Methodenartikel

Een eenvoudige benadering voor het opwekken van experimentele Autoimmune Neuritis in C57BL/6 muizen voor functionele en neuropathologische evaluaties

9.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56455

⸱

9 november 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

In dit artikel

Samenvatting

Dit verslag schetst een eenvoudige benadering om succesvol experimentele autoimmune neuritis (EAN) met behulp van de myeline proteïne nul peptide180-199 (P0) in combinatie met de Freund compleet adjuvans en kinkhoest toxine. We presenteren een verfijnde paradigma staat nauwkeurig de beoordeling van de omvang van functionele tekorten en Neuropathologie die zich voordoen in deze EAN.

Samenvatting

Experimentele autoimmune neuritis (EAN) is een goed gewaardeerd experimentele model van perifere demyeliniserende auto-immuunziekten. EAN ziekte wordt veroorzaakt door het immuniseren van muizen met neurogene peptiden aan direct een inflammatoire aanval naar onderdelen van het perifere zenuwstelsel (PNS). Recente ontwikkelingen hebben de inductie van EAN in de relatief resistent C57BL/6 muis lijn met behulp van myeline eiwit nul (P0)106-125 of P0180-199 peptiden geleverd in adjuvans gecombineerd met de injectie van pertussis toxine ingeschakeld. De capaciteit voor het opwekken van EAN in de stam van de C57BL/6 kunt voor het gebruik van de vele genetische hulpmiddelen die bestaan op de achtergrond van deze muis en dus de geavanceerde studie van de pathogenese van de ziekte en de ondervraging van de mechanistische actie van roman therapeutics in combinatie met transgene benaderingen. In deze studie tonen we een eenvoudige benadering van EAN met behulp van de P0180-199 peptide in C57BL/6 muizen met succes te induceren. Ook schetsen wij een protocol voor de beoordeling van functionele tekorten die zich bij dit model wordt begeleid door een matrix van neuropathologische kenmerken voordoen. Dit model is dus een krachtig experimenteel model om te bestuderen van de pathogenese van menselijke perifere demyeliniserende neuropathieën en voor het bepalen van de werkzaamheid van potentiële therapieën die gericht zijn op bevordering van myeline reparatie en bescherming tegen schade aan de zenuwen in auto-immuunziekten neuritis.

Inleiding

Melding gemaakt van perifere neuropathieën kunnen genetische oorsprong of verworven, met de verworven neuropathieën hebben beide metabole, ischemische, inflammatoire of giftige neerslagmiddelen. Deze ziekten zijn ook nuttig ingedeeld als axonale of demyelinative oorsprong. De meest voorkomende verworven demyeliniserende melding gemaakt van perifere neuropathieën Acute inflammatoire demyeliniserende polyneuropathie (AIDP zijn, ook bekend als het syndroom van Guillain-Barré, GBS) en chronische inflammatoire demyeliniserende polyneuropathie (CIDP)1, 2 , 3 , 4; beide zijn pathogenetically gekenmerkt door een auto-immune reactie gericht tegen de myelineschede, waardoor demyelinisatie van de perifere zenuwen. In deze ziekten, geactiveerde T-cellen Kruis het bloed zenuw barrière en genereren een immune reactie binnen de PNS. Activering van macrofagen binnen de zenuw dan veroorzaakt demyelinisatie via fagocytische aanval direct noch indirect via secreted inflammatoire mediatoren, resulterend in klinische handicaps zoals verlamming en sensorische dysfunctie5. Terwijl demyelinated axonen de mogelijkheid om te worden remyelinated na demyelinisatie behouden, remyelination wordt vaak vertraagd of onvolledig, resulterend in de gevoeligheid van de naakte axonen tot onherstelbare schade, welke is de belangrijkste oorzaak van permanente klinische handicap. Op dit moment de meest effectieve behandelingen zijn immunomodulerende, maar ondanks hun werkzaamheid, in veel gevallen het herstel is vaak traag en ~ 25% patiënten beleeft resterende functionele tekorten die aanzienlijk hun levenskwaliteit6verminderen, 7.

EAN is een veel gebruikte diermodel van demyeliniserende perifere neuropathie die waardevolle inzichten in de pathogenese en een middelen ter beoordeling van nieuwe therapeutische agenten4heeft. Dit model kan worden opgewekt in verschillende soorten zoals konijnen, ratten, muizen en cavia's, en wordt veroorzaakt door immunisatie met neurogene antigenen. Echter, uiteindelijk de succesvolle EAN-inductie hangt af van een passende immuunrespons voor ziekte optreden. Gezien de soorten (en intersite-species/stam) variaties in immune functie, hebben meerdere combinaties van antigenen en hulpstoffen ontwikkeld om met succes het induceren van EAN. In termen van lymfkliertest genetische hulpmiddelen is de C57BL/6 de meest gebruikte; de traditionele P2 eiwit peptide 57-81 (P257-81) waardoor de ziekte in de voor de ziekte vatbare SJL muis stam8 is echter niet in staat om illegale pathogenese leidt tot functionele tekorten in de stam van de C57BL/6. Gelukkig, overgevoeligheid paradigma's met behulp van de P0106-125 of P0180-199 peptides, geleverd in adjuvans gecombineerd met de injectie van pertussis toxine kunt overwinnen deze barrière, waardoor geavanceerde genetische hulpmiddelen om te worden gebruikt in de lymfkliertest EAN model.

Hier wordt een eenvoudige methode voor de inductie van EAN in de C57BL/6 muizen gepresenteerd. Daarnaast vindt u een gedetailleerde aanpak om te evalueren van de functionele en neuropathologische tekorten die is gekoppeld aan de ziekte. De P0180-199 peptide9 werd gekozen boven de P057-81 alternatieve10. Het P0180-199 model is beschreven voor de productie van minder ernstige klinische symptomen in vergelijking met de alternatieve P057-81 10, en daarom kunnen weerstaan van de invoering van potentieel schadelijke genetische verstoringen, herstellen van chirurgische procedures (zoals osmotische pomp implantatie), en is vatbaar voor loopband gait functie4testen. Echter kunnen de loopband gait functie tests en histologische protocollen beschreven hier gemakkelijk worden toegepast bij de studie van de ziekte in een P057-81 geïnduceerde variant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

alle procedures die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door het Florey-Instituut voor Neurowetenschappen en geestelijkegezondheid (Melbourne hersenen centrum) dier ethisch comité en volg de Australische gedragscode voor het gebruik van dieren voor wetenschappelijk Doeleinden.

1. EAN inductie

Opmerking: EAN kan met succes worden opgewekt bij mannelijke C57BL/6 muizen leeftijd tussen 6-8 weken. Het inductie-protocol duurt 9 dagen in totaal. Dag 0 verwijst naar de dag van de eerste immunisatie. Voor dit protocol, injecties werden uitgevoerd onder verdoving (zie stap hieronder 1.1.2).

  1. Op dag -1:
    1. bereiden de toxine Pertussis (Zie Tabel van materialen) oplossing van 1.6 µg/mL met behulp van de steriele 0,1 M muis-isotone fosfaat gebufferde zoutoplossing (MT-PBS).
    2. Afstomping met Isofluraan:
      1. plaats van de muis (C57BL/6, man, 6-8 weken) in de zaal afstomping en aanpassen van de stroom van zuurstof aan 1 L/min.
      2. Zet de vaporizer Isofluraan, aanpassen tot 2,5% voor afstomping, en monitor ademhaling en wacht gedurende 2 minuten, of totdat de primaire reflexen (hoornvlies en hind-limb) zijn niet meer responsieve
    3. De muis uit de zaal afstomping verwijderen en beheren van 250 µL van de bovenstaande Pertussis toxine oplossing via een intraperitoneaal (i.p.) injectie met een 0,5 mL injectiespuit met een naald 30 1/2 G.
    4. De injecteerbare entmateriaal voorbereiden immunisatie:
      1. voorbereiden oplossing A met 2 mg/mL oplossing van P0 180-199 peptide (met > 98% zuiverheid, volgorde S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in een zoutoplossing 0,9%.
      2. Voorbereiden Oplossing B met 20 mg/mL oplossing van Mycobacterium tuberculosis (Zie Tabel van materialen) in Freund ' s compleet adjuvans (FCA, bestaande uit: 15% mannide monoolate + 85% van paraffineolie en 0,5 mg/mL van gedroogde gedood en gedroogde M Mycobacterium butyricum).
      3. Om de laatste entmateriaal voor het injecteren, combineren van gelijk volume delen van oplossingen A en B in een kraal klopper en meng ze tegen een maximumsnelheid voor 1 minuut bij kamertemperatuur.
        Opmerking: Oplossingen A en B kunnen worden gehouden als voorraad en opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal een maand maar het gecombineerde definitieve entmateriaal moet vers worden bereid op de dag van de muis injectie.
  2. Op dag 0, 50 µL van het entmateriaal (voorbereiding beschreven in stap 1.1.4) beheren in een muis via een subcutane injectie met behulp van een naald 23 G.
    Opmerking: De injectie kan worden geplaatst tussen de schouderbladen, of tussen de hind-limb en staart over het caudal dorsum.
  3. Op dag 1, de Pertussis toxine oplossing van 1.2 µg/mL (in MT-PBS) maken en beheren van 250 µL in een muis via i.p. injectie met een 0,5 mL injectiespuit met een naald 30 1/2 G.
  4. Op dag 3, herhaal stap 1.3 hierboven.
    Opmerking: Voorraad oplossingen A en B kunnen worden samengesteld en opgeslagen op 4 ˚C voor een maximum van één maand. Echter, de laatste injecteerbare entmateriaal, geproduceerd door het combineren van stamoplossingen A en B, moet gebeuren op de dag van de injectie.
  5. Beheren op dag 8, 50 µL van het entmateriaal (beschreven in stap 1.1.4 voorbereiding) in een muis via een subcutane injectie (zie stap 1.2 hierboven), op de dezelfde injectieplaats zoals in stap 1.2 (voor elk dier)

2. klinische scoren

  1. voeren klinische scoren uit dagelijkse beginnen op dag 0.
  2. Geven elke muis een score van 0, 1, 2, 3 of 4 volgens de gepubliceerde criteria 4. Zie tabel 1 voor het scoren van klinische EAN.
    Opmerking: Voor consistentie, moet worden getracht te scoren muizen tegelijk dagelijks door de dezelfde onderzoeker.

3. Motor functie beoordeling

Opmerking: de prestaties van de motor in parallel met klinische scoren voor de dezelfde cohort van dieren wordt beoordeeld. Het motor functie beoordeling apparaat moet worden aangesloten op een computer dat heeft een gait functie imaging systeem (Zie Tabel van materialen) geïnstalleerd. Het is ook aanbevolen dat alle muizen worden beoordeeld moeten worden gewend aan de lopende taak vóór EAN inductie. Om dit te doen, praktijk loopt (2 test sessies per muis) worden uitgevoerd drie dagen voorafgaand aan ziekte inductie (dag -3).

  1. Zet de motor functie beoordeling toestellen en de switch op de lichte toets.
  2. Scruff de muis stevig en inkt zijn voeten door het verlagen van het op een container gevuld met rode inkt terwijl haar staart.
    Opmerking: Deze stap is vereist voor de stam C57BL/6, maar kan worden overgeslagen als de stam van een muis met een witte jas-kleur wordt gebruikt.
  3. Plaatst u de muisaanwijzer in het compartiment lopen en de snelheid van de loopband op 15 cm instellen/s.
  4. Draaien op de loopband en op de " record " knop vast te leggen van de draaiende beweging van de muis met behulp van de functie van de gait imaging systeem (Zie Tabel of Materials).
  5. Gebruiken een timer en meten van elke lopen voor 36 s. Na 36 s, opname stoppen en stop de loopband.
    Opmerking: Muizen die niet met succes van de lopende taak voor dit interval s 36 voltooien worden beschouwd te hebben gefaald.
  6. Slaat het videobestand in de aangewezen map.
  7. Herhaal de bovenstaande stappen voor elke muis worden beoordeeld. De muizen met dezelfde lopende taak om de 3 dagen testen.
  8. Analyseren de bewerkte video bestanden met behulp van software voor gait functieparameters (Zie Tabel of Materials).
    Opmerking: De details van hoe te analyseren verschillende motor parameters verschillen onder software zo gelieve te verwijzen naar de fabrikant ' s instructie vóór de analyse. Te krijgen van de histologische bewijs van axonale en myeline schade via immunohistochemistry of elektronenmicroscopie, dierlijke weefsels op de elke fase post motor functie beoordeling afhankelijk van de specifieke doelstellingen van het onderzoek kunnen worden genomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

P0180-199 peptide geïnduceerde EAN in C57BL/6 muizen leidt tot een monofasische ziekte met klinische score begin van 6 dagen post eerste immunisatie (dpi) en maximale score ernst is waargenomen vanaf 25 dpi gevolgd door sommige klinische score verbetering van 40 dpi duur (Figuur 1)4,9. In termen van gait functie, muizen begint te falen bij een eenvoudige lopende taak zo spoedig 6 dpi, en do...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit verslag schetst een eenvoudige methode om te induceren EAN met behulp van de P0180-199 peptide in C57BL/6 muizen, waardoor de kwantificering van belangrijke neuropathologische en functionele tekorten in muizen geïnduceerde met EAN. Verschillende bij het protocol van de EAN-inductie hier beschreven is het gebruik van verdoving tijdens het uitvoeren van de immunisatie injecties. Het gebruik van Isofluraan verdoving verbetert sterk de mogelijkheid om ervoor te zorgen dat het totale volume van entmateriaal sub...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten van belang met betrekking tot dit werk.

Dankbetuigingen

DGG is een NHMRC Peter Doherty en Multiple sclerose onderzoek Australië (MSRA) vroege carrière Fellow. JLF wordt ondersteund door een MSRA Postdoctoral Fellowship. Dit werk werd gesteund door de Australian National Health en medische onderzoek Raad (NHMRC) project #APP1058647 aan JX verlenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C57BL/6, male, 6-8 weken oudAustralian Bioresources Cenre, WA, Australië
Pertussis toxinList Biological Laboratories, Inc., CA, VS#181
0.1 M muis-isotone fosfaat gebufferde zoutoplossing (MT-PBS)Laboratoria hebben hun eigen protocol.
IsofluraanPharmachem, QLD, AustraliëLaboratoria hebben hun eigen protocol voor toediening.
P0180–199 peptideWuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHNP0180–199, sequentie S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R
In warmte gedode Mycobacterium tuberculosis (stam H37RA)Difco, MI, VS#231141
Freund's compleet adjuvans (FCA)Difco, MI, VS#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Services#15710Verdun tot 4% PFA op de dag van weefselverzameling.
25% glutaraldehydProSciTech Pty Ltd, QLD, Australië#11-30-8Verdun tot 2,5% glutaraldehyde op de dag van fixatie.
NatriumazidChem-Supply Pty Ltd, SA, AustraliëSL189Maak 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Gebruik op 0,03% (v/v).
SucroseChem-Supply Pty Ltd, SA, AustraliëSA030Gebruik op 30% (w/v).
Optimum snijtemperatuur (OCT) mediumSakura Finetek, CA, VS#4583
Normaal ezelsserumMerck Millipore, MA, VS#S30-100Gebruik als antilichaamverdunning op 10% (v/v) of een andere concentratie bepaald door het eigen laboratorium.
Triton-X 100Sigma Aldrich, MI, VS#90o2-31-1Gebruik in antilichaamverdunning op 0,3% (v/v) of een andere concentratie bepaald door het eigen laboratorium.
konijn anti-amyloïde precursor eiwit (APP)Invitrogen (Life Technologies), CA, VSS12700Gebruikt op 1:400 of titrateer in eigen lab.
konijn anti-contactin-geassocieerd eiwit-1 (Caspr)Gift van Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, IsraëlGebruikt op 1:500 of titrateer in eigen lab.
Geschikte Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamenMolecular Probes (Life Technologies), OR, VSVerschillendeGebruik op 1:200 of titrateer in eigen lab. De keuze van de soort waarin het antilichaam is opgewekt en de gekozen Alexa Fluor ligt ter beslissing van elk laboratorium.
Waterige montageoplossingDako (Agilent), CA, VS#S3023Elk laboratorium heeft zijn eigen voorkeur.
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Uitrusting
0,5 mL spuit met 301/2 g naaldenBD#326105
23 g naaldenBD#305143
Rode inktpatroonElke rode inktpatroon of rood voedselkleurstof kan worden gebruikt om de voeten van de dieren te markeren.
DigiGate-apparaat (inclusief loopband)eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging SystemeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
StopwatchElke timer mag worden gebruikt.
DigiGait 8 SoftwareeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DissectiemicroscoopZeissElke geschikte dissectiemicroscoop mag worden gebruikt.
Gelaaide glazenSuperfrost Plus, Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CryostatLeicaElke geschikte cryostaat mag worden gebruikt.
Perfusieapparatuur en dissectie-instrumentenLaboratoria hebben hun eigen perfusieprotocollen.
Ondoorzichtige bevochtigde kamerLaboratoria kunnen hun eigen produceren met een ondoorzichtige plastic container.
PAP-penGeneTex (VS)Wax potlood of oppervlaktespanning kan ook worden gebruikt om een kuiltje rond het weefselsegment te maken.
Confocale microscoopZeis LSM780Elke confocale microscoop met geschikte laserlijnen mag worden gebruikt.
FIJI/Image JNational Institutes of HealthBeschikbaar via www.fiji.sc

Referenties

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EAN modelP0 180 199 peptidesubcutane injectiepertussistoxinebeoordeling van de motorische functieloopanalyse op loopbanddemyelinisatie van de nervus ischiadicustransmissie elektronenmicroscopie

Gerelateerde artikelen