Methodenartikel

Een handige methode voor de extractie en analyse met hogedruk-vloeistofchromatografie Catecholamine Neurotransmitters en hun metabolieten

DOI:

10.3791/56445

⸱

1 maart 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een handige solid-phase extraction gekoppeld aan hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) met elektrochemische detectie (ECD) voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters en twee van hun metabolieten in de urine van zuigelingen. Wij identificeren ook de metaboliet MHPG als een potentiële biomarker voor de vroege diagnose van hersenschade voor zuigelingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De extractie en analyse van catecholamine neurotransmitters in biologische vloeistoffen is van groot belang bij de beoordeling van de functie van het zenuwstelsel en de verwante ziekten, maar hun nauwkeurige meting is nog steeds een uitdaging. Vele protocollen zijn beschreven voor de meting van de neurotransmitter door een scala aan instrumenten, met inbegrip van hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC). Echter, er zijn tekortkomingen, zoals gecompliceerde operatie of hard-to-detect meerdere doelen, die niet kunnen worden voorkomen, en op dit moment de dominante analysetechniek is nog steeds HPLC gekoppeld aan gevoelige elektrochemische of fluorimetrische detectie, wijten aan de hoge gevoeligheid en goede selectiviteit. Hier, wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de voorbehandeling en de opsporing van catecholamines met hogedruk-vloeistofchromatografie met elektrochemische detection (HPLC-ECD) in echte urine monsters van zuigelingen, met behulp van samengestelde nanofibers electrospun samengesteld van polymere kroon ether met polystyreen als adsorberende, ook bekend als de methode verpakt-vezel vaste fase extractie (PFSPE). We laten zien hoe urine monsters kunnen gemakkelijk worden precleaned door een nanofiber boordevol solid phase-kolom, en hoe de analyten in de steekproef kan snel worden verrijkt, gedesorbeerde, en ontdekt op een ECD-systeem. PFSPE vereenvoudigt de voorbehandeling procedures voor biologische monsters, waardoor minder tijd, kosten, en vermindering van het verlies van doelen.

Globaal, dit werk illustreert een eenvoudige en handige protocol voor solid-phase extraction gekoppeld aan een systeem van HPLC-ECD voor gelijktijdige bepaling van drie monoamino neurotransmitters (epinefrine (E), noradrenaline (NE), dopamine (DA)) en twee van hun metabolieten (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) en 3,4-dihydroxy-Fenylazijnzuur (DOPAC)) in urine van zuigelingen. De gangbaar protocol werd toegepast voor de beoordeling van de verschillen van urine catecholamines en hun metabolieten tussen risicovolle zuigelingen met perinatale hersenbeschadiging en gezonde controles. Vergelijkende analyse bleek een significant verschil in urine MHPG tussen de twee groepen, waaruit blijkt dat de catecholamine metabolieten mogelijk een belangrijke kandidaat-marker voor vroegtijdige diagnose van gevallen in gevaar voor schade aan de hersenen bij zuigelingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Catecholamine neurotransmitters kunnen hun metaboliet inhoud in lichaamsvloeistoffen neurale functioneren aantasten en invloed hebben op het saldo van de reactie-naar-stimulans Staten op een groot deel1. Abnormities kan leiden tot allerlei ziekten, zoals pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoom en neurologische aandoeningen1,2. De extractie en de vastberadenheid van catecholamines in lichaamsvloeistoffen is zinvol voor de diagnose van de relevante ziekten. Echter catecholamines in biologische monsters bestaan in lage concentraties en gemakkelijk worden geoxideerd. Bovendien zijn ze zeer moeilijk te elueren vanwege de grote hoeveelheid inmenging in de middelgrote3. Simultane detectie van catecholamines in biologische vloeistoffen is dus nog steeds een uitdaging.

Zijn er beoordelingen aantonen dat urine catecholaminen kan een maatregel van stress, en dat hun niveaus zijn belangrijke biologische markers reageren op tactiele stimulatie verwerking in pasgeborenen5. Volgens het onderzoek, alle zuigelingen die hebben geleden onder voorbarig incidenten in gevaar voor hersenen letsel4,5,6, en schade kan veroorzaken abnormale vrijkomen van catecholamines en aanverwante zaken in de vloeistoffen. Er bestaan technieken van geavanceerde magnetische resonantie dat schade aan de hersenen in eerdere fasen7,8 detecteren kunnen. Echter binnen de eerste 48 uur, zal een abnormale neurodevelopmental proces veroorzaken permanente hersenletsel die niet zal in medische beelden11 blijken. Bovendien, het instrument van de hoge kosten en schaarse middelen, samen met andere factoren, maakt het onmogelijk voor alle neonatale eenheden toegang hebben tot deze gespecialiseerde neuro-imaging technieken. Echter, het gebruik van een gemakkelijk toegankelijke en praktische biomerker (zoals catecholamines en hun metabolieten) kon deze tekortkomingen verhelpen en de screening van een biomarker in menselijke vloeistoffen kan helpen in de vroege diagnose van hersenletsel en leiden tot vragen identificatie van pasgeboren zuigelingen neuroprotectie9nodig. De catecholaminen in urine kan een eenvoudig en duidelijk-index, vanwege de directe correlatie tussen de hoeveelheid ze vrijkomen van vloeistoffen en neuroactivity functie.

Onder biologische vloeistoffen, cerebrospinale vloeistof (CSF) en plasma monsters zijn niet gemakkelijk te bereiken via bestaande traumatische procedures, en het is ook zeer moeilijk om zich te ontdoen van interferentie als gevolg van zelfklevende eiwitten en andere onzuiverheden, wat leidt tot een storend en de bemonstering van de tijdrovende proces dat is niet geschikt voor herhaald detectie. Ook voor kinderen is het bijna onmogelijk om de monsters in een traumatische manier. Daarom urine bemonstering is beter dan de andere vormen van monsterneming, als het niet-invasieve, eenvoudig te bedienen, en herhaaldelijk kan worden gedaan. Urine monsters zijn overvloedig en makkelijk om te slaan, en Toon grote voordelen ten opzichte van de andere vormen van biologische monsters.

De belangrijkste methoden te kwantificeren catecholamines in biologische vloeistoffen zijn radioenzymic assays10, immuun-sorptiemiddel assays enzyme-linked11, voltammetrie12 en thermische lens spectrometrie13. Maar tekortkomingen bestaan, zoals de ingewikkelde operaties en hard-aan-detect meerdere doelen. Vandaag, is de dominante analysetechniek krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)14, in combinatie met gevoelige elektrochemische15 of fluorimetrische detectie16, vanwege de hoge gevoeligheid en goede selectiviteit. Met tandem massaspectrometrie technologie, zoals vloeibare chromatografie/massaspectrometrie (LC/MS) en vloeibare chromatografie/massa spectrometrie/massaspectrometrie (LC/MS/MS), de analyse en de kwantificering van de neurotransmitters hoog kunnen bereiken nauwkeurigheid en specificiteit17,18. De MS-techniek verlangt echter duur instrumentatie evenals aanzienlijk gekwalificeerde arbeidskrachten, waardoor de methode moeilijk universeel toepasbaar in de meeste conventionele laboratoria. HPLC-ECD systemen zijn meestal voorzien in de meest conventionele en klinische laboratoria, en zijn verworden tot een gemeenschappelijk en goede keuze voor onderzoeksgroepen moeten worden gebruikt voor chemische bepaling, maar zij vereisen het monster geïntroduceerd in het systeem te reinigen en van Microscale volume19. Het is dus van groot belang om te zuiveren en het monster vóór de analyse te laten condenseren. De klassieke methode voor de zuivering is vloeistof-vloeistof extractie14,15,20 en off-line solid-phase extraction, met inbegrip van de kolom geactiveerd aluminiumoxide kolom21,22 en diphenylborate (DPBA) kleurverandering23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. zijn geweest using polymeer hars, chemisch gewijzigd met kroon ether als de absorberend selectief catecholamines extraheren uit menselijke urine sinds 200727. Ook in 2006, hij Haibo et al. aangetoond van een benadering van de facile synthese voor boronate affiniteit extractie sorptiemiddel byutilizing een functionalizable nanomagnetic polyedrale oligomere silsesquioxane (POSS) gebaseerde nanomagnetic composiet, en toe te passen op de verrijking van catecholamines in menselijke urine (adrenaline, noradrenaline en isoprenaline)28. Ze maakte ook gebruik van de nanomaterialen aan het werk, met behulp van een technologie genaamd nano-electrospinning en de vorming van het polymeer materiaal in nanoschaal te vervullen. Het electrospinning-proces kunt aanpassen de diameter, morfologie en ruimtelijke uitlijning van het product door de werkende spanning beheersen en veranderen van de inhoud van de spinnen-oplossing samen met andere parameters29. Vergeleken met de conventionele SPE cartridge, electrospun nanofibers zijn zeer geschikt om te halen en verrijken van doel analyten uit een complexe matrix, zoals ze zijn uitgerust met hoge oppervlakte-gebied-te-volume verhoudingen te adsorberen van de analyten met hoog rendement, en vertonen meer gemakkelijk-gecontroleerde oppervlakte chemische eigenschappen, handige beslag op de doel-verbindingen toe te staan. Deze eigenschappen maken hen goede keuzen voor SPE adsorbents, sterk verminderen van de vaste fase en desorptie oplosmiddel bedrag30,31,32,33. Voor catecholamines in urine monsters, werden electrospun nanofibers, samengesteld uit apolymeric kroon ether met polystyreen (PCE-PS) gebruikt om selectief uitpakken drie catecholamines (NE E en DA)34. Het papier aangegeven dat de selectieve kroon ether de doelstellingen van NE, E en DA, die was gebaseerd op de juiste geometrie geadsorbeerde voor bindende catecholamines via vorming van waterstofbruggen. De resultaten weergegeven de materiële kroon ether effectief, het verwijderen van andere storende stoffen bevatte in biologische monsters. Geïnspireerd door dit verslag, een nieuwe methode is ontwikkeld voor de selectieve extractie van de catecholaminen door gebruik van electrospun samengestelde nanofibers samengesteld uit PCE-PS.

In deze paper gemelde de methode eerder34 was verbeterd en gebruikt niet alleen om succesvol te analyseren E, NE, en DA, maar ook hun metabolieten, MHPG en DOPAC, in de urine. Ook onderzoeken we nieuwe mogelijkheden voor het mechanisme van de adsorptie-proces. De methode geeft bevredigende extractie-efficiëntie en selectiviteit voor de vijf analyten, en de methode werd gecontroleerd in de analyse van de urine van risicovolle zuigelingen met perinatale hersenbeschadiging en gezonde controles.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geïnformeerde toestemming van de ouders was verkregen, en institutionele beoordeling van bestuur goedkeuring is verkregen voor de studie. De studie werd uitgevoerd overeenkomstig de gedragscode van de World Medical Association (verklaring van Helsinki) voor het uittesten van mensen. De verzorgers van alle deelnemers verstrekt schriftelijke toestemming voor het in de studie wordt ingeschreven. Ethisch comité goedgekeurd door Zhongda ziekenhuis, affiliate met Zuidoost-Universiteit, werd ook verkregen.

1. bereiding van de oplossingen die nodig zijn voor de extractie en de vastberadenheid van Catecholamines en kolommen

  1. De kolom PFSPE voor te bereiden. 1-2 mg PCE-PS nanofibers in 5-6 aliquots verdelen, en gebruik een fijne stalen staaf met 0,5 mm diameter om deze ordelijk in het einde van een pipet-tip met een volume van 200 µL comprimeren.
  2. Bereiden van het kunstmatige urine door weging 2.427 g ureum 0.034 g urinezuur, 0.09 g creatinine, 0,297 g Trinatriumcitraat citraat, 0.634 g natriumchloride, 0,45 g kaliumchloride, 0.161 g ammoniumchloride, 0.089 g calciumchloride-dihydraat, 0,1 g magnesiumsulfaat -heptahydraat, 0.034 g natriumbicarbonaat 0.003 g natrium oxalaat, 0.258 g Natriumsulfaat, 0,1 g natriumfosfaat kaliumdiwaterstoffosfaat p.a. in water, en 0.011 g Dinatrium waterstof fosfaat en los de bovenstaande chemicaliën in 200 mL gedeïoniseerd water.
  3. Bereiden van 2 mg/mL stockoplossing van diphenylborate (DPBA) oplossing door oplossend 2 mg van de stof in 1 mL gedestilleerd water. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 ° C.
  4. Analyt standaard
    Opmerking: De chemische structuur en eigenschappen van catecholamines zijn instabiel, en ze gemakkelijk ontleden. Het voorbereidingsproces van normen moet zeer snel en moet voorkomen dat blootstelling aan direct zonlicht.
    1. Weeg 1.0 mg NE, E, DA, MHPG, DOPAC en interne standaard 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA in aparte 1,5 mL microcentrifuge buizen. Verdun de DHBA oplossing in water tot 100 ng/mL vóór gebruik.
    2. Oscillate de bereid normen in het donker op een hoge snelheid totdat analyten volledig los. Dit is de primaire voorraad; bewaren bij-20 ° C voor maximaal enkele weken.
    3. De secundaire 1000 ng/mL analyt voorraden voor te bereiden. Pipetteer 5 µL van elke primaire analyt voorraad in 4,975 µL van gedistilleerd water in een centrifugebuis 5 mL voor NE, E, DA, DOPAC en MHPG, en bewaren het in het donker bij 4 ° C tot gebruik. Deze vers dagelijks van oplossingen voor te bereiden. Pipetteer 5 µL van primaire voorraad in 4,995 µL van gedistilleerd water in een centrifugebuis 5 mL voor DHBA, en slaat u op in het donker afzonderlijk bij 4 ° C.
    4. Maken verdere verdunningen met de secundaire analyt voorraad aan standaard curven maken (bijv., aanvullende tabel 2). Opslaan van oplossingen in het donker bij 4 ° C en bereiden van verse dagelijks.
    5. Test de optimale spanning van ECD detector met behulp van de standaard voorraad met goede concentratie. Variëren de spanning om te zoeken naar een waarde waar de analyten de beste piek uitstraling hebben.
  5. Bereiden van eluant met 30% fosforzuur, 15% acetonitril, en 55% gedestilleerd water. Voor 10 mL oplosmiddel per eluant, gebruik van 5,5 mL gedestilleerd water en voeg 1,5 mL acetonitril en 3 mL fosforzuur druppelsgewijs in het water.

2. voorbereiding van de echte Urine monsters en mobiele fase

  1. Hebben moeders de eerste ochtend urine van hun zuigelingen met cups van aseptische urine verzamelen. Breng de monsters in polypropyleen tubes en label onmiddellijk. Sla de monsters in een vriezer van-20 ° C.
  2. Vortex en centrifuge de urine monsters bij 1,510 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) om zich te ontdoen van de meeste deeltjes inmenging. Negeren van het sediment en het supernatant voor verdere experimenten te verzamelen. Om de analyten effectief uitpakken, gaat u verder met PFSPE voorbehandeling (stap 3) direct na het centrifugeren.
  3. De mobiele fase voor te bereiden
    1. Bereiden van een schone fles, ten minste 1 L. De samenstelling van de mobiele fase wordt vermeld in de aanvullende tabel 1; voor 1 L mobiele fase, maatregel 6.7242 g citroenzuur, 93.06 mg van ethyleen diamine tetra azijnzuur (EDTA) Dinatrium zout, 7.02 g monometallistische natrium ORTHOFOSFAAT, hydrateren 404.5 mg 1-heptanesulfonic zuur natrium zout en 3,5 g natrium in de fles. Voeg 40 mL acetonitril en gedestilleerd water tot 1000 mL. Doorroeren en trillen corrosiebestendige gedurende 15 minuten, totdat de zaak in de oplossing is allemaal opgelost.
    2. Gebruik een pH-meter met een glaselektrode, pas de pH-waarde van de mobiele fase om 4.21 met een verzadigde natriumhydroxide-oplossing.
    3. De mobiele fase met een membraan 0,45 µm Polyvinylideenfluoride fluoride microporeuze en een vacuüm zuig-apparaat om zich te ontdoen van onzuiverheden filteren.
    4. Gebruik ultrasone trillingen voor 15 min te ontgas de mobiele fase telkens vóór gebruik.

3. PFSPE extractie en HPLC analyse

  1. Het activeren van de nanofibers. Druk op 100 µL van methanol en 100 µL van water achter elkaar door de kolom van de PFSPE met behulp van een spuit 5 mL in een langzame, dropwise manier.
  2. Mix 100 µL urine proeven met 100 µL 2 mg/ml DPBA en 30 µL 100 ng/ml van DHBA oplossing (IS, interne standaard) in een tube van 0,5 mL EP, dan de gemengde oplossing naar de kolom PFSPE. Druk op de oplossing van de gemengd monster door de kolom PFSPE met een 5 mL gasdicht kunststof spuit met behulp van de kracht van de luchtdruk.
  3. Uitspoelen van de kolom drie keer door het laden van 100 µL DPBA oplossing (2 mg/mL) in de kolom van de SPE, en druk op de oplossing langzaam door de cartridge met behulp van een gasdichte kunststof spuit 5 mL luchtdruk.
  4. Laden 50 µL van de eluant op de PFSPE kolom en het doorzetten van de kolom, het verzamelen van het eluaat met een 0,5 mL EP-buis.
  5. De HPLC-degasser naar ontgas de lucht in het systeem inschakelen. Voorafgaand aan de voorbeeld-analyses, moet het systeem worden uitgevoerd gedurende meer dan 0.5 uur met de mobiele fase equilibreer en beperking van het lawaai van de basislijn. Zie aanvullende tabel 1 toont de setup-parameters van het HPLC-systeem.
  6. Monster 20 µL van het eluaat met behulp van een automatische sampler, en het vervolgens te injecteren in de HPLC-ECD-systeem.
  7. Wanneer de punten zijn voltooid, schakelt u de detector-cel met de detector-interface. Zet niet uit de cel met de schakelaar aan de achterkant van de detector, aangezien dit het instrument zou kunnen beschadigen.
  8. Handmatig omzetten in de samenstelling van de mobiele fase 10% methanol en 90% water. Een looptijd van ten minste 30 min. Vervolgens handmatig wijzigen in de mobiele fase methanol van HPLC-kwaliteit. Een looptijd van ongeveer 15 min ter bescherming van het systeem in methanol. Niet-uitvoeren van deze stap na de aanbevolen lopende tijd kan leiden tot schade aan de kolom en de detector. Uitschakelen van de stroom, dan de degasser uitschakelen.

4. Phenylboronic zuur Cartridges (PBA) extractie

PBA cartridge extractie procedures waren gelijk aan de regeling in Kumar et al. (2011) 25. alle oplossingen worden geduwd door de PBA-cartridge (100 mg, 1 mL) met lucht gedwongen door een spuit.

  1. Conditie van de cartridge met 1 mL 80:20 acetonitril-water (v/v) die 1% mierenzuur en 1 mL 50 mM fosfaatbuffer (pH 10) achter elkaar bevatten.
  2. Druk op de gebufferde urine monster (1 mL urine en 2 mL fosfaatbuffer, pH 8,5) door de PBA-cartridge.
  3. Wassen van de cartridge met 1 mL 50:50 v/v acetonitril-fosfaatbuffer (10 mM, pH 8,5).
  4. Elueer de cartridge met 1 mL acetonitril / water (80:20 v/v) met 1% mierenzuur.

5. identificatie en kwantificering van Catecholamines

  1. Lineariteit
    1. Verdun de secundaire analyten voorraad met kunstmatige urine aan zes concentraties (1.5, 3, 12, 25, 50 en 100 ng/mL); de omvang van de verdunning van de kunstmatige urine volgt aanvullende tabel 2. Maak drie parallelle monsters met elke concentratie om 18 analyt experimentele oplossingen voor de bouw van de kalibratiekrommen.
    2. Verdun de secundaire materieel DHBA met kunstmatige urine 10-fold om 100 ng/mL experimentele oplossing.
    3. Voorbehandeling alle oplossingen van de analyt van 5.1.1, volgens stap 3 (PFSPE extractie procedures). Als in stap 3, door 20 µL van elke overeenkomstige eluaat te injecteren in de HPLC-ECD-systeem om een chromatogram van HPLC.
    4. Teken kalibratiekrommen van de vijf analyten door de verhouding van piekoppervlakte (doelen/IS) als de Y-as tegen de verhouding van concentraties (doelen/IS) als de X-as, zoals in aanvullende figuur 1.
  2. LOD en LOQ waarde voor de lichtgevoeligheid
    1. Injecteren 20 µL van de lege kunstmatige urine in de HPLC-ECD-systeem (zoals in stap 3), met het oog op het chromatogram van HPLC van het monster.
    2. In het chromatogram van 5.2.1, verzamelen van 11 leeg signaal waarden en berekent de gemiddelde waarde Xb en de standaardafwijking Sb. Berekenen van de minimale signaal van een stof die kan worden ontdekt op een bepaald niveau van vertrouwen, XL, zoals XL X =b+ K * Sb (K is de coëfficiënt bepaald door betrouwbaarheidsniveau, Sb weerspiegelt geluidsniveau van de meetmethode en geluidsniveau van de machine). Dus, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) / s (S staat voor de waarde van de helling van de curve van de werken).
    3. Een S/N van 3:1 (K = 3) als de limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) en een S/N, van 10:1 (K = 10) als de grens voor kwantificering (LOQ) definiëren.
  3. Evalueren van de terugvorderingen
    1. Echte en puntige urine monsters voor te bereiden. Verdun de secundaire analyten voorraad met echte urine aan drie concentraties (5, 50, 100 ng/mL) te verkrijgen de puntige urine monsters. Bereiden drie parallelle monsters voor elke oplossing van de analyt. Tellen de puntige concentratie als de hoeveelheid doel verbindingen spiked in het monster urine. Deze waarde is gedefinieerd als eens.
    2. Verdunde DHBA voorraad tot 100 ng/mL, zoals in stap 5.1.2.
    3. Verwerken van elke oplossing van het monster uit 5.3.1 volgens stap 3 (PFSPE extractie procedures) en de 20 µL van elke overeenkomstige eluant injecteren in de HPLC-ECD-systeem om het chromatogram resultaat te krijgen. De waarde van de analyten wordt gerekend als een hoeveelheid doel verbindingen gekwantificeerd in de steekproef puntige urine. Deze waarde is gedefinieerd als eent.
    4. Injecteren 20 µL van urine monster in de HPLC-ECD (zoals in stap 3) systeem om het chromatogram resultaat te krijgen. De waarde van de analyten wordt gerekend als een initiële hoeveelheid van doel verbindingen gekwantificeerd in de steekproef van de urine. Deze waarde is gedefinieerd als eenik.
    5. Bereken de hoeveelheid doel stoffen in de monsters van de standaard kromme vergelijking. Het percentage herstel wordt geraamd op methodologische herstel % = (eent - Aik) × 100 / (As). Gemiddelde waarden staan vermeld in tabel 1.
  4. Evalueren de onnauwkeurigheid
    1. Puntige kunstmatige urine monsters 5, 50 en 100 ng/mL concentraties zoals in stap 5.3.1 voor te bereiden. Bereiden zes parallelle monsters voor elke oplossing van de analyt. Bereiden van verse experimentele monsters elke dag.
    2. Verdun DHBA voorraad tot 100 ng/mL zoals in stap 5.1.2.
    3. Evalueren van de precisie van de intra-day (n = 6). Verwerken van elke oplossing van het monster in 5.4.1 volgens stap 3 en de 20 µL van elke correspondent eluant injecteren in de HPLC-ECD-systeem om het chromatogram. Doe dezelfde bewerking zesmaal op dezelfde dag.
    4. Bereken de hoeveelheid doel stoffen in de monsters van de standaard kromme vergelijking. Onder dezelfde concentratie van de dezelfde compound, wordt de relatieve standaardafwijking (RSD) van de zes tests in één dag bepaald als intradaagse-precisie. Gemiddelde waarden staan vermeld in tabel 1.
    5. Evalueren van de precisie van Inter dag (n = 6). Tegelijkertijd elke dag in de zes opeenvolgende dagen, puntige kunstmatige urine monsters te bereiden voor de drie concentraties van 5, 50, 100 ng/mL, zoals in 5.4.1 en 5.4.2., en verwerken van elke analyt monsteroplossing volgens stap 3.
    6. De 20 µL van elke overeenkomstige eluaat uit 5.4.5 injecteren in het systeem van de HPLC-ECD chromatografische om resultaten te krijgen elke dag. Bereken de hoeveelheid doel stoffen in de monsters van de standaard kromme vergelijking. Tussen dag precisie wordt uitgedrukt door de RSD hoeveelheid het testen van de monsters van de puntige kunstmatige urine bij de drie concentraties in zes opeenvolgende dagen. Gemiddelde waarden staan vermeld in tabel 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is een eenvoudige en handige PFSPE-methode om de voorbehandeling van de monsters van de urine en verrijken van vijf catecholamines voor detectie via een HPLC-ECD-systeem; een diagram van het proces is afgebeeld in Figuur 1. Het protocol bevat voornamelijk vier stappen-activeren, laden, spoelen, en eluerende - in combinatie met een kleine hoeveelheid van de PCE-PS nanofibers en een eenvoudige solid-fase extractie-apparaat. De morfologie van de PCE...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De voorgestelde methode PFSPE in dit document mogelijk belangrijke en zinvolle ten aanzien van zijn snelheid, eenvoud en gemak. De adsorbents gebruikt in het protocol zijn electrospun nanofibers, die hebben hoge oppervlakte gebied-te-volume verhoudingen en de analyten adsorberen met een hoog rendement. De procedure alleen moet een paar milligram van nanofiber en een klein volume van eluant oplosmiddel, en hoeft niet een stap van de verdamping te concentreren van de analyten. Wij hebben hier een gedetailleerd overzicht va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen conflict van belang met elke financiële organisatie met betrekking tot het materiaal dat in dit artikel besproken is.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Science Foundation of China (No.81172720, nr. 81673230), de sociale ontwikkeling onderzoek programma van Jiangsu provincie wetenschap en technologie afdeling (nr. BE2016741), Science & technologieproject van China General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), het Open Project programma van belangrijke laboratorium voor de ontwikkeling van het kind en het leren van de wetenschap van het ministerie van onderwijs, Zuidoost-Universiteit (CDLS-2016-04). Wij erkennen oprecht Yuan lied en Ping Liu die ons in monsters collectie geholpen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
200 µL pipette tipkolom om nanovezels te bevatten
PCE-PS nanovezelsmateriaal voor PFSPE-extractie
staafstaal (ongeveer 0,5 mm diameter)vul de nanovezels in de kolom
gasdichte plastic spuit (5 ml)comprimeer oplossing in het uiteinde van de punt
methanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
difenylborinezuur 2-aminoethylester(DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408complex reagens
norepinephrine(NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analyt
3-Methoxy-4-hydroxyfenylglycol(MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analyt
epinephrine(E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analyt
3, 4-Dihydroxyfenylacetaatzuur(DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analyt
dopamine(DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analyt
3, 4-dihydroxybenzylaminehydrobromide(DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781binnenlabel
acetonitrilSigma-Aldrich.Inc75-05-8eluans en mobiele fase
fosforzuurSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2eluans
urinezuurSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2kunstmatige urine
creatinineSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5kunstmatige urine
trinatriumcitraatSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3kunstmatige urine
KClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7447-40-7kunstmatige urine
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9kunstmatige urine
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326kunstmatige urine
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0kunstmatige urine
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6kunstmatige urine
dinatriumwaterstoffosfaatSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4kunstmatige urine
ureumSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6kunstmatige urine
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5kunstmatige urine
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8kunstmatige urine
CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8kunstmatige urine
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0kunstmatige urine
citroenzuurSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9kunstmatige urine en mobiele fase
EDTA dinatriumzoutSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6mobiele fase
monometallisch natriumorthofosfaatSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7kunstmatige urine en mobiele fase
1-heptaansulfonzuurnatriumzoutSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6mobiele fase
natriumhydroxideSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2mobiele fase
fenylboorzuurkolom(PBA-kolom)Aglilent12102018PBA-extractie
Inertsil® ODS-3 5 µm 4,6×150 mm kolomDikma5020-06731HPLC-kolom voor scheiding
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLERShimadzu Corporation, JapanSIL-20ACauto-injectie voor eluans
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid ChromatographyShimadzu Corporation, JapanLC-20ADHPLC-pomp
SHIMADZU L-ECD-60A elektrochemische detectorShimadzu Corporation, JapanL-ECD-60Adetector voor de analyten
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USAoppervlakte- en porositeitsanalyzer 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376(2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330(1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203(2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Catecholamine NeurotransmittersHigh Pressure Liquid ChromatographyElectrochemical DetectionSolid Phase ExtractionPacked Fiber Solid Phase ExtractionUrine Sample AnalysisNanofiber AdsorbentMonoamine MetabolitesInfant Urine TestingHPLC ECD System

Gerelateerde artikelen