontwikkelen, die is kenmerkend voor AD8. Een pathologie, gekoppeld aan menselijke en knaagdier AD brein is de aanwezigheid van cofilin-actine aggregaten en staven, de laatste met bundels van filamenten waarin cofilin en actine zijn in een 1:1 verhouding van de molaire10,11,, 12. staven zijn waargenomen in vaste segmenten van rat hippocampus na Aβ behandeling, alsmede binnen een segment van de levende knaagdieren hersenen cofilin-GFP onderworpen aan hypoxie8uitdrukken, en zij kunnen bijdragen tot de synaptische dysfunctie gezien in AD en beroerte. Hier gebruiken we deze nieuwe kweken methode om het observeren van het tijdsverloop en de distributie in de segmenten van uitgedrukt exogene chimeer fluorescente proteïnen die leidt door verschillende virussen. Vervolgens gebruiken we de neuronale specifieke uitdrukking van een cofilin verslaggever construct te volgen van de ontwikkeling van cofilin staaf en statistische Pathologie in hippocampal plakjes in reactie op behandeling met oplosbare Aβ oligomeren (Aβo).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierlijke gebruik volgt goedgekeurde fok- en gebruik van de dierlijke protocollen die voldoen aan de Animal Care en gebruiken richtsnoeren van Colorado State University.

Opmerking: Het protocol hieronder de voorbereiding en cultuur wordt methode beschreven voor de langdurige incubatie en intermitterende beeldvorming van hippocampal segmenten. Een enkel hippocampal sneetje is gekoppeld aan een speciaal geprepareerde photoetched dekglaasje aan met behulp van een plasma-clot, en vervolgens de coverslips op de platte kant van een buis geboord-out roller, die wordt onderhouden in een incubator roller zijn verzegeld. Plasma stolsels worden opgelost met Plasmine voordat virale infectie voor fluorescerende eiwit expressie en hoge resolutie beeldbewerking. Een fluorescerend neuronale vitale kleurstof wordt gebruikt om het imago van neuronen binnen de segmenten.

1. voorbereiding van de Roller buis Rack

  1. Gebruik de sjabloon weergegeven in Figuur 1A afgedrukt naar de grootte weergegeven op de balk van de schaal. Punch met een nagel, kleine gaatjes (groot genoeg voor een fijne punt marker) in de sjabloon die is gecentreerd op de gaten.
  2. Instellen van de sjabloon op de bodem van een schotel weefselkweek 15 cm (nominale diameter 14 cm) en markeer de positie van de gaten. Herhaal dit op een tweede schotel.
  3. Met boor bits ontworpen voor gebruik op plastic, boorgaten zes 1,5 cm diameter op elke schotel in een zeshoekig matrix (4,8 cm center-naar-midden) met gat centra 2,5 cm vanaf de rand van de schotel. Boorgaten drie (diameter 3 mm) 12 mm van de rand die equidistantly tussen twee van de grotere gaten zoals aangegeven in Figuur 1Azijn geplaatst.
  4. Met de bodem van elk gerecht een 2,5-inch lange Machineschroef (3/16 inch diameter) tegenover elkaar, plaats met een vlakke wasmachine via een van de kleine gaatjes, gevolgd door een tweede platte ring, een stuk polyethyleen buis (spacer, 4,7 cm), een andere vlakke sluitring , de tweede weefselkweek schotel, een andere platte ring, een borgring en een moer.
  5. Herhaal stap 1.4 op de andere twee schroeven van de machine, en aanscherping losjes totdat alle schroeven van de machine aanwezig zijn. Draai daarna de noten veilig.
  6. De grommets (5/16 inch dik, 5/8 inch gat diameter) werken in de gaten van de schotel van de bodem te verkrijgen van de laatste roller buis rack (Figuur 1B; weergegeven met twee buizen in plaats). Plaats een sticker op elk rack met een uniek nummer.

2. voorbereiding van de Roller buizen en Coverslips

  1. Het maken van de mal voor het boren van het gat in de roller buizen
    1. Boor een gat van 1,5 cm 8 cm diep in de centrum-zijde van een 2 x 4 x 5,5 inch houten blok onder een hoek van dergelijke bijna parallel met het blok als ingevoegd dat de platte kant van de roller buis zal worden(Figuur 2).
    2. Vergroten van het gat met een ronde houten bestand zowel verbreden en het gat zodat de buis inbrengen taps (roller buizen zijn lichtjes grotere diameter in de buurt van het einde van het GLB) (Figuur 2B).
    3. Boor een verticale gat van 1,5 cm diameter, 5.5 cm vanaf de kant van het blok, en gecentreerd over de kant gat (Figuur 2C).
    4. Wanneer het gat kant is genoeg tapered, plaatst u een roller-buis die gemarkeerd is als op de gewenste plek te midden van het gat voor het segment en plaats de buis zodat de gemarkeerde plek wordt gecentreerd in het verticale gat van 1,5 cm.
    5. Verwijder de buis en meet de afstand van de plek aan het einde van de buis. Markeer deze afstand van het centrum van het gat in de mal en invoegen van een nagel om een stop om de juist positie de buis voor het boren (pijl in Figuur 2C).
    6. Gebruik een ijzerzaag af te snijden de nagel flush met het oppervlak van het hout blok om verwonding te verhinderen.
    7. Lente clips toevoegen aan de onderkant van de mal als er een boor pers met "slots" die het mogelijk maken om te worden verankerd (Figuur 2D zwarte pijl). Gebruik anders C-klemmen te houden van de mal veilig op de pers van de boor.
  2. Met behulp van de mal hierboven beschreven om te houden en een platte dubbelzijdige 11 cm kunststof cultuur buis met de platte kant omhoog(Figuur 2)positie, boor een gat van 6 mm diameter met het centrum 1,0 cm vanaf de onderkant en gecentreerd tussen de zijkanten van de buis.
    Opmerking: Een boor ontworpen voor plastic moet worden gebruikt.
  3. Met een draaibare deburring tool, de randen van het gat (Figuur 2E) vloeiend en maak 4 groeven aan de binnenkant rand van het gat (Figuur 2E, inset) ter vergemakkelijking van de drainage van het gat tijdens rotatie.
  4. Met een 12 mm gat punch, gesneden van 12 mm doorsnede schijven van niet-giftige dubbel zijdig zelfklevend silicon rubber bladen. Met behulp van een standaard één papier perforator (6 mm diameter), maak een gat in het midden van elke schijf.
  5. Spoel de geperforeerde buizen met 70% ethanol, lucht droog ze in een biologische veiligheidskast, en steriliseren van de buizen en de geponste adhesive discs voor 40 minuten onder de UV-lamp (30 W op gemiddelde afstand van 70 cm) in de biologische veiligheid kabinet.
  6. De buizen en verplaatsen schijven na 20 min zodat alle blootgestelde oppervlakken zijn gesteriliseerd. Onder steriele condities, schil de naturel back-ups maken van een zelfklevende schijf en brengt de silicone rubber aan de buitenkant van een buis, uitlijnen van de gaten (Figuur 2F).
    Let op: Om te voorkomen dat UV-blootstelling, Oogbescherming dragen en sluit het kabinet voordat ik overga op de UV-lamp.
  7. Schoon 12 mm diameter photoetched (100 center genummerd 1 mm pleinen) Duitse glas coverslips. Houd de coverslips zachtjes met een tang en duik in absolute ethanol, gevolgd door water, gevolgd door absolute ethanol weer, en ten slotte Dompel de coverslips in een vuurvlam te branden uit de ethanol. Toestaan coverslips om te koelen.
  8. Houd de coverslips met een tang en duik in de 2% 3-aminopropyltriethoxysilaan in aceton voor 10 s. spoelen de coverslips met ultrazuiver water en laat lucht droog.
  9. De coverslips instellen op steriele filterpapier binnenkant van een biologische veiligheid kabinet en zet aan de UV licht. Elke zijde van de coverslips gedurende 20 minuten bloot.
    Let op: Om te voorkomen dat UV-blootstelling, Oogbescherming dragen en sluit het kabinet voordat ik overga op de UV-lamp.

3. hippocampal Slice voorbereiding

  1. Voordat u begint de dissectie, kunt u het helften van tweesnijdend Scheermesjes voorbereiden door de weefsel chopper. Vouw de messen in de lengte zorgvuldig met vingers en snap doormidden.
  2. Spoel het mes helften met aceton met behulp van een wattenstaafje om hen, gevolgd door het spoelen in absolute ethanol schoon en lucht drogen.
Vóór montage steriliseren een half blad op de weefsel chopper, het door spoelen met 70% ethanol.
  • Volgen van de protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik de Commissie; na Isofluraan anesthesie, euthanaseren van 4-7 dagen oude muis of rat pup door onthoofding en verwijder het hoofd met de schaar of guillotine.
    Opmerking: Het protocol van de cultuur van het segment van hersenen is onafhankelijk van de muis of rat stam of genotype. Vele transgene muis lijnen met verschillende genetische achtergronden zijn gebruikt.
  • Spoel het hoofd met 70% ethanol, en breng dit in een 60 mm petrischaal. Tot de uiteindelijke montage van het segment van de hersenen op de roller buis, worden alle van de volgende stappen uitgevoerd in een laminaire flow kap te handhaven van de steriliteit.
  • Maak met een chirurgisch mes van #21 een Sagittaal knippen door de huid en de schedel. Met een #5 Dumont pincet terug peeling de huid en de schedel aan het blootstellen van de hersenen.
  • Met een gesloten tang, zachtjes plagen uit de hele hersenen, het vrijgeven van het door te knijpen met de verlostang via de hersenstam achter het cerebellum. Plaats de hersenen in een steriele 60 mm schotel met 4 ° C Gey de evenwicht zout Solution/0.5% glucose (GBSS/glucose).
  • Met behulp van een Microscoop dissectie te visualiseren van de hersenen (Figuur 3A), plaats de hersenen dorsale zijde omhoog en de voorste derde van de hersenen en het cerebellum afgesneden met een chirurgisch mes (Figuur 3B).
    1. Met een tang, houdt u de bijgesneden hersenen posterieure zijde omhoog en de ventrale zijde tegen de zijkant van de petrischaal voor stabiliteit. Zachtjes weg hersenvliezen rond de Sagittaal middellijn plagen en verwijderen van het weefsel van de veroorzaakt met behulp van een fijne pincet voor omver te werpen Dumont #5 (Figuur 3C, onderbroken cirkel).
    2. De twee sneden maken langs de kant van de hersenen om het te verspreiden openen (Figuur 3C, onderbroken lijnen). Zodra de hersenen wordt geplaatst dorsale zijde naar beneden en verspreiding open, de hippocampal horizontalis zichtbaar moet zijn (Figuur 3D, pijl).
    3. De verspreiding open hersenen overbrengen in een stukje polychlorotrifluoroethylene kunststoffolie en plaats deze voor het snijden in het werkgebied van een weefsel chopper. NAT van het mes met GBSS/glucose en hak de hippocampus in dikke sneden van ~ 300 µm.
    4. Spoel de gesneden hersenen uit de plastic folie in een vers 60 mm schotel met GBSS/glucose (Figuur 3E) met een precisiepipet overdracht. Zachtjes knijpen af en plagen weg, met fijne omver te werpen pincet, de resterende hersenvliezen en andere niet-hippocampal weefsel (Figuur 3F) van de segmenten (Figuur 3G, H).

    • 4. plating segmenten

    1. Zodra segmenten zijn verkregen, plaats 2 µL van kip plasma in het midden van de photoetched-kant van een voorbereide dekglaasje aan. Verspreid de plasma licht om een 3-4 mm doorsnede-plek.
      Opmerking: De photoetched kant is de bovenzijde van het dekglaasje aan wanneer bekeken via een dissectie Microscoop zodanig zijn dat de getallen correct georiënteerd zijn.
    2. 1 sneetje van de hersenen met een steriele spatel voor smalle-tip (Figuur 4A) naar de plek van de plasma (Figuur 4B) overbrengen. Gesloten pincet gebruiken om het segment op het puntje van de spatel terwijl het opheffen van het segment van de GBSS/glucose.
    3. Aanraken van de spatel de plasma plek op het dekglaasje aan, en met een gesloten tang, duw het segment op het dekglaasje aan.
    4. Mix-2.5 µL van plasma met 2,5 µL van trombine in een aparte buis. Plaats 2.5 µL van dit mengsel over en rondom de slice en Pipetteer op en neer snel voorzichtig te mengen (Figuur 4B).
      Opmerking: Het plasma zal stollen binnen 10-15 s, dus dit moet snel gebeuren. Als segment hechting een probleem is, Meng 5 µL plasma met 5 µL trombine en gebruik van 4-5 µL op het segment, het verwijderen van sommige na het mengen zodat het segment ligt plat op het dekglaasje aan.
    5. Verwijder de duidelijke plastic die van de blootgestelde zijde van de siliconen rubber lijm eerder op een roller buis aangebracht en plaats van het dekglaasje aan met het segment van de hersenen op de lijm uitlijnen van het segment binnen het gat (Figuur 4C).
    6. Om ervoor te zorgen de hechting, pressiemiddelen zacht, zelfs aan het dekglaasje aan met de duim door te drukken op het dekglaasje aan down gelijkmatig en te houden voor ongeveer 1 minuut terwijl over te dragen aan de biologische veiligheidskast.
    7. Voeg in een biologische veiligheidskast, 0.8 mL kweekmedium volledige Neurobasal A (Tabel van materialen) aan elke buis (Figuur 4D).
    8. Een 5% CO2%van het /95 mengsel van lucht door middel van een steriel katoenen-plugged Pasteur pipet veilig gehouden door een klem te stromen. Spoel de roller buis met het gasmengsel en de buis snel van het GLB als het uit is genomen rond de pipet.
    9. De buizen van een label met het Segmentnummer en rek nummer. Invoegen buizen in een roller rack, ervoor te zorgen dat zij zijn geometrisch evenwichtig. Als er een oneven aantal buizen, voeg buizen om evenwicht te brengen.
    10. Plaatsen van de rekken in een incubator van de roller 35 ° C met rollen draaien de roller hangklep langs over 10-13 RPH (Figuur 4E). Om te houden van het medium in de bodem van de buizen, tilt de incubator terug ongeveer 5° door het verhogen van de voorzijde op een bord.
    11. Het nummer van het segment en tube op een werkblad, dat wordt gebruikt voor het opnemen van alle informatie van segment behandelingen en observatie datums invoeren.
    12. Op ongeveer dag 6 in cultuur, voeg 1 µL (0.002 U) van actieve Plasmine aan elke buis.
    13. Nadat de stolsels volledig ontbinden verwijderen van het medium (gewoonlijk binnen een paar uur), en vervangen door verse medium zonder Plasmine. Indien nodig, segmenten kunnen worden geïncubeerd met Plasmine 's nachts en het medium veranderde de volgende dag.
    14. Segmenten worden meestal gedurende ten minste 7-10 dagen voor gebruik in proeven geïncubeerd. Medium gecombineerd en vervang deze op dag 3 of 4, weer op dag 7, en daarna om de 7 dagen.

    5. bereiding van virale vectoren transgenic expressie

    Opmerking: Uitdrukking van transgenen in de neuronen van segment culturen wordt bereikt met behulp van de hersenen van genetisch gemanipuleerde knaagdieren of door de invoering van de transgenic door infectie met recombinant replicatie gebrekkig virussen.Adenovirussen (AV), adeno-geassocieerde virussen (AAV) en recombinant lentivirus vectoren hebben alle gebruikt in onze hippocampal segment culturen voor expressie van verschillende fluorescente proteïne Chimaera in plakjes van de hersenen.

    1. Bereiden replicatie gebrekkig AV voor het uitdrukken van het RNA van belang volgens methoden die elders beschreven13,14. Titer de virussen voor infectieuze U/mL door de methode van de seriële verdunning met behulp van een antilichaam aan een viraal uitgedrukt proteïne als beschreven14. Te observeren cofilin aggregaten en de vorming van de staaf van de cofilin-actine, gebruik maken van de cofilin-R21Q-mRFP cDNA (plasmide #51279)16.
      Opmerking: De synapsin 1 promotor is een uitstekende keuze voor neuronale bijzondere uiting15, terwijl de promotor cytomegalovirus handig is voor het besturen van de expressie van de hoge niveaus in vele cel typen13.
    2. AAV door co transfectie van overdracht bereiden plasmide met het gen van belang en een rep/cap plasmide, met of zonder een helper plasmide, in HEK293 verpakking cellen, die de virale E1-gen, als eerder beschreven17,18 leveren.
      Nota: Recombinante AAV kan ook worden gemaakt voor gerichte plaatsing in de ontvangende cel genoom19. Voor de overdracht plasmide gebruiken we menselijke cofilin 1 met een C-terminal mRFP1 fluorescentie eiwit tag (plasmide #50856) gekloond in een synapsin promotor-bevattende AAV plasmide stroomafwaarts van de calcium sensor GCaMP5G20. Een stukje DNA codering de P2A zelf verbrijzelen peptide volgorde ingevoegd door PCR tussen GCaMP5G en cofilin-RFP tijdens de voorbereiding van de transfer plasmide om expressie van beide eiwitten van een enkele AAV transcript21.
    3. Bereiden van recombinante lentivirus vectoren door co transfectie van overdracht plasmide met de gen of cDNA van belang en integratie signalen, samen met een derde generatie lentivirus mengsel dat verdeelt de virale gag, pol, rev en vsv-g genen op verpakking drie aparte plasmiden22,23.
    4. Voor de overdracht plasmide, met een enkele stap klonen systeem24 u samenvoegen van de promotor van de synapsin en de cofilin-R21Q-mRFP cDNA (van plasmide #51279) tot pLKO.1-GFP (plasmide #30323), met de synapsin promotor en cofilin-R21Q-mRFP ter vervanging van de hPGK promotor en GFP cDNA, respectievelijk.
    5. Transfect de laatste plasmide in HEK293T cellen door calciumfosfaat als eerder beschreven23.
    6. Verzamelen van medium uit vier gerechten van 10 cm, concentreren op 500 µL met 150K-cutoff centrifugaal concentrators en opslaan van de laatste lentivirus bij-80 ° C in kleine porties na snel ingevroren in vloeibare stikstof. Ontdooi een aliquoot slechts eenmaal voor cellen te infecteren.
    7. Empirisch bepalen dat het volume van elk virustype bereid om de mate van expressie gewenst door het opzetten van een aantal verschillende segment culturen te volgen van de expressie van het transgenen na infectie met verschillende volumes van virus.
      Opmerking: Doorgaans, 1-10 µL van het virus wordt gebruikt per segment.

    6. slice behandelingen

    1. Segmenten met virus verpesting
      1. Werken in een biologische veiligheidskast goedgekeurd voor virus werk op de biologische veiligheidsniveau geschikt is voor de vector, Meng een aliquoot gedeelte van het virus (meestal 1-10 µL) met 0,8 mL volledige voedingsbodem.
      2. Gecombineerd het medium van het segment met behulp van een steriele Pipet van Pasteur in een val van de collectie met bleekmiddel. Een secundaire val wordt altijd tussen de eerste val en de vacuüm bron gebruikt.
      3. Vervang dit medium door het virus-bevattende aliquot bereid boven, de buizen cultuur terug te keren naar een rack en plaatsen in de incubator.
      4. Na 2-5 dagen van de segmenten met het virus in de biologische veiligheid kabinet aan het broeden, verwijderen van het virus-bevattende medium met een steriele overdracht pipet en plaats het in een fles met een goedgekeurde antivirale agent om te doden van virus.
    2. Kleuring van neuronen met vitale kleurstof
      1. Bereiden en aliquots van fluorescerende neuronale vitale kleurstof25 slaan door snelle bevriezing 4 µL van aliquots in vloeibare stikstof bij een concentratie van 100 µM en slaan deze bij-20 ° C. Niet vorst/dooi de kleurstof meer dan eens.
      2. Label neuronen voor visualisatie door fluorescentie microscopie, ontdooien van een aliquoot gedeelte van de neuronale vitale kleurstof en Verdun tot 4 mL in volledige Neurobasal medium (laatste kleurstof concentratie is 100 nM).
      3. Verwijder het medium van segmenten door aspiratie (of met een pipet overdracht als het medium virus bevat) en 0,8 mL van het medium met 100 nM neuronale vitale kleurstof te vervangen. De segmenten terug naar het apparaat van de roller in de incubator.
      4. Na het broeden van de segmenten voor 2 h, gecombineerd het kleurstof bevattende medium en 0,8 mL verse volledige voedingsbodem in een biologische veiligheidskast te vervangen.
        Opmerking: Etikettering van neuronen in plakjes met vitale kleurstof enkele uren van incubatie vereist. De eerste beelden zijn meestal genomen 24u na behandeling van de kleurstof. Hoewel neuronen worden specifiek aangeduid, is er achtergrond fluorescentie die meer dan 2-3 dagen weigert te geven beter neuronale imaging. Intensiteit van de vitale kleurstof daalt na 72 uur.
      5. Volg veranderingen in de morfologie van het segment na verloop van tijd en hernoemen de segmenten elke 7 dagen.

    7. slice Imaging

    1. Segmenten op een omgekeerde Microscoop bekijken. Voor de helderste fluorescentie beeldvorming, op 24u voor imaging, wisselen kweekmedium met volledige Neurobasal A medium zonder de fenol rood pH-indicator.
      Opmerking: Voor experimenten gemeld hier, segmenten worden bekeken op een omgekeerde draaiende schijf confocal fluorescentie Microscoop uitgerust met een lineaire gecodeerd x, y podium met piezo z controle en een gevoelige hoge resolutie digitale camera.
    2. Overdracht van de buis met de cultuur van het segment te worden aan de houder op maat buis (Figuur 5A), die wordt geplaatst in de fase adapter (Figuur 5B), houden het dekglaasje aan loodrecht op beeld uit de roller buis apparaat de doelstelling en het segment in dezelfde afdrukstand tijdens herhaalde imaging sessies over lange intervallen te handhaven.
    3. Duw de schuifregelaar op de fase adapter strak tegen de buis te houden van de buis in positie (Figuur 5B).
    Handhaaf segment temperatuur bij 35 ° C tijdens beeldvorming door gebruik van de verwarming van strips en een thermoregulatory-controller ingebouwd in de op maat gemaakte fase adapter (Figuur 5C).
    Opmerking: Gegevens van de houder van de buis, fase adapter en kachel kan worden geraadpleegd op: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • Met behulp van een lage kracht (bv., 4 X) objectieve en heldere veld transillumination, focus op het photoetched rasterpatroon (Figuur 6A) onder het segment. Voor de eerste sessie van de beeldvorming, snel scannen rond het segment om te zoeken en opnemen van het nummer voor de verschillende regio's waar hogere vergroting imaging is gewenst (bijvoorbeeldcornu ammonis (CA) 1, CA3, getand gyrus (DG), enz.).
  • Het werkgebied verplaatsen naar het eerste raster vierkant met een regio van belang. Schakel over naar de 20 X lucht doelstelling en zoek een fiducial mark (bv., tip van een geëtste nummer) (Figuur 6B).
  • Overschakelen naar een hogere macht doelstelling (40 X of 60 X), lokaliseer de fiducial mark, en vervolgens opnemen de x en y-positie van het werkgebied. Verplaats het podium te vinden op de velden van belang in de buurt en record hun x- en y-offsets van de fiducial mark (Figuur 6B, pijl). Herhaal in andere gebieden van het raster indien gewenst.
    Opmerking: Deze afgezet posities van de fiducial mark toestaan consistente dicht van dekglaasje aan dezelfde locatie als het segment is beeld, hoewel de originele x, y instelling van het fiducial merk wijzigt wanneer de buis of fase adapter worden verwijderd en vervangen.
  • Een opname Z-stack binnen elke geselecteerde veld met behulp van de Microscoop objectieve controle of een piezo fase controle, indien beschikbaar.
    Opmerking: Afbeelding vliegtuigen worden meestal verkregen met tussenpozen van 0,5 µm tot 2 µm, afhankelijk van de grootte en de gewenste resolutie van de afbeelding eigenschappen. Het opzetten van een 3D-beeld van de kwaliteit vereist dat imago functies over meerdere vlakken van overname uitbreiden, en dus om te visualiseren kleinere functies, kleinere intervallen tussen vliegtuigen nodig zijn.
  • De totale imaging tijd voor elk segment zo kort mogelijk te houden.
    Opmerking: De meeste imaging sessies gemeld hier waren onder 18 min/segment. Echter hebben we enkele segmenten tien of meer tijden, en zelfs als beeld zolang 40 min in een enkele sessie, zonder zichtbare schade in het voortbestaan van het segment.

    • Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Resultaten

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Om te bepalen hoe nauwkeurig fiducial merken kunnen worden gebruikt om dezelfde cellen binnen dezelfde velden PowerSchool na verloop van tijd, onderzochten we segmenten geteeld op photoetched coverslips (Figuur 6A). Neuronen zijn gevisualiseerd door kleuring met een vitale kleurstof (100 nM voor 2 h; doet geen vlekken non-neuronale cellen), die van neuronen verdwijnt na verloop van tijd zonder nadelige gevolgen voor de cellen

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Discussie

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    De hier beschreven methode van de roller-buis zorgt voor langdurige kweken en hoge resolutie live beeldvorming van gesneden hersenweefsel. Een groot probleem met het segment techniek zoals hier toegepast is in de montage en het onderhoud van segmenten. Dekglaasje aan coatings die ondersteuning bieden voor segment adhesie, bevorderen segment uitdunnen door het versterken van de uitgroei van neurites en migratie van de cellen van het segment; zo voorkomen we het gebruik van deze substraten. Het inbrengen van amino groepen ...

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    Bottoms from 15 cm culture dishesVWR Scientific25384-326
    Phillips Head Machine Screws (#10-32)Ace Hardware2.5" long and 3/16" in diameter
    Flat Washers #10ACE Hardware
    Machine Screw Nuts (#10-32)ACE Hardware
    Rubber Grommets ACE Hardware5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD
    Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID)ACE HardwareCut to 1.8" length
    Lock Washer #10ACE Hardware
    Drill Press, 5 speed Ace HardwareProTech Model 1201
    Nunclon Delta Flat-Sided TubesVWR62407-076
    Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm Ace HardwareDiablo freud brandDrill bits for cutting plastic.
    Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mmAce Hardware
    Wood file, 1/4" roundAce Harware
    Spring clips, 16 mm snap holderAce Hardware
    Swivel Head Deburring Tool, 5"Ace Hardware26307
    Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal)Grace Bio-Labs6665810.5 mm Thickness
    6 mm hole punchOffice Max
    12 mm hole punchthepunchbunch.com
    70% Ethanol
    Phototeched Coverslips, 12 mm diameterBellco Glass, Inc.1916-91012
    Bunsen Burner
    Absolute Ethanol
    Nanopure Water
    3-aminopropyltriethoxylaneSigma-AldrichA3648
    AcetoneSigma-Aldrich179124
    #5 Dumont ForcepsFine Science Tools11251-30
    McIlwain Tissue ChopperTed Pella, Inc.10180
    Double Edge Razor BladesTed Pella, Inc.121-6
    Whatman Filter PaperVWR28450-182Cut into 5.8 cm diameter circles
    Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar)Ted Pella, Inc.10501-10Cut into 5.8 cm diameter circles
    #21 Surgical BladeVWR Scientific25860-144
    #5 Dumont ForcepsFine Science Tools11251-30
    Spatula, stainless with tapered endVWR82027-518
    Gey's Balanced Salt SolutionSigma-AldrichG9779 
     GlucoseThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
    Chicken PlasmaCocalico Biologicals30-0300-5LRehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at  -80 °C.
    Thrombin, Topical (Bovine)PfizerThrombin-JMIQuick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL.
    Cell Roller SystemBellco BiotechSciERA
    Roller IncubatorFormaModel 3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    Pen/Strep (100X)ThermoFisher Scientific15140122
    200 mM GlutamineThermoFisher Scientific25030081
    GlucoseThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
    Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022 Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep.
    Third generation lentivirus packagingLife TechnologiesK4975-00
    159 K cutoff centrifugal filters (Centricon)EMD Millipore
    Lentiviral cloning system (InFusion)Clonetech
    Plasmids 30323, 50856, 51279Addgene
    Neuronal cell viability dye (NeuO)Stemcell technologies1801Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C
    Inverted microscopeOlympusIX83
    Microscope objectivesOlympusair: 4X, 20; oil: 40X, 60X,
    Spinning disc confocal systemYokagawaCSU22
    Microscope EMCCD cameraPhotometricsCascade II
    Linear encoded (x,y), piezo z flat top stageASI
    Microscope lasers and integrationIntelligent Imaging Innovations
    HEK293T cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-3216
    Human PlasminSigma AldrichP18670.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C.

    Referenties

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
    2. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
    3. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
    4. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
    5. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
    6. Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
    7. Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
    8. Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
    9. Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
    10. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
    11. Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
    12. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
    13. He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
    14. Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
    15. Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
    16. Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609(2013).
    17. Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
    18. Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
    19. Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
    20. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
    21. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556(2011).
    22. Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
    23. Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27(2010).
    24. Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89(2015).
    25. Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
    26. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
    27. Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
    28. Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
    29. Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
    30. Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10(2011).
    31. Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995(2014).
    32. Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6(2015).
    33. Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).

    Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

    Herprints en machtigingen

    Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

    Toestemming aanvragen

    Trefwoorden

    Brain Slice CultureRoller Tube MethodPhotoetched CoverslipsFluorescence ImagingViral Vector ExpressionNeuronal Vital DyeConfocal MicroscopyHippocampal SlicesLong term CultureEnclosed System

    Gerelateerde artikelen