Methodenartikel

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56457

⸱

20 december 2017

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, 2Centre for Cancer Research & Cell Biology (CCRCB), School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University Belfast

In dit artikel

Samenvatting

Dit is een protocol bij het bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op het systeem van de Biotine-avidin-pull-down met de nieuwigheid van het combineren van cel-penetrating sequenties. Het belangrijkste voordeel is dat de volgorde van de doelgroep is geïncubeerd met levende cellen in plaats van de cel lysates en daarom de interacties in het cellulaire kader zal optreden.

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie die is gebaseerd op het systeem van de pull-down gebruikte Biotine-avidin. De wijziging gepresenteerd omvat de combinatie van deze techniek met cel-penetrating sequenties. Wij willen ontwerpen van cel-penetrating lokaas dat kunnen worden geïncubeerd met levende cellen in plaats van de cel lysates en daarom de interacties gevonden zal overeen met die die zich binnen de intracellulaire context voordoen. Connexin43 (Cx43), een eiwit dat gap junction kanalen en hemichannels vormt is down-gereglementeerde in hoogwaardige gliomen. De Cx43-regio bestaande uit aminozuren 266-283 is verantwoordelijk voor de remming van de oncogene activiteit van c-Src in glioma cellen. Hier gebruiken we TAT als de cel-penetrating reeks, biotine als de pull-down-tag en de regio van Cx43 tussen aminozuren 266-283 als doel om te vinden van intracellulaire interacties in de cellen van de stam van het menselijke glioma hard-aan-transfect. Een van de beperkingen van de voorgestelde methode is dat het molecuul gebruikt als aas mislukken kan te vouwen goed en, bijgevolg, de interacties gevonden niet geassocieerd met het effect worden kon. Deze methode kan echter vooral interessant voor de interacties die betrokken zijn bij signaaltransductie trajecten omdat ze meestal worden uitgevoerd door intrinsiek ongeordende regio's en, dus ze niet een geordende vouwen hoeven. Een van de voordelen van de voorgestelde methode is bovendien dat de relevantie van elke residu op de interactie gemakkelijk kan worden bestudeerd. Dit is een modulair systeem; Daarom kunnen andere cel-penetrating sequenties, andere codes, en andere intracellulaire doelen worden gebruikt. Ten slotte, het toepassingsgebied van dit protocol is tot ver buiten de eiwit-eiwit interactie omdat dit systeem kan worden toegepast op andere bioactieve lading zoals RNA-sequenties, nanodeeltjes, virussen of elk molecuul dat kan worden transduced met cel-penetrating sequenties en gesmolten aan pull-down labels aan het bestuderen van hun intracellulaire werkingsmechanisme.

Inleiding

Eiwit-eiwitinteractie zijn essentieel voor een grote verscheidenheid van cellulaire processen. Om volledig te begrijpen deze processen, zijn methoden voor het identificeren van eiwit interacties binnen de complexe intracellulaire omgeving vereist. Een van de meest gebruikte methoden voor het identificeren van de partners van de interactie van een eiwit is het gebruik van dat eiwit of een mimetische peptide van een deel van die eiwitten zoals aas in affiniteit pull-down experimenten gevolgd door detectie van bindende proteïnen. Het systeem van de avidin-biotine wordt vaak gebruikt vanwege de hoge affiniteit, de specificiteit en de stabiele interactie tussen avidin en biotine1,2. Meestal, Biotine is covalent gebonden aan het aas (proteïne of peptide) en na een periode van incubatie met de cel lysates om de oprichting van interacties, het aas van de biotinyleerd gebonden aan haar intracellulaire partners is neergehaald met avidin of avidin derivaten geconjugeerd met ondersteuning kralen. Vervolgens, aas-eiwitinteractie worden gedetecteerd na wassen, elutie en analyse door denaturering van elektroforese gevolgd door westelijke vlek. Een van de problemen van deze techniek is dat de interacties tussen de proteïne van belang en haar intracellulaire partners buiten de cellulaire context plaatsvinden. Dit is vooral belangrijk voor de interacties die betrokken zijn bij signaaltransductie trajecten, omdat ze in specifieke intracellulaire locaties plaatsvinden, ze van voorbijgaande aard zijn en zijn ze meestal uitgevoerd door niet overvloedig eiwitten. Daarom binnen de cel lysates kunnen deze interacties worden gemaskeerd door andere meer overvloedig eiwitten of proteïnen die meestal niet in de nabijheid.

Cel-penetrating peptiden (CPPs) zijn korte peptides (≤40 amino acids), gecomponeerd door kationische aminozuren die geschikt zijn voor het vervoer van een breed scala van moleculen in bijna elke cel3meestal. Lading zoals eiwitten, plasmide DNA, siRNA, virussen, imaging agenten en verschillende nanodeeltjes hebben zijn geconjugeerd met CPPs en efficiënt verinnerlijkte4,5. Vanwege dit transport vermogen zijn ze ook bekend als eiwit transductie domeinen (PTDs), membraan translocating sequenties (MTSs) en Trojaanse peptiden. De TAT-peptide van het HIV transactivator eiwit TAT6 een van de meest voorkomende is studeerde onder de CPPs, 7,8,9. TAT is een nonapeptide dat bevat 6 arginine en 2 lysine residuen en dus zeer kationische. Vervanging studies hebben aangetoond dat de netto positieve lading van TAT voor Elektrostatische interacties met het plasma-membraan van eukaryotische cellen en de daaropvolgende internalisering10noodzakelijk is. Ook aan andere CPPs bindt positief-geladen TAT sterk via een elektrostatisch proces aan de verschillende negatief geladen diersoorten aanwezig aan het oppervlak, extracellulaire celmembranen, met inbegrip van lipide hoofd groepen, glycoproteïnen en proteoglycans3 , 10. de bioactieve lading vervoerd door TAT onmiddellijk vrij in het cytosol te bereiken hun intracellulaire partners worden.

Hier presenteren we een methode die de TAT CPP met biotine combineert te bestuderen van intracellulaire interacties. Het doel is het ontwerpen van cel-penetrating lokaas door te smelten het doel Biomolecuul TAT en biotine. Het belangrijkste voordeel van dit voorstel is dat de interacties tussen het aas en haar partners in de cellulaire kader plaatsvinden zal. Om weer te geven van de doeltreffendheid van deze methode hebben we gebruikt als aas een kleine reeks van het eiwit Cx43 die is gerapporteerd voor intracellulair interactie met de oncogen c-Src11,12,13. Cx43 is een integraal membraan eiwit dat algemeen wordt uitgedrukt in astrocyten14en down-geregeld in hoogwaardige gliomen, de meest voorkomende kwaadaardige tumor van de centrale zenuwstelsel15,16,17 ,18. Het is al eerder gebleken dat de Cx43-regio die met c-Src (aminozuren 266-283 in menselijke Cx43 samenwerkt; PubMed: P17302) gefuseerd tot TAT (TAT-Cx43266-283) remt de oncogene activiteit van c-Srcin glioma cellen en glioma stam cellen (GSCs)19,20,21. Voor het ontwerpen van het intracellulaire aas, Cx43266-283 is gesmolten TAT in het N-terminus (TAT-Cx43266-283) en biotine in de C-terminus (TAT-Cx43266-283- B). Deze strategie is met succes gebruikt in de rat glioma C6 cellijn te identificeren c-Src, c-terminal Src kinase (CSK) en fosfatase en Tenzin homolog (PTEN) als intracellulaire partners van deze regio van Cx4320. Hier beschrijven we deze methode het testen van de werkzaamheid in menselijke GSCs, die zeer relevant zijn voor glioma therapie maar veel moeilijker om te transfect dan niet-stam glioma cellen.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd aan de Universiteit van Salamanca.

1. cellen

  1. Twee dagen vóór het begin van de procedure, plaat de cellen bij de gewenste dichtheid worden confluente de dag van het experiment. Plaat van de cellen in kolven of platen. De eiwit extractie zullen echter gemakkelijker van platen. Het is handig om voor te bereiden ten minste 4 platen van 78 cm2 of 2 flacons van 150 cm,2 per voorwaarde per experiment, om er zeker van te zijn dat de resultaten stroken.
  2. In deze studie, plaat menselijke G166 GSCs in 4 maatkolven van 150 cm2, gekweekt in de cel van de stam van de RHB-A medium aangevuld met 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF en b-FGF zoals beschreven door Pollard et al.22. Proces bij samenvloeiing werd bereikt. Bijvoorbeeld, bij het 5 x 106 G166 cellen werden uitplaten in een maatkolf van 150 cm2 , waren ze 2 dagen na plating verwerkt.

2. biotinyleerd CPPs

  1. Draai de flesjes met de gelyofiliseerd biotinyleerd CPPs (BCPPs) bij 8200 x g gedurende 30 s, om te voorkomen dat enkele van het poeder nog op het deksel. Een besturingselement BCPP om er zeker van te zijn dat de interacties die gevonden zijn specifiek van de doel-volgorde bevatten. In deze studie was het besturingselement BCPP TAT-Biotine (TAT-B) en de behandeling BCPP TAT-Cx43266-283- B. Andere besturingselementen kunnen worden gebruikt, zoals TAT gesmolten vervormd of gemuteerde fragmenten obligatie aan biotine.
  2. Los van de BCPPs in het overeenkomstige kweekmedium aan de stockoplossing aangegeven door de fabrikant; bijvoorbeeld, om het verkrijgen van een stamoplossing van 2 mg/mL toevoegen BCPP te behandelen GSCs 0,5 mL GSC kweekmedium aan één ampul met 1 mg van de BCPP. Vortex en zorg ervoor dat de peptide is goed opgelost.

3. buizen

Opmerking: Bereiden ten minste twaalf 1,5 mL buizen per voorwaarde vereist in de sectie 7.

  1. Markeer de eerste 3 buizen per voorwaarde. Ze zal het totale volume van cellulaire lysates in stap 6.4 verkregen hebben.
  2. Markeer een A in 3 buizen per voorwaarde. Deze buizen zal hebben de eerste supernatant verkregen nadat lysing en centrifugeren van de cellulaire lysates, stap 7.2.
  3. Markeer een B in 3 buizen per voorwaarde. Deze buizen wordt een kleine hoeveelheid van de eerste supernatant hebben. Deze lysates zal dienen als de westelijke vlek monsters in stap 7.3.
  4. Markeer een C in 3 buizen per voorwaarde. Deze buizen zal het supernatant na de pull-down met NeutrAvidin, stap 7.7 verkregen hebben.
    Opmerking: Dit is belangrijk in het geval dat de westelijke vlek toonde geen signaal voor eiwitten, wat betekent dat de eiwitten niet werden gesloopt of werden verloren op sommige stap van de procedure. Als dit de situatie, herhaal het proces te trekken van de eiwitten.

4. cellulaire behandeling met de BCPPs

  1. Gecombineerd het kweekmedium.
  2. Vervang de overeenkomstige hoeveelheid verse medium nodig is om te broeden van de BCPPs in de kleinste mogelijke hoeveelheid medium volgens de incubatie times. Het is zeer belangrijk dat in ieder geval het medium volledig het hele oppervlak van de plaat/kolf dekt zodat de cellen niet, bijvoorbeeld, 6 mL per 150 cm2 voor een 30 minuten incubatie uitdrogen doen.
  3. Het volume van de stockoplossing van BCPP toevoegen aan de celculturen te bereiken van het concentratie die heeft bewezen effectief te zijn. In deze studie 50 µM TAT-Cx43266-283is -B bewezen om GSC proliferatie.
    1. Daarom Voeg 92.8 µL van 2 mg/mL TAT-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) per mL gestolde voedingsbodem om een eindconcentratie van 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Als het volume moet worden toegevoegd verschillend voor controle peptides, compleet met cultuur medium tot het eindvolume voor dezelfde is. Bijvoorbeeld, 49.1 µL TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) plus 43.7 µL GSC medium werden toegevoegd per mL gestolde voedingsbodem om een eindconcentratie van 50 µM TAT-B.
  4. Plaats de cellen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 minuten om ervoor te zorgen dat de interacties tussen de BCPP en haar intracellulaire partners plaatsvinden. Als de interactie langer duurt, Incubeer gedurende langere tijd of tijden aan te passen in het geval dat het experiment bestond uit een tijd-cursus. Bovendien, kan de interactie van belang worden bevorderd of voorkomen door stimulerende verschillende intracellulaire signaalroutes.

5. buffers en oplossingen.

  1. Bereiden van PBS pH 7.4: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM nb2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2PO4.
  2. Eiwit lysis-buffermengsel bereiden: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, voorafgaande te gebruiken, voeg het volgende toe: 1/100 (v/v) Protease Inhibitor Cocktail, 1 mM Natriumfluoride, 1 mM Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) en 0.1 mM natrium orthovanadate.
  3. Laemmli buffer bereiden: (4 x: 0.18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glycerol; 3,7% SDS (p/v), 0.6 M β-mercaptoethanol of 9 mM DTT; 0,04% (v/v) bromophenol blauw (BB)).

6. eiwit extractie

Opmerking: Eiwit extractie werd uitgevoerd als eerder beschreven20,23. Verrichten van dit hele gedeelte van de procedure bij 4 ° C.

  1. Het kweekmedium volledig gecombineerd.
  2. Wash 3 x 10 mL met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) per 150 cm2 zeer zorgvuldig om te voorkomen mobiele-detachement.
  3. Voor het verkrijgen van de cel lysate, voeg 3 mL lysisbuffermengsel per 150 cm2 en grondig Schraap het oppervlak met behulp van een cel schraper. De plaat/kolf op ongeveer 45 graden kantelen zal gemakkelijker maken om de cel lysates verzamelen in hun overeenkomstige buizen.
  4. Giet 1 mL van de cellulaire lysate per buis in drie 1,5 mL tubes. Deze buizen worden gemarkeerd met de voorwaarde en de repliceren zoals aangegeven in stap 3.1.

7. pull-down

  1. Centrifugeer de 1,5 mL tubes bij 11.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  2. Het supernatant overbrengen in nieuwe buizen (A).
  3. Neem een aliquoot deel van deze supernatans per voorwaarde naar verschillende buisjes (B), dat wil zeggen 50 µL per buis. 4 x Laemmli buffer (16.6 µL voor 50 µL van lysate) toevoegen en bevriezen bij-20 ° C. Deze lysates zal zoals gebruikelijk westelijke vlek monsters dienen.
  4. Meng heel goed de NeutrAvidin Agarose door zacht te schudden. Snij de uiteinden van de pipet tips te verhogen hun diameter en verbeteren de pipetteren van de parels.
Voeg 50 µL van NeutrAvidin Agarose per mL cel lysate in de buizen (A).
  • Incubeer bij 4 ° C's nachts met zeer zacht schudden zodat NeutrAvidin om te interageren met BCPPs gebonden aan hun intracellulaire partners.
  • Centrifugeer bij 3000 x g voor 1 min bij 4 ° C voor het verzamelen van het complex van NeutrAvidin met eiwitten.
  • Verwijder het supernatant voorzichtig en overbrengen naar schone buizen (C). Houd ze om ze te gebruiken in het geval dat de pull-down is niet succesvol.
  • Wassen stappen: verse lysis-buffermengsel toevoegen aan de pellets (buizen A), resuspendeer door inversie en herhaal de stappen 7.6) en 7.7) voor 5 keer. Alle deze supernatant kunnen worden verwijderd.
  • Verwijder het supernatant en 2 x Laemmli buffer toevoegen aan de gewenste eindvolume (40 µL per 1,5 mL tube voor pellets 150 cm2 flacons van confluente cellen verkregen).
  • Elueer bij 100 ° C gedurende 5 minuten te distantiëren van de interacties tussen eiwitten en centrifuge voor 30 s bij 8.200 x g tot pellet NeutrAvidin kralen.
  • Neem het supernatant, die de gedissocieerde eiwitten bevatten, met capillaire tips om nieuwe buizen (D). De kralen kunnen worden gehouden in het geval dat herhalende elutie stappen vereist is.
    Opmerking: Het supernatant (buizen D) zijn nu klaar om te worden geladen in de westelijke vlek of bevriezing bij-20 ° C.

    • 8. westelijke vlek

    Opmerking: Westelijke bevlekken werd uitgevoerd als eerder beschreven24.

    1. Laden equivalent volume van elk monster per rijstrook op Bis-Tris (4-12%) midigels in een Midi-cel elektroforese systeem.
    2. Transblot eiwitten met behulp van een droge Bevlekkende systeem op een regelmatige nitrocellulose-stack.
    3. Vlekken van het membraan met 10% Ponceau gedurende 10 minuten.
    4. Wassen van de membranen 3 x 5 min met 5 mL van de TTBS.
    5. Het blokkeren van de membranen met 7% melk in TTBS voor 1 h met zacht schudden in buizen of in kleine vakken. Controleer of het volume dat wordt gebruikt is genoeg ter dekking van de membranen en dat zij niet doen droog, dat wil zeggen 40 mL per hele midi membraan.
    6. 3 x 5 min met 5 mL van TTBS wassen.
    7. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C met het primaire antilichaam tegen het eiwit van belang met zacht schudden.
    8. 3 x 5 min met 5 mL van TTBS wassen.
    9. Incubeer het membraan bij kamertemperatuur met de correspondent peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam in TTBS gedurende 1 uur.
    10. 3 x 5 min met 5 mL van TTBS wassen.
    11. Ontwikkelen met een chemiluminescentie substraat in een chemiluminescentie-systeem.

    9. problemen oplossen

    1. Als de westelijke vlek na het ontwikkelen van een van de monsters bleek geen signaal helemaal voor eiwitten, controleert u de Ponceau.
      Opmerking: Het membraan in Ponceau moet tonen ongedefinieerde en talrijke banden langs de rijstroken geladen. Als de banden niet erg merkbaar zijn, kan de hoeveelheid eiwitten geladen niet genoeg of de overdracht kan verkeerd zijn gegaan. Overwegen de westelijke vlek te herhalen.
    2. Als er geen vlek helemaal in het membraan van de Ponceau in elke rijstrook, herhaal de hele procedure van de stap 7.4 in het (C) buizen.
    3. Als na het ontwikkelen van de westelijke vlek een eiwit-signaal erg zwak is, maar de Ponceau eiwitten toonde, incubeer opnieuw het membraan met het primaire antilichaam voor langere tijd. Als het signaal nog steeds vrij zwak is, laat weer bij kamertemperatuur inwerken.

    10. andere technieken gebruikt in dit artikel

    1. Immunocytochemie van BCPPs
      1. Cellen in 4% paraformaldehyde (0.2 mL per cm2) gedurende 20 minuten vast te stellen.
      2. Wassen van 3 x 5 min met PBS (0.2 mL per cm2).
      3. Toepassing van de overeenkomstige antilichaam (ten minste 0,15 mL per cm2) verdund in antilichaam oplossing bij de fabrikant aangegeven concentratie tegen uw proteïne van belang 's nachts bij 4 ° C.
      4. Met een fluorophore-geconjugeerde secundair antilichaam (0,15 mL per cm2) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
      5. Herhaal stappen 10.1.2-10.1.4 met andere antilichamen tegen uw proteïnen van belang. Wees voorzichtig niet te gebruiken van dezelfde soort voor verschillende primaire antilichamen of dezelfde golflengte fluorophores voor secundaire antilichamen.
      6. Monteer de cellen waarbij de antifade reagens gebruikt wordt (0,005 mL per cm2).
      7. Analyseren op een fluorescentie Microscoop aangesloten op een digitale camera.
    2. MTT assay
      1. Cultuur van de cellen bij 37 ° C in 24-Wells-platen.
      2. Incubeer de cellen in het donker voor 75 min met 0,15 mL van kweekmedium per cm2 met 0,5 mg/mL MTT.
      3. Het medium gecombineerd en Incubeer de cellen gedurende 10 minuten in het donker met dimethylsulfoxide (0,25 mL per cm2) met milde schudden.
      4. Meet de extinctie bij een golflengte van 570 nm microplate lezer gebruikt.

    Resultaten

    Voordat u met BCPPs intracellulaire interactie te bestuderen, is het essentieel om te vergelijken de effecten van BCPP vs CPP voor het valideren van de resultaten verkregen met BCPP. Dus om te bestuderen of de opname van biotine de activiteit van de doel-reeks wijzigt, geanalyseerd wij eerst het effect van TAT-Cx43266-283- B vergeleken met TAT-Cx43266-283 op G166 GSCs morfologie. Om dit te doen, we sommige immunofluorescentie analyses van twee cytoskeletal proteïnen, F-actine en α-tubuline na 24 h behandeling uitgevoerd. Figuur 1 toont aan dat G166 GSCs in aanwezigheid van 50 µM TAT-Cx43266-283 of TAT-Cx43266-283- B verwerven een meer afgeronde vorm ten opzichte van de verlengde en uitgebreide cellulaire verlenging weergegeven in de besturingselementen (TAT of TAT-B). In feite, Figuur 1b blijkt dat door samensmelting van filamenten actine worden meestal gemonteerd als actine netwerken wanneer de cellen werden behandeld met TAT-Cx43266-283 of TAT-Cx43266-283- B terwijl ze meer actine bundels in de controle cellen vormen (TAT behandeld of TAT-B)25. Α-tubuline distributie doet daarentegen niet variëren tussen de verschillende voorwaarden. Deze resultaten toonden aan dat de aanwezigheid van Biotine heeft niet het wijzigen van het effect van de doel-reeks op de morfologie van G166 GSCs. In vorige studies20,21toonden we dat TAT-Cx43266-283 verminderd G166 GSCs proliferatie. In deze studie onderzoeken we of TAT-Cx43266-283- B oefent het dezelfde effecten in de groei als TAT-Cx43266-283. Om dit te doen, geanalyseerd wij de G166 GSCs proliferatie door MTT assay na 72 uur behandeling. De MTT-bepaling is een colorimetrische bepaling voor de beoordeling van de metabole activiteit van de cel. MTT wordt gemetaboliseerd door NAD (P) H oxidoreductasen enzymen in mitochondriën als gevolg van het aantal levensvatbare cellen aanwezig. Figuur 2 toont aan dat de vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen van de G166 GSCs niet significant verschillend wanneer cellen werden behandeld met 50 µM TAT-Cx43266-283 of 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Inderdaad, beide aanzienlijk verminderd G166 GSCs proliferatie in vergelijking met de controle, TAT of TAT-B.

    Zodra we hebben bevestigd dat het effect voor onze doelgroep sequence in G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) werd niet gewijzigd door de opname van Biotine in de C-terminus (TAT-Cx43266-283- B), we onderzocht de intracellulaire partners van deze reeks volgens het protocol beschreven in deze studie (Figuur 3). Omdat caveolae betrokken zijn geweest bij het mechanisme van TAT internalisering26, geanalyseerd wij de aanwezigheid van caveolin-1 (Cav-1) in het pull-downs. Westelijke vlekkenanalyse (Figuur 4) toonde dat TAT-B en TAT-Cx43266-283- B communiceren met Cav-1. Echter, de mogelijkheid van TAT-Cx43266-283- B c-Src, PTEN en CSK werven is sterker dan die gevonden met TAT-B. Focal hechting kinase (FAK) is een substraat van c-Src, dat is niet aangetoond dat interactie met Cx43. Inderdaad, FAK toonde geen significante tussenkomst met TAT-B of TAT-Cx43266-283- B.

    Om te bevestigen de interactie tussen TAT-Cx43266-283- B- en c-Src, G166 GSCs werden geïncubeerd met 50 µM TAT-Cx43266-283- B voor 30 min en hun localisatie met fluorescerende daar werd gevolgd door confocale microscopie (Figuur 5 ). Onze resultaten toonden aan dat de intracellulaire verdeling van TAT-Cx43266-283- B ligt dicht bij het plasma-membraan (weergegeven door fosfatidylserine kleuring) en komt overeen met met die van c-Src. In feite, co lokalisatie analyses bleek enkele punten van co lokalisatie (wit) tussen TAT-Cx43266-283- B- en c-Src in de afbeelding samenvoegen. Bijgevolg, confocal microscopie studies bevestigen de resultaten verkregen met de BCPP pull-down protocol beschreven in deze studie.

    figure-results-1
    Figuur 1: Effect van BCPP en CPP op GSC morfologie.
    G166 GSCs waren uitplaten aan een lage dichtheid (2 x 104 cellen / cm2) encontrole na 24 h ze werden geïncubeerd met 50 µM controle CPP (TAT), BCPP (TAT-B), de behandeling CPP (TAT-Cx43266-283) of de behandeling BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-actine (rood), α-tubuline (groen) en samengevoegde + DAPI immunokleuring van hetzelfde veld weergegeven: G166 GSCs morfologie. Balken van 50 µm. b =) F-actine immunokleuring waarin de verschillende verdeling van F-actine in G166 GSCs na incubatie gedurende 24 uur met 50 µM controle CPP (TAT) of de zeggenschap BCPP (TAT-B) vergelijking met 50 µM behandeling CPP (TAT-Cx43266-283) of BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). Bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-2
    Figuur 2: Effect van BCPP en CPP op GSC levensvatbaarheid.
    G166 GSCs waren uitplaten aan 5500 cellen/cm2 in 24-multiwell platen en geïncubeerd met 50 µM controle peptides, CPP (TAT) of BCPP (TAT-B), of 50 µM behandeling peptides, CPP (TAT-Cx43266-283) of BCPP (TAT-Cx43266-283- B). De levensvatbaarheid van de cellen werd geanalyseerd met behulp van een MTT-assay na 72 uur. De resultaten worden uitgedrukt als MTT verticaal absorptie en zijn de gemiddelde ± s.e.m. van ten minste 3 experimenten (++ p˂0.01 vs controle. ** p˂0.01, *** p˂0.001 vs TAT of TAT-B; one-way ANOVA-withTukey na de test). Er zijn overigens niet significante verschillen tussen de effecten van CPPs vs BCPPs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-3
    Figuur 3: Protocol diagram.
    Stap voor stap grafische voorstelling van de procedure zoals beschreven in de sectie 'Protocol', van de incubatie van de BCPPs totdat de eluted BCPPs en hun interacterende eiwitten obtained.1 waren) Incubeer cultuur cellen met BCPPs op de gewenste concentratie voor de vereiste tijd. 2) tijdens de incubatie, de BCPPs zijn geïnternaliseerd en ze interageren met hun intracellulaire partners. 3) wassen de cellen drie keer op ijs met ijskoude PBS. 4) lyse de cellen om uit te pakken van eiwitten. 5) overbrengen in cel lysates buizen.6) draaien op 11000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. 7) overdracht het supernatant nieuwe buizen (A) en houd een kleine hoeveelheid van de lysates verwerken als regelmatige Western blot monsters in tube (B). 8) resuspendeer de NeutrAvidin Agarose kralen en voeg 50 µL aan elke buis een met behulp van een gesneden pipette uiteinde. 9) broeden met voorzichtig schudden voor 12u bij 4 ° C om de NeutrAvidin agarose parels om te interageren met de BCPPs en hun partners. 10) spin voor 1 min bij 3000 x g aan de kralen met de biotinyleerd pellet lokaas en hun interacterende eiwitten gebonden aan hen. 11) supernatant overbrengen door nieuwe buizen (C) en houd ze te gebruiken in het geval dat de pull-down behoeven te worden herhaald. 12) wassen de pellet vijfmaal met verse lysis-buffermengsel, resuspendeer door inversie, spin voor 1 min bij 3000 x g en verwijder het supernatant. 13) Verwijder alle het supernatant zorgvuldig. 14) toevoegen de gewenste hoeveelheid 4 x Laemmli buffer en elueer de eiwitten bij 100 ° C gedurende 5 min. 15) draaien op 8200 x g voor 30 s tot pellet van de kralen. 16) overdracht van de eluted eiwitten gevonden in het supernatant met capillaire tips om nieuwe buizen (D). 17) op gels voor westelijke vlekkenanalyse laden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-4
    Figuur 4: Studie van de intracellulaire interacties van TAT-Cx43266-283- B in G166 GSCs door pull-down gevolgd door westelijke vlek.
    G166 GSCs werden geïncubeerd met 50 µM TAT-B of TAT-Cx43266-283- B. Na 30 min de cellen werden lysed en TAT-B of TAT-Cx43266-283werden -B gekoppeld aan hun intracellulaire partners neergehaald met NeutrAvidin kralen. De eluted eiwitten waren geladen en geanalyseerd door westelijke vlek te bestuderen van de niveaus van FAK, c-Src, CSK, PTEN en Cav-1. Opmerking dat Cav-1 met beide TAT-B interageert en TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN en CSK ermee netcongestieproblemen TAT-Cx43266-283- B en FAK bleek niet dat elke interactie met TAT-B of TAT-Cx43266-283-B. Please Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    figure-results-5
    Figuur 5: Bevestiging van TAT-Cx43266-283- B intracellulaire interacties in G166 GSCs door confocale microscopie.
    G166 GSCs werden geïncubeerd met 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Na 30 min, cellen werden vastgesteld en verwerkt om te lokaliseren TAT-Cx43266-283- B met Cy2-streptavidine (groen), c-Src door immunofluorescentie (rood) en fosfatidylserine met Annexine V (blauw). Let op sommige punten van co lokalisatie (wit) tussen TAT-Cx43266-283- B- en c-Src dichtbij het plasma-membraan in de beelden samenvoegen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Discussie

    Er zijn vele methodes aan studie eiwit-eiwitinteractie. De methode voorgesteld in deze studie is gebaseerd op de gebruikte Biotine-avidin pull-down systeem waarin een biotinyleerd aas is geïncubeerd met cel lysates om de oprichting van interacties. De wijziging in deze studie gepresenteerd omvat de combinatie van deze techniek met cel-penetrating sequenties. Wij willen ontwerpen van cel-penetrating lokaas dat kunnen worden geïncubeerd met levende cellen in plaats van de cel lysates en daarom de interacties gevonden zal overeen met die die hebben plaatsgevonden in het cellulaire kader.

    Hier gebruiken we TAT als de cel-penetrating reeks, biotine als de pull-down-tag en de regio van Cx43 tussen aminozuren 266-283 als doel om te vinden van intracellulaire interacties in menselijke GSCs. De structurele basis voor de interactie tussen Cx43 en c-Src is bekend11,12. Dit is een belangrijke interactie omdat het remt de oncogene activiteit voor c-Src in glioma cellen24,13. In feite, bootsen CPPs met deze regio (TAT-Cx43266-283) de antioncogenic eigenschappen van Cx43 van glioma cellen19,20,21. Het mechanisme waarmee TAT-Cx43266-283 c-Src remt bevat rat glioma C6 cellen, de aanwerving van c-Src samen met haar endogene remmers CSK en PTEN20. Er moet worden opgemerkt dat GSCs erg interessant als een doel in glioma therapie, zijn want zij vormen een subpopulatie thats resistent tegen conventionele behandelingen en dus verantwoordelijk voor de herhaling van deze kwaadaardige hersenen tumoren27. Bovendien, ze zijn hard-aan-transfect cellen en daarom de studie van intracellulaire interacties wordt moeilijker. CPPs zijn snel en efficiënt geïnternaliseerd in GSCs19 ten gunste van het gebruik ervan voor de studie van intracellulaire interacties. In deze studie, met behulp van CPPs gesmolten aan biotine we bevestigen de interactie van de volgorde van de266-283 Cx43 met c-Src samen met haar endogene remmers CSK en PTEN in menselijke GSCs.

    Deze methode is zeer krachtig te bestuderen van het intracellulaire mechanisme van bioactieve stoffen. Het is echter zeer belangrijk om te bevestigen dat het biologische effect van de biotinyleerd cel doordringende aas niet van die verkregen met de niet-biotinyleerd een verschilt. Deze stap is vereist voor het koppelen van de interacties die zijn gevonden met het effect van de bioactieve stof. Bovendien moet de stabiliteit van de stof, de mogelijke aantasting door proteasen, alsmede de mogelijke giftigheid, zorgvuldig worden getest en in aanmerking genomen voor de planning van het experiment. In het voorbeeld gepresenteerd, is het anti-proliferatieve effect van TAT-Cx43266-283 op G166 menselijke GSCs eerder gedocumenteerd20geweest. In deze studie, bevestigen wij dat de anti-proliferatieve effect van TAT-Cx43266-283- B en van TAT-Cx43266-283 is zeer vergelijkbaar. Bovendien, het onderzoek van cellulaire morfologie bleek dat α-tubuline en F-actine distributie is zeer vergelijkbaar in G166 GSCs TAT-Cx43266-283behandeld -B of met TAT-Cx43266-283. Over het geheel genomen is deze resultaten wijzen erop dat de opname van Biotine in de c-terminus van TAT-Cx43266-283 niet de effecten van dit samengestelde op menselijke GSCs te wijzigen. Echter als Biotine de gevolgen van het bioactieve molecuul wijzigt zou, kunnen andere codes voor eiwitreiniging worden getest, zoals de vlag octapeptide (DYKDDDDK)28, de humane influenza hemagglutinine-afgeleide tag HA (YPYDVPDYA) of glutathion S-transferase (GST)29. Op dezelfde manier als TAT niet zijn op de bevolking van de cel van belang gericht doet, andere cel doordringende sequenties, zoals penetratin, MPG (voor een overzicht, Zie30) of cel specifieke opeenvolgingen kunnen gebruikte31.

    Naast studie eiwitten die specifiek interactie met de doelgroep opeenvolging, idealiter, moet de aanwezigheid van eiwitten die interactie met zowel het besturingselement als het doel volgorde en eiwitten die geen interactie met hen, als positieve en negatieve controles, aan de orde. In deze zin, we vonden Cav-1 in het besturingselement en behandeld situatie, wat suggereert dat de caveolae betrokken zijn geweest bij het mechanisme van internalisering, zoals eerder is26 gebleken. Bovendien FAK, die samenwerkt met c-Src, maar niet om te interageren met de Cx43 c-terminal wordt verondersteld, afwezig was in zowel het besturingselement als het behandelde situatie. Deze resultaten versterken het specifieke karakter van de interactie tussen TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK en PTEN. Om te bevestigen de resultaten met dit protocol, kan confocal microscopie worden gebruikt om te visualiseren van de verdeling van de interacterende eiwitten en te bestuderen of hun co lokalisatie. Dus vonden we dat TAT-Cx43266-283- B- en c-Src vertonen een vergelijkbare intracellulaire distributie met enkele punten van co lokalisatie bevestiging van de resultaten met de pull-down-experimenten verkregen. In feite, TAT-Cx43266-283- B dicht bij het plasmamembraan suggereren dat de lading, in deze studie Cx43266-283, de molecule tot haar intracellulaire partners regisseert wordt verdeeld.

    Een van de beperkingen van de voorgestelde methode is dat het molecuul gebruikt als aas te vouwen correct kan mislukken en de verwachte effecten niet gevonden zou worden. In deze situatie kunnen het voorkomen dat de interacties die zijn gevonden niet worden gekoppeld aan het effect. Deze methode kan echter vooral interessant voor de interacties die betrokken zijn bij signaaltransductie trajecten omdat ze meestal worden uitgevoerd door intrinsiek ongeordende regio's32 en dus ze niet een geordende vouwen hoeven. Een van de voordelen van de voorgestelde methode is bovendien dat het tijdsverloop van de interactie kan worden gevolgd, die is vooral relevant voor voorbijgaande interacties. De relevantie van elke residu op de interactie kan bovendien eenvoudig worden bestudeerd. Inderdaad, is het mogelijk om te bestuderen van de relevantie van posttranslationele modificaties op eiwit-eiwit interactie, bijvoorbeeld door phosphomimetic vervanging van glutamaat voor serine en threonine. Evenzo, vervanging van serine en threonine voor alanine of tyrosine voor fenylalanine kunt testen van het effect van niet-phosphorylatable serine en threonine tyrosine-.De meest nauwkeurige methode is om na te bootsen phospho-tyrosine, de vervanging van Tyr p-Tyr33.

    Ten slotte, het toepassingsgebied van dit protocol is tot ver buiten de eiwit-eiwit interactie omdat dit systeem kan worden toegepast op andere bioactieve lading zoals RNA-sequenties, nanodeeltjes, virussen of andere moleculen die kunnen worden gesmolten aan biotine en getransduceerde met CPP om te studeren hun intracellulaire werkingsmechanisme.

    Openbaarmakingen

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Dankbetuigingen

    Wij danken M. Morales en J. Bravo voor hun hulp bij het ontwerpen van CPPs en J.C. Arévalo voor zijn hulp met het pull-down-protocol. We zijn dankbaar voor de technische bijstand van T. del Rey. Dit werk werd gesteund door de Ministerio de Economía y Competitividad, Spanje; EFRO BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Spanje; EFRO-SA026U16- en Fundación Ramón Vicente Areces. M. Jaraíz-Rodríguez en A. González-Sánchez zijn ontvangers van een beurs van de Junta de Castilla y León en het Europees Sociaal Fonds.

    Materialen

    Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
    NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
    G166 GSC lineBioRep
    RHB-A stamcelmediumTakaraY40001
    Laminin Muis EiwitInvitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific23017-01510 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X)Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific17504-0442%
    N-2 Supplement (100x)Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific17502-0481%
    Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-1520 ng/ml
    Recombinant Human b-FGFPeprotechAF-100-18B20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In gedeioniseerd water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    AccutaseSigmaA6964
    Cryostor CS10 cryopreservation mediumStemCell Technologies7930
    TATGenScript-Op maat gemaakt
    TAT-BGenScript-Op maat gemaakt
    TAT-Cx43266-283GenScript-Op maat gemaakt
    TAT-Cx43266-283-BGenScript-Op maat gemaakt
    Alexa Fluor 594 PhalloidinMolecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher ScientificA12757371/20
    Monoklonaal α-tubulin muis antilichaamSigma-AldrichT90261/500
    4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ AgaroseThermoFisher Scientific29200
    Eiwit lyses buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-FreeCalbiochem, Bionova5391341/100 (v/v)
    Sodium FluoridePanReac AppliChem1416751 mM
    Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP76261 mM
    NatriumorthovanadateSigma-AldrichS65080.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol of 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) broomfenolblauw (BB) .1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis SystemLife Technologies, ThermoFisher ScientificWR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%Life Technologies, ThermoFisher ScientificWG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)Life Technologies, ThermoFisher ScientificNP00011X
    NuPAGE Transfer Buffer 20xLife Technologies, ThermoFisher ScientificNP00061X
    Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranen)Life Technologies, ThermoFisher ScientificIB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel overdrachtsapparaatLife Technologies, ThermoFisher ScientificIB21001
    10% Ponceau S Oplossing (0.1% Ponceau (w/v) in 5% azijnzuur (v/v)) in waterSigmaP7170
    FAK polyklonaal konijn antilichaamLife Technologies, ThermoFisher ScientificAHO05021/500
    Src polyklonaal konijn antilichaamCell Signalling (WERFEN)2108S1/500
    Csk polyklonaal konijn antilichaamCell Signalling (WERFEN)49801/500
    PTEN polyklonaal muis antilichaamCell Signalling (WERFEN)95521/500
    Caveoline-1 polyklonaal konijn antilichaamAbcamab29101/1000
    Geit anti-muis IgG-HRP antilichaamQuimigen, Santa Cruz BiotechnologySc-20051/5000
    Geit anti-konijn IgG-HRP antilichaamQuimigen, Santa Cruz BiotechnologySC-20301/5000
    Western Blotting Luminol ReagensSanta Cruz BiotechnologySC-2048
    Src polyklonaal konijn antilichaamCell Signalling (WERFEN)2108S1/500
    Antilichaamoplossing: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% natriumazid
    Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgGInvitrogen, Life Technologies, ThermoFisher ScientificA110291/1000
    Cy2-geconjugeerd streptavidineJackson ImmunoResearch016-220-0891/500
    MicroChemi Luminescentie systeemDNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit met Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Jodide (PI)Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher ScientificV132411/500
    SlowFade Gold antifade reagensLife Technologies, ThermoFisher ScientificS36936
    Thiazolyl Blauw Tetrazoliumboromide (MTT)Sigma-AldrichM2128
    Dimethyl sulfaat voor UV-spectroscopie, >=99.8% (GC)Honeywell41641-1L
    Appliskan 2001Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

    Referenties

    1. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem J. 89, 599-609 (1963).
    2. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).
    3. Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules. J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).
    4. Ramsey, J. D., Flynn, N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).
    5. Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications. Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).
    6. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).
    7. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
    8. Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).
    9. Cuesto, G., et al. Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons. J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).
    10. Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).
    11. Sorgen, P. L., et al. Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1. J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).
    12. Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication. J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).
    13. Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle. Neuroscience. 323, 183-194 (2016).
    14. Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions. Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).
    15. Shinoura, N., et al. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).
    16. Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia. 33, 107-117 (2001).
    17. Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).
    18. Crespin, S., et al. Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights. Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).
    19. Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype. Cell Death & Disease. 5, (2014).
    20. Gonzalez-Sanchez, A., et al. Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes. Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).
    21. Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , In press (2017).
    22. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
    23. Yu, T., et al. In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA. J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).
    24. Herrero-Gonzalez, S., et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells. Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).
    25. Cooper, G. M. The Cell: A Molecular Approach. , 2nd ed, Sinauer Associates. (2000).
    26. Fittipaldi, A., et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).
    27. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).
    28. Hopp, T. P., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).
    29. Benard, V., Bokoch, G. M. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).
    30. Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).
    31. Hu, Q., et al. Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel. Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).
    32. Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. Intrinsically disordered proteins: regulation and disease. Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).
    33. Anthis, N. J., et al. Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation. J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).

    Herprints en machtigingen

    Tags

    Biotine-avidine pull-downcelpenetrerende sequentiesConnexine43 266-283gliomastamcellenNeutrAvidin-agarosewestern blot-analyseconfocale microscopieTAT-connexine43
    Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie
    Neem contact met ons op
    Aanbevelen aan de bibliotheek

    Privacy

    Gebruiksvoorwaarden

    Beleidsoverzicht

    Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.