Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

Samenvatting

De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.

Samenvatting

DNA-beschadiging is een gemeenschappelijk fenomeen voor elke cel tijdens zijn levensduur, en wordt gedefinieerd als een wijziging van de chemische structuur van genomic DNA. Kankertherapieën, zoals radio- en chemotherapie, introduceren enorme hoeveelheid extra DNA-beschadiging, leidt tot de arrestatie van de celcyclus en apoptosis te beperken van de progressie van kanker. Kwantitatieve beoordeling van DNA-beschadiging tijdens de experimentele kankertherapie is een belangrijke stap ter rechtvaardiging van de effectiviteit van een genotoxische agent. In deze studie, richten we ons op een eencellige elektroforese assay, ook bekend als de komeet assay, die enkele kwantificeren kan en dubbele streng DNA breekt in vitro. De bepaling van de komeet is een DNA schade kwantificering methode die efficiënt en gemakkelijk uit te voeren, en heeft weinig tijd/begroting eisen en hoge reproduceerbaarheid. Hier, wijzen wij op het nut van de komeet assay voor een preklinische studie door de beoordeling van het effect van de genotoxische van olaparib/temozolomide combinatietherapie naar U251 glioma cellen.

Inleiding

De komeet assay werd in 1984 voor het eerst ontwikkeld door Ostling en Johanson door aan te tonen dat de migratie van DNA fragmenten van kernen onder een neutrale voorwaarde¹. De techniek werd later ontwikkeld door Singh et al., waaruit blijkt dat een alkalische toestand aanzienlijk verhoogd de specificiteit en de reproduceerbaarheid van de test². Sindsdien, de neutrale komeet bepaling wordt meestal gebruikt om op te sporen double-stranded DNA breekt, terwijl de alkalische komeet assay gevoeliger voor kleinere hoeveelheden DNA schade is, met inbegrip van enkele en dubbele streng DNA, alkali-labiele sites, DNA-DNA breekt of DNA-eiwit dwarsbinding en DNA single-strand einden gekoppeld aan onvolledige excisie repareren sites^3,4. Beide testen visualisatie van gefragmenteerde DNA, verlenen en een eenvoudige manier om te kwantitatief DNA-schade te evalueren. De komeet bepaling wordt beschouwd als een gevoelige methode voor in vitro en in vivo genetische toxicologische studies en is van toepassing op de verschillende onderzoekgebieden, zoals vroege drug-kandidaat selectie, milieubewaking, menselijke biomonitoring, en fundamenteel onderzoek op DNA-beschadiging en repareren van⁵.

Het principe van de test is dat onder een elektrisch veld, gefragmenteerde DNA migreert uit het nucleoïde lichaam (ook bekend als de "komeet-head") en vormt een vlek van DNA in de agarose gel (ook bekend als de "komeet-staart"). Met de nucleotide kleuring, kan de omvang van de schade van DNA door het analyseren van "kometen" gevormd door deze eencellige elektroforese worden gekwantificeerd. Berekening van het moment van de staart kan verder helpen aan het vergelijken van DNA-beschadiging onder verschillende experimentele groepen. Vergeleken met traditionele methoden van opsporing van DNA schade, is de bepaling van de komeet directe, gevoelige, goedkope en relatief eenvoudig.

Radiotherapie en chemokuren zijn gemeenschappelijke strategieën voor de behandeling van kanker door het genereren van enkele streng en dubbele streng DNA breekt in chromosomen⁶. De recente vooruitgang in DNA-reparatie-remmers laat een meer effectieve genotoxische werking door combinatie chemotherapie, en daarom, vermindert potentieel systemische bijwerkingen zoals bloedarmoede, infectie en het beenmerg onderdrukken^{7, 8}. in deze studie, toonden we het onderzoek van een poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)-remmer, olaparib (Ola)⁹. PARP is een overvloedige nucleaire eiwit en is verantwoordelijk voor DNA base excision repair door de vorming van een poly (ADP-ribose) polymeer¹⁰. Temozolomide (TMZ) is een oraal beschikbaar alkylerend agent en is wijd verbeid gebruikt voor glioma patiënten behandeling. Met behulp van de bepaling van de komeet te kwantificeren van DNA-beschadiging, we laten zien dat de DNA-beschadiging in glioma cellen, hetgeen olaparib/temozolomide combinatietherapie is een effectieve strategie suggereert voor de behandeling van glioma, als combineren olaparib met temozolomide diep verbetert vergeleken met temozolomide alleen¹¹.

Protocol

1. voorbereiden reagentia

1. 1 x PBS
   1. 100 mL 10 x PBS met 900 mL dH ₂ O Verdun en breng de pH op 7.4 met behulp van een pH-meter. Bewaren bij kamertemperatuur.
2. Lysis oplossing (LS)
   1. bereiden 2.5 M NaCl, 100 mM Dinatrium-EDTA, 10 mM Tris base en 200 mM NaOH in 900 mL dH ₂ O; het duurt gewoonlijk ongeveer 20 min te laat het mengsel volledig los. Breng de pH op 10 met behulp van een pH-meter. Voeg 1% sodium lauryl dat en 1% Triton X-100, en het uiteindelijke volume tot 1000 mL. Cool tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.
3. De Elektroforese van de alkaline oplossing (AES), pH > 13
   1. 200 mM NaOH en 1 mM Dinatrium EDTA in 800 mL dH ₂ O. aanpassen de pH te bereiden en ervoor te zorgen dat er pH > 13. Het uiteindelijke volume tot 1000 mL. Maak vóór gebruik vers en koel hem af tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.
4. Neutraal elektroforese sollution (NES)
   1. bereiden 1.000 mL neutrale elektroforese buffer door het mengen van 100 mM Tris base en 300 mM Natriumacetaat naar 1000 mL dH ₂ O. Adjust pH 9.0 met ijsazijn. Cool tot 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik.
5. DNA neerslag oplossing (DPS)
   1. voorbereiding van 10 mL 7,5 M ammonium acetaat voorraad. Meng voor 50 mL DNA neerslag oplossing, 6,7 mL 7,5 M ammoniumacetaat met 43,3 mL 95% ethanol. Bewaren bij kamertemperatuur.
6. Staining oplossing
   1. Voeg 1 µL 10.000 x groen fluorescent nucleïnezuur vlek (bijvoorbeeld, SYBR groen) in 30 mL Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM Dinatrium-EDTA, pH 7.4) en winkel bij 4 ° C. Protect van licht.
7. 1% lage smelten agarose
   1. smelten van 1% laag punt agarose (1 g in 100 mL dH ₂ O) in de magnetron te smelten. Swirl de agarose elke 15-20 s om ervoor te zorgen dat de agarose volledig gesmolten is. Plaats de agarose in het waterbad 37 ° C gedurende ten minste 20 minuten vóór gebruik.
8. Vooraf warm Pipetteer tips
   1. afgesneden van de smalle uiteinden van P200 Pipetteer tips door 3 mm en warm bij 37 ° C vóór pipetteren agarose.

2. Bereiden Comet dia's

1. Slide coating
   1. Melt 1% agarose (1 g in 100 mL dH ₂ O) in de magnetron gedurende 2-3 minuten of totdat de agarose volledig gesmolten is. Dompel de dia's van glas, Microscoop in de agarose en één zijde van de dia met behulp van een pluisvrije doekje vegen.
   2. Leggen de dia's op een vlakke ondergrond om te drogen of warmte bij 50 ° C voor sneller drogen; een transparante agarose film moet worden gevormd na het drogen. Plaats de gecoate dia's in 37 ° C vóór gebruik.
2. Voorbereiding van eencellige schorsingen
   1. cultuur en behandelen de glioma cel
      1. cultuur van de cellen van de U251 MG in DMEM-Ham F-12 medium aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 10 µg Fe/mL streptomycine op 37 & # 176; C met 5% CO ₂.
      2. Verteren de cellen met behulp van 1 mL trypsine gedurende 3 minuten, en neutraliseren met behulp van DMEM-Ham F-12 medium met FBS trypsine. Verzamelen in de tube van 15 mL, draaien op 300 x g voor 4 min, gecombineerd het medium en schorten cellen bij 2 x 10, ⁵ cellen/mL in 1 x PBS.
         Opmerking: Het monster van de cel onmiddellijk voordat de bepaling moet worden voorbereid en alle monsters moeten worden behandeld in de omgeving van een donker of lichter gekleurd weergegeven om te voorkomen dat DNA-beschadiging van licht.
      3. De celsuspensie combineren met 1% agarose van de gesmolten lage smeltpunt (bij 37 ° C) bij een verhouding 1:10 (v/v), meng zachtjes op en neer waarbij en onmiddellijk Pipetteer 30 µL op een dia. Gebruik de zijkant van de het uiteinde van de pipet te verspreiden het mengsel agarose/cel om ervoor te zorgen de vorming van een laagje.
      4. Plaatst de dia plat bij 4 ° C in het donker voor 10 min. steeds meer gelerend aan 30 min verbetert de hechting van monsters in omgevingen met hoge luchtvochtigheid.
      5. Onderdompelen van de dia in 4 ° C LS in het donker voor 1 h naar girale.

3. Enkele cel elektroforese

1. Ga verder naar alkalisch (stap 3.2) of neutraal (stap 3.3) komeet assay
2. voor alkalische komeet assay
   1. zachtjes dia's te verwijderen van de LS, afvoer van overtollige buffer en zachtjes onderdompelen in AES gedurende 1 uur bij 4 ° C om DNA tot rust te komen. Houd de dia's in het donker.
   2. De vooraf gekoeld AES toevoegen in de lade met het dia elektroforese overschrijd niet 0,5 cm boven de dia's (dit hangt af van de grootte van de elektroforese eenheden), plaatst u de dia's binnen en bedek met een cap. Het netspanningsvoltage instelt op 1 V/cm (de lengte tussen de elektroden) en u gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
   3. Afvoer overtollige elektroforese oplossing van dia. Voorzichtig Dompel dia's tweemaal in dH ₂ O gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Onderdompelen zachtjes dia's in 70% ethanol gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Ga verder met stap 4.
3. Voor neutrale komeet assay
   1. zachtjes het verwijderen van de dia's uit de LS, afvoer van overtollige buffer en zachtjes onderdompelen in NES gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Houd de dia in het donker.
   2. Toevoegen vooraf gekoeld neutrale elektroforese buffer in de lade met het dia elektroforese overschrijd niet 0,5 cm boven dia's (dit hangt af van de grootte van de elektroforese eenheden), plaatst u de dia's binnen en bedek met een cap. Het netspanningsvoltage instelt op 1 V/cm (de lengte tussen de elektroden) en u voor 45 min bij 4 ° C.
   3. Afvoer overtollige buffer van de dia's. Voorzichtig Dompel onder dia's in DPS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Voorzichtig Dompel de dia's in 70% ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Ga verder met stap 4.

4. Vlekken van komeet dia's

1. droge dia's bij 37 ° C gedurende 10-15 min. in het donker.
2. Plaats 50-100 µL groen fluorescent nucleïnezuur kleurstofoplossing op elk gedroogde agarose en vlek gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
3. Spoel van de dia's kort in dH ₂ O en droog volledig bij 37 ° C in het donker. Ga naar image aquisition en analyse.

5. Verwerving en analyse van het beeld

Opmerking: de visualisatie en de kwantificering van DNA-einden zijn gebaseerd op epifluorescence microscopie en de komeet assay software (Zie Tabel van materialen) ¹² .

1. De dia's op de microscoop met de houder van een dia plaatsen. Zorg ervoor dat de agarose gel is kijkend naar het objectief. Willekeurig opnamen uit de gekleurde komeet dia's met behulp van een fluorescentie Microscoop met een objectief van 10 x. De randen en de gebieden rond alle luchtbellen voorkomen.
2. Zorg ervoor dat elke staart van de komeet is horizontaal verdeeld. Komeet hoofden zouden afkomstig moeten zijn uit de linker- en de staart vanaf de rechterkant.
3. Elke afbeelding opslaan in een binaire TIF-indeling met heldere vlek van DNA en donkere achtergrond. Afbeeldingen voor het gebruik van de software laden de " Selecteer bestanden om te analyseren " knop, die aan de linkerkant van de werkbalk ligt. Het venster van de weergave van een afbeelding moet worden weergegeven ( Figuur 1).
4. Een frame van de meting op het scherm tekent en de omvang ervan overeenkomstig de komeet van de cel aan te passen. Klik op de " aanpassen " knop voor het instellen van de drempel van het hoofd, comet en staart volgens de afbeelding en klik vervolgens op de " Start van de metingen " knop ( Figuur 1).
5. Selecteer een cel met behulp van het frame en de meting activeren door te klikken met de muis op de " Assay de komeet " knop; een intensiteit beeld verschijnt op het " profielen " venster met de parameters van de geselecteerde meting. De resultaten kunnen worden opgeslagen door te klikken op de " resultaat opslaan " knop ( Figuur 1).
   Opmerking: De software berekent de parameters met inbegrip van de lengte van de staart van de komeet, het percentage van de staart DNA, het moment van de staart (TM) en het moment staart Olive (OTM). De staart momenten door de formules worden berekend als volgt:
   
   
6. analyseren van ten minste 50 cellen per behandeling.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor de uitvoering van de bepaling van de komeet en data-analyse (Figuur 1). Resultaten van de alkalische en neutrale komeet testen bleek dat de staart van de komeet van Doxorubicine-behandeld U251 cellen (1 µM, 20 h) langer was en had hogere intensiteit van het DNA, suggereren een aanzienlijke accumulatie van gefragmenteerde DNA als gevolg van chemotherapie (Figuur 2).

Discussie

De bepaling van de komeet is een doeltreffend instrument voor het meten van enkele en dubbele streng DNA-einden op cellulair niveau. De bepaling is algemeen toegepast als een "gouden standaard" in studies met betrekking tot genotoxiciteit en biomonitoring¹³, variërend van basis laesies, DNA crosslinks Geneesmiddelenontwikkeling en alkali-gevoelige plaatsen. In de huidige studie toonden we twee verschillende stapsgewijze protocollen voor alkalisch en neutraal komeet testen, respectievelijk. Combina...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Sodium lauryl sarcosinate	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Sodium acetate	Sigma	32318
Glacial acetic acid	Sigma	695092
Ammonium acetate	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95% ethanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
Trypsin	GIBICO	25300-054
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Verbruiksartikelen
Glazene weefselplaatjes	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1,5 mL Microcentrifugebuisjes	DENVILLE
Pipettips	SHARP
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur
Microgolfoven	Avanti
Waterbad	PRECISION
Horizontale elektroforesekamer	TREVIGEN	Cometassay ES II
Voeding	Bio-Rad
Incubator	Quincy Lab	Model 12-140E
Fluorescentiemicroscoop	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf